Activitatea complementului este reglată în glomerulopatia C3 de proteinele de fuziune a factorului H IgG cu și fără domenii de țintire a proprietății

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² și Matthew C. Pickering

„Centrul pentru boli inflamatorii, Imperial College London, Marea Britanie; și²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, SUA

C3 glomerulopatiese caracterizează prin acumularea de complement C3 în glomeruli. Cauzele includ, dar nu se limitează la, anomalii ale factorului H, regulatorul negativ major al căii alternative a complementului. Șoarecii cu deficiență de factor H (Cfh-/-) dezvoltă C3glomerulopatieîmpreună cu o reducere a nivelurilor plasmatice de C3. Folosind acest model, am evaluat eficacitatea a două proteine ​​de fuziune care conțin domeniile de reglare a căii alternative ale factorului H (FH1-5)

legat fie de o imunoglobulină de șoarece care nu vizează (IgG-FH1-5), fie de un anticorp anti-propiedină de șoarece (Anti-P-FH1-5). Ambele proteine ​​au crescut C3 plasmatic și au redus depunerea glomerulară de C3 într-o măsură echivalentă, ceea ce sugerează că nu a fost necesară țintirea adecvată pentru FH1-5 pentru a modifica activarea C3 în plasmă sau glomeruli. După administrarea IgG-FH1-5, nivelurile plasmatice de C3 s-au corelat temporal cu modificările nivelurilor de factor B, în timp ce nivelurile plasmatice de C5 s-au corelat cu modificările nivelurilor plasmatice de properdină. În special, creșterile în plasmă

Nivelurile de C5 și properdin au persistat mai mult decât creșterile C3 și ale factorului B. La șoarecii Cfh-/- IgG-FH1-5 a redus leziunile renale în timpul nefritei nefrotoxice serice accelerate. Astfel, datele noastre demonstrează că IgG-FH1-5 a restabilit activitatea căii alternative circulante și a redus depunerea glomerulară de C3 la șoarecii Cfh-/- și că nivelurile plasmatice de properdină sunt un marker sensibil al activității convertazei C5 în deficiența factorului H. Proteina FH1-5 conjugată cu imunoglobuline, prin timpul său de înjumătățire plasmatică relativ lung, poate fi o terapie potențială pentru C3glomerulopatie.

Cistanche poate ajuta cu Glomerulopatia

Declarație translativă

C3 glomerulopatie(C3G) este o boală de rinichi caracterizată prin acumularea anormală a complementului C3 în glomeruli și leziuni glomerulare. Se datorează activării necontrolate a căii alternative a complementului. Proteinele de fuziune, compuse din domenii funcționale ale regulatorului căii alternative, factorul H (FH), legate de un anticorp, au restabilit reglarea complementului și au redus C3 glomerular într-un model de șoarece C3G. Conjugarea cu anticorpi fără țintire a dus la un timp de înjumătățire plasmatică a proteinei de fuziune comparativ lung și aceasta, sau metode similare de conjugare, ar putea fi utilizate pentru a crește funcția FH în terapia C3G.

C3 glomerulopatie(C3G) este o afecțiune renală mediată de complement, caracterizată prin cantități anormale de C3 în glomeruli.1 Poate evolua spre insuficiență renală și nu are un tratament definitiv.2 C3G este asociat cu activarea anormală a căii alternative a complementului (AP). Activarea AP are ca rezultat producerea de C3bBb (C3 convertaza), o enzimă care scindează C3. După adăugarea unei alte molecule C3b, complexul C3bBbC3b rezultat (convertiza C5) poate scinda complementul C5. Necontrolat

Activarea AP în C3G poate fi asociată cu o reducere a circulației C3, C5, factor B (FB) și properdin. Cauzele activării necontrolate a AP includ pierderea modificărilor funcției în regulatorii complementului și câștigul modificărilor funcției în activatorii complementului.2 Regulatorul negativ cheie AP este factorul H (FH), iar deficiența FH la oameni, porci și șoareci este asociată cu C3G. 3 Factorul nefritic C3, un anticorp care stabilizează convertiza AP C3 este frecvent în C3G.4 Factorul nefritic C3 poate avea ca rezultat o reducere a C3 singur (factor nefritic C3 independent de proprietăți) sau o reducere atât a C3, cât și a C5 (properdin-factor). factor nefritic C3 dependent).5,6

Deși deficiența de properdină nu a ameliorat nivelurile plasmatice de C3, nivelurile de C5 au crescut, sugerând că properdina era necesară pentru activitatea convertazei C5, dar nu a C3.8,9.

Administrarea de șoarece10 sau FH11,12 uman la șoareci Cfh–/– a redus colorarea glomerulară C3 și a crescut nivelurile circulante de C3. Construcțiile care conțin doar domeniile de reglare și țintire ale FH (molecule mini-FH) sunt, de asemenea, eficiente în acest model.13 Alte abordări includ proteine ​​care vizează situsurile de activare a complementului. Acestea includ TT30,14 o proteină care conține domeniile de reglare a complementului FH (FH1-5) legate de domeniile de legare a complementului ale receptorului 2 al complementului și molecule homodimerice de FH,15 molecule mini-FH care conțin domenii de legare a complementului. a proteinei înrudite cu factorul H 1.

Deoarece utilitatea terapeutică a inhibării activării complementului C3 este investigată în C3G,2 este important să înțelegem cinetica depunerii glomerulare de C3 și relația acesteia cu activarea AP atât în ​​glomeruli cât și în circulație. În modelele de glomerulonefrită mediată de complexul imun, C3c glomerular s-a eliminat în 24 de ore de la prevenirea activării complementului, în timp ce C3d glomerular a persistat săptămâni întregi.16 În mod similar, la șoarecii Cfh–/–, FH exogenă are ca rezultat o reducere a colorării glomerulare C3c la 24 de ore. , în timp ce C3d glomerular rămâne neschimbat.11

În acest studiu, am investigat eficacitatea a 2 noi proteine ​​de fuziune cu activitate de reglare a complementului în modelul de șoarece Cfh–/– al C3G. Proteinele au conținut domeniile de reglare ale FH de șoarece (FH1-5), care a fost conjugat cu Ig de șoarece pentru a prelungi timpul de înjumătățire biologică. Una dintre proteinele de fuziune, denumită IgG-FH1-5, a fost conjugată cu un anticorp monoclonal de șoarece care nu vizează. Celălalt, denumit anti-P-FH1-5, a fost conjugat la un anticorp monoclonal la properdina de șoarece. Acest lucru a fost făcut pentru a testa ipoteza că țintirea acestei proteine ​​de fuziune către locurile de activare a complementului, prin interacțiunea cu depunerea de properdină, ar îmbunătăți reglarea complementului tisular. Datele noastre demonstrează că atât proteinele care nu țintesc (IgG-FH1-5), cât și cele care țintesc propriedin (anti-P-FH1-5) au restabilit reglarea plasmatică și glomerulară C3 la șoarecii Cfh–/–. Studiile de timp au arătat că restabilirea nivelurilor de C3 și FB a reflectat nivelurile proteinelor de fuziune din circulație. În schimb, creșterile C5 plasmatice au persistat după ce proteinele de fuziune s-au îndepărtat din circulație. Arătăm că IgG-FH1-5 a ameliorat leziunea glomerulară în timpul nefritei nefrotoxice serice accelerate la șoarecii Cfh–/–.

cistanche poate trata bolile de rinichi imbunatatesc functia renala

REZULTATE

Generarea de proteine ​​de fuziune și evaluarea in vitro și in vivo a activității Proteinele de fuziune au fost create prin legarea primelor 5 domenii de repetare scurtă de consens (SCR) ale FH de șoarece (FH1-5) fie la un anticorp anti-propedină de șoarece (anti -P-FH1-5) sau un anticorp cu un domeniu Ig care nu vizează (IgG-FH1- 5, Figura suplimentară S1). Activitatea proteinelor a fost evaluată folosind un test hemolitic specific AP (Figura 1a). Anti-P-FH1-5 și IgG-FH1-5 au inhibat hemoliza într-o manieră dependentă de doză, cu o potență mai mare pentru anti-P-FH1-5. De asemenea, antiproperdina (anti-P) a redus hemoliza într-o manieră dependentă de doză, dar controlul IgG nu a avut niciun efect. După injecțiile echimolare ale proteinelor la șoarecii Cfh–/–, proteina IgG-FH1-5 a fost detectabilă până la 11 zile după injectare, în timp ce anti-P-FH1-5 a fost detectabilă până la 4 zile după injecție (Figura suplimentară S2). Pentru a determina dacă IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5 ar putea restabili reglarea AP plasmatică la șoarecii Cfh–/–, am măsurat mai întâi nivelurile plasmatice de C3 după injectarea proteinelor de fuziune (Figura 1b) . Administrarea fie de IgG-FH1-5, fie de anti-P-FH1-5 a crescut semnificativ C3 plasmatic la 24 de ore și, într-o măsură mai mică, la 96 de ore după injectare (Figura 1b). Aceste date au demonstrat că atât IgG-FH1-5, cât și anti-P-FH{1-5 ar putea restabili temporar reglarea AP plasmatică la șoarecii Cfh–/–. Apoi am efectuat o analiză detaliată a acestor modificări prin caracterizarea evoluției în timp a modificărilor nu numai în plasma C3, ci și în plasma C5 și proteinele căii alternative FB și properdin. Creșterile circulante ale nivelurilor de C5 și properdin persistă mai mult decât creșterile C3 și FB după administrarea de IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5 la șoarecii Cfh–/–

Am comparat cinetica modificărilor în C3, C5, FB și properdin prin măsurarea proteinelor la intervale de până la 27 de zile după o singură injecție fie de IgG-FH1-5, fie de anti-P-FH1-5 ( Figura 2). După administrarea de IgG-FH1-5, creșterea maximă a C3, C5, FB și properdină a avut loc în ziua 1 după injectare. Timpul pentru ca aceste modificări să scadă la nivelurile pre-tratament a fost diferit. Revenirea la nivelurile de pretratament a avut loc între zilele 1 și 4 pentru FB, între zilele 7 și 11 pentru C3 și între zilele 14 și 21 atât pentru properdin, cât și pentru C5 (Figura 2a, c, e și g). După administrarea de anti-P-FH1-5, nivelurile de vârf C3 au apărut în ziua 1, dar au scăzut la nivelurile de pretratament între zilele 4 și 7 (Figura 2b). Nivelurile de vârf C5 au avut loc în ziua 4 și au revenit la nivelurile de pretratament între zilele 7 și 11 (Figura 2d). Creșterea maximă a FB a avut loc în ziua 1 și a scăzut la nivelurile de pretratament între zilele 1 și 4 (Figura 2f). După cum era de așteptat, properdinul liber din plasmă a fost epuizat după injectarea fie de anti-P-FH1-5, fie de anti-P (Figura 2h). Nivelurile de properdin în plasmă liberă au rămas scăzute până la 7 zile după anti-P-FH1-5 și până la 14 zile după anti-P (Figura 2h). Deși ambele proteine ​​de fuziune au restabilit temporar reglarea AP plasmatică, durata îmbunătățirii nivelurilor C3, FB și C5 a reflectat durata detectării lor în plasmă, care a fost mai scurtă pentru anti-P-FH 1-5 (Figura suplimentară S2) . În rezumat, modificările nivelurilor de C3 și FB după injectarea oricărei proteine ​​au fost mai scurte decât cele ale C5 și properdinei. Aceste date sugerează că FB plasmatic este un marker sensibil al activității convertazei C3 în acest context, în timp ce properdina este un marker al activității convertazei C5. În special, după injectarea anti-P, a existat o creștere a C5 la 24 și 96 de ore și în ziua 7

Figura 1| (a) Complementează testul de hemoliză dependent de calea alternativă. Anticorpii au fost titrați în diluții de 2-ori de la 60 nM până la 0,5 nM. Reactivii IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 și anti-P au redus hemoliza eritrocitelor de iepure într-o manieră dependentă de doză. Nu a fost utilizată nicio inhibare a proteinei de control IgG. Barele orizontale indică valori medii, iar barele de eroare reprezintă SD. (b) Complementul plasmatic C3 la șoarecii Cfh–/– după injectarea proteinelor de fuziune. C3 plasmatic a fost măsurat înainte și la 24 de ore și 96 de ore după administrarea de IgG-FH1-5 (triunghiuri roșii, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (triunghiuri violete, n ¼ 6), Anti -P (puncte verzi, n ¼ 5) și IgG-control (puncte albastre, n ¼ 5). Barele orizontale indică valori medii, iar mustățile indică SD. ***P # 0,001 față de valoarea pretratării și derivat din 2-mod ANOVA cu testul de comparații multiple Bonferroni. FH, factor H; P, properdin.

(Figura 2d). După cum s-a raportat, 8,9 indică faptul că convertaza C5 este dependentă de properdină la șoarecii Cfh–/–.

IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5 au redus C3c glomerular, dar nu au modificat colorarea C3d la șoarecii Cfh–/–

Apoi am evaluat influența IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5 asupra glomerulare C3b/iC3b/C3c, C3d, properdină și proteinele legate de FH (FHR). La 96 de ore după injectarea IgG-FH1-5, colorația glomerulară C3b/iC3b/C3c a fost redusă, dar colorația glomerulară C3d (Figura 3a) și FHR (Figura 3b) nu a fost. Glomerul C3b/iC3b/C3c a rămas neschimbat fie cu control IgG, fie cu anti-P. Modelul liniar anormal al colorării cu properdină glomerulară la șoarecii Cfh–/– netrați9 a rămas la 96 de ore după controlul IgG. La șoarecii Cfh–/– injectați fie cu anti-P, fie cu IgG-FH1-5, nivelul de properdin glomerular a fost aproape nedetectabil la 96 de ore (Figura 3b). În mod neașteptat, injecția anti-P-FH1-5 a dus la un model de colorare glomerulară granulară folosind anticorpi anti-properdin, anti-FH/FHR și anti-IgG (Figura 3b). Această descoperire a sugerat că proteina anti-P-FH1-5 a fost depusă în glomeruli. Injectarea proteinei anti-P-FH1-5 la șoarecii de tip sălbatic a dus la colorarea glomerulară cu anticorpi anti-properdin, anti-FH/FHR și anti-IgG la 96 de ore (Figura suplimentară S3), indicând faptul că acest lucru reactivul interacționează cu glomeruli normali. Cu toate acestea, am speculat că proteina anti-P-FH1-5 ar putea interacționa și cu properdina glomerulară preexistentă la șoarecii Cfh–/–. Când am injectat reactivul în șoareci Cfh–/– care fuseseră pretratați cu anti-P pentru a elimina properdina glomerulară, a existat o reducere a modelelor de colorare granulară folosind anticorpi anti-properdin, anti-FH/FHR și anti-IgG ( Figura suplimentară S4). Aceste observații indică faptul că interacțiunea glomerulară a proteinei anti-P-FH1-5 la șoarecii Cfh–/– depinde parțial de properdina glomerulară.

IgG-FH1-5 a ameliorat leziunea renală în timpul nefritei nefrotoxice serice accelerate la șoarecii Cfh–/–

La pacienții cu C3G, leziunea renală acută se poate dezvolta în contextul infecțiilor intercurente. De exemplu, pierderea funcției renale în nefropatia FHR5 este asociată cu episoade de hematurie macroscopică sinfaringitică.17 Dereglarea C3 subiacentă la pacienții C3G are ca rezultat probabil o leziune renală mediată de complement îmbunătățită după un declanșator care are ca rezultat inflamația renală. Pentru a modela acest lucru, am indus nefrită nefrotoxică serică accelerată, un complex imunitar

Figura 2| Cursul de timp al profilului complementului plasmatic la șoarecii Cfh–/– injectați cu IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) și properdin (P; g,h) de la începutul experimentului până la 27 de zile după o singură injecție de IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; triunghiuri roșii, n ¼ 5) sau anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; triunghiuri violete, n ¼ 6). Martorii au inclus anti-P (puncte verzi, n ¼ 5) și un anticorp monoclonal cu izotip (control IgG; puncte albastre, n ¼ 5). Barele orizontale indică valori medii, iar mustățile indică SD. *P # 0.{05, **P # 0,01, ***P # 0,001 față de valoarea pretratamentului și derivat din 2-modul de analiză a varianței cu testul de comparații multiple Bonferroni. FB, factor B; FH, factorul H.

Model de glomerulonefrită care implică complement și căi mediate de receptorul Fc,18,19 la șoarecii Cfh–/–. Am arătat anterior că șoarecii Cfh–/– sunt hipersensibili la leziuni renale în acest cadru7 și am emis ipoteza că proteina FH1-5, prin îmbunătățirea reglării AP, ar putea ameliora leziunea renală mediată de complement în acest model. Deoarece datele noastre au indicat că proteina anti-P-FH1-5 a fost depusă în glomeruli normali, am folosit IgG-FH1-5 în timpul nefritei nefrotoxice serice accelerate. Cu douăzeci și patru de ore înainte de injectarea cu ser nefrotoxic de oaie, șoarecii au primit o injecție ip fie cu IgG-control (n=7) fie cu IgG-FH1-5 (n=8). Protocolul experimental este prezentat în Figura 4a. Șoarecii au fost sacrificați la 6 zile după administrarea de ser nefrotoxic de oaie. Toate cele 3 măsuri histologice ale patologiei glomerulare (scor de severitate, numărul total de celule și numărul de macrofage) au fost semnificativ mai mici în grupul IgG-FH1-5 (Figura 4b). Leziunea tubulointerstițială a fost, de asemenea, mai mică în grupul IgG-FH1-5 (Figura 4b). Ureea serică a fost semnificativ crescută în

Figura 3| Imunocolorarea complementului glomerular la șoarecii Cfh–/– la 96 de ore după injectarea fie de IgG-FH1-5, fie de anti-P-FH1-5. (a) Imagini reprezentative împreună cu cuantificarea glomerulare C3b/iC3b/C3c și C3d în cele 4 grupuri experimentale: IgG-FH1-5 (triunghiuri roșii, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (triunghiuri violete, n ¼ 6), anti-P (puncte verzi, n ¼ 5) și control IgG (puncte albastre, n ¼ 5). (b) Punctele de date reprezintă valori medii, iar mustățile denotă un interval interquartil. Valorile P derivate din testul Kruskal-Wallis cu testul de comparații multiple Dunn. (b) Imagini reprezentative ale IgG glomerulare, FHR și colorații în cele 4 grupuri experimentale. Bară ¼ 100 mm.AFU, unități fluorescente arbitrare; FH, factor H; P, properdin. Pentru a optimiza vizualizarea acestei imagini, vă rugăm să vedeți versiunea online a acestui articol lawww.kidney-international.org.

grupul de control IgG, dar modificările albuminei serice și raportul albumină-creatinină din urină nu au fost diferite (Figura 4b). După cum era de așteptat, C3b/iC3b/C3c glomerular a fost redus semnificativ în grupul IgG-FH1-5 (Figura 4b), dar IgG glomerulară de șoarece (Figura 4b) și IgG de oaie (datele nu sunt prezentate) nu au diferit între grupuri. .

Figura 4| Pretratamentul cu IgG-FH1-5 a ameliorat leziunea renală în timpul nefritei nefrotoxice serice accelerate la șoarecii Cfh–/–. (a) Schema protocolului de nefrită nefrotoxică serică accelerată. Șoarecii pre-imunizați cu IgG de oaie au primit fie IgG-FH1-5 (grupul de tratament, n ¼ 8) fie IgG-martor (grupul de control, n ¼ 7) cu 24 de ore înainte de administrarea serului nefrotoxic de oaie. (b) Funcția renală și histologie la 6 zile după inducerea nefritei nefrotoxice serice accelerate la șoarecii tratați fie cu IgG-FH1-5 (tratament; triunghiuri roșii, n ¼ 8) sau control IgG (control; cercuri albastre, n ¼ 7). Barele orizontale indică valori medii, iar mustățile denotă un interval intercuartil. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 față de control și derivat din testul Mann-Whitney. FH, factor H; P, properdin.

DISCUŢIE

Atât IgG-FH1-5 cât și anti-P-FH1-5 au normalizat nivelurile C3, FB și C5 la șoarecii Cfh–/–. Această constatare este în concordanță cu faptul că domeniile de reglare a complementului FH de șoarece sunt situate în domeniile SCR 1 până la 5 (un situs de legare a C3b și activitatea cofactorului pentru scindarea C3b mediată de factorul I).20 Domeniile de recunoaștere a suprafeței, care influențează legarea de heparină și celulele endoteliale și includ un al doilea situs de legare a C3b, sunt prezente în domeniile SCR 18 până la

20 (FH18-20) și, prin urmare, nu sunt prezente în proteinele de fuziune.20 Cu toate acestea, ambele proteine ​​au redus iC3b/C3b/C3c glomerular, indicând faptul că FH18-20 nu a fost necesar în acest context. Această constatare este în concordanță cu datele anterioare care arată că șoarecii Cfh–/– care exprimă o proteină FH mutantă constând din domeniile SCR 1 până la 15 (Cfh–/– .FHD16-20) nu au dezvoltat depunere glomerulară anormală de C3.21,22. Cu toate acestea, animalele Cfh–/–.FH D16-20 nu au fost capabile să regleze activarea C3 de-a lungul endoteliului renal și au dezvoltat microangiopatie trombotică. Este posibil ca, din cauza lipsei de suprafață care vizează domeniile FH18-20, administrarea de proteine ​​de fuziune care conțin FH1-5 în deficiența FH ar putea duce la susceptibilitatea la microangiopatia trombotică. De asemenea, este posibil ca aviditatea crescută pentru legarea C3b, sub structura dimerică a proteinelor de fuziune, să fie suficientă pentru a compensa absența domeniilor FH18-20 care vizează suprafața. Cu toate acestea, recunoașterea suprafeței C3b este, de asemenea, influențată de modificările conformaționale ale FH.23 O proteină de legare a Streptococcus pneumoniae FH (PspCN, care leagă domeniul SCR 9), declanșează o modificare conformațională a FH, iar complexul FH-PspCN a crescut legarea C3b și activitate sporită de accelerare a dezintegrarii. Locul de legare a FH20 C3d nu este expus în FH, ci devine expus în complexul FH-PspCN. Acest lucru ar putea explica de ce FH19-20 interacționează cu suprafața C3d, dar FH nu.24,25 Speculăm că agenții noștri, prin modificări conformaționale, pot interacționa eficient atât cu faza fluidă, cât și cu suprafața C3b. În special, atât IgG-FH1-5, cât și anti-P-FH1-5 au protejat eritrocitele de liză într-un test de hemoliză dependent de AP.

Niciuna dintre proteinele de fuziune nu a redus colorarea glomerulară C3d, poate din cauza naturii persistente a C3d glomerulară. În nefrita complexă imună experimentală, C3c glomerular s-a rezolvat în 24 de ore de la încetarea activării complementului, dar C3d a persistat săptămâni întregi. Injecțiile repetate de FH uman la șoarecii Cfh–/– au arătat o reducere a C3d glomerulară în decurs de 10 zile.11 Este probabil ca dozarea repetată de IgG-FH1-5 ar putea reduce C3d glomerulară în acest model. De asemenea, nu a existat nicio modificare a colorării glomerulare FHR. Se cunosc puține lucruri despre funcțiile proteinelor FHR de șoarece, dar ele pot interacționa atât cu C3b27,28, cât și cu C3d.27 De fapt, afinitatea aparentă a FHR-A și FHR-B pentru C3d este mai puternică decât cea a FH.27 Noi speculăm că proteinele glomerulare FHR sunt susceptibile de a se elimina din glomeruli numai atunci când C3d a fost îndepărtat. În acest context, este de remarcat faptul că în C3G uman, proteina 5 legată de factorul H se asociază cu C3d glomerular.29

Proteina anti-P-FH1-5 a epuizat nivelurile plasmatice libere de properdină așa cum era de așteptat, deoarece partea antiproperdină a acestei proteine ​​de fuziune poate bloca activitatea AP (datorită epuizării properdinei) timp de 8 zile după o singură injecție.30 Cu toate acestea, datele noastre au arătat că eficacitatea FH1-5 în creșterea nivelurilor plasmatice de C3 și reducerea colorării glomerulare C3b/iC3b/C3c a fost comparabilă între cele 2 proteine ​​de fuziune (adică, a fost independentă de țintirea properdinei). Mai mult, colorarea glomerulară anormală cu properdină a fost redusă semnificativ după administrarea fie de anti-P, fie de IgG-FH1-5. Evident, spre deosebire de proteinele C3d și FHR, properdina glomerulară este ușor eliminată după restabilirea reglării C3. Properdina glomerulară s-a schimbat după administrarea proteinei anti-P-FH1-5, dar acest lucru a fost complicat de observația că am detectat depunerea acestei proteine ​​de fuziune atât în ​​glomeruli Cfh–/– cât și în cel sălbatic. Acest lucru s-a datorat parțial unei interacțiuni cu properdina glomerulară, dar depunerea în glomeruli de tip sălbatic a indicat că era, de asemenea, parțial complet dependentă de complementul glomerular și probabil legată de proprietățile fizico-chimice ale proteinei de fuziune.

Datele noastre cinetice au demonstrat descoperiri noi cu privire la modificările temporale ale FB, C5 și properdină care însoțesc creșterile C3 la șoarecii Cfh–/– după injectarea proteinelor de fuziune. Nivelurile FB au crescut rapid după injectare

și a revenit la nivelurile inițiale într-un moment în care atât C5 cât și nivelurile de properdin au rămas crescute. Nivelurile de propdină la șoarecii Cfh–/– au fost reduse la momentul inițial și au crescut la niveluri normale (20 mg/ml30) după injectarea de IgG-FH1-5 și au rămas la aceste niveluri timp de cel puțin 14 zile. Un curs similar de timp a fost observat pentru creșterea nivelurilor plasmatice de C5. În mod surprinzător, IgG-FH1-5 a fost în mare parte absentă din circulație la 11 zile, ceea ce indică faptul că formarea convertazei C5 la șoarecii Cfh–/– este mai lentă decât cea a convertazei C3 (deoarece nivelurile C3 au revenit la valoarea inițială între 7 și 11 zile). Plasma C5 a crescut după tratamentul anti-P și a crescut în continuare cu proteina anti-P-FH1-5. Prin urmare, atât țintirea properdinei, cât și efectele FH1-5 au contribuit la creșterea nivelurilor C5 și indică faptul că convertaza C5 este parțial dependentă de properdină la șoarecii Cfh–/–. Această constatare este în concordanță cu ameliorarea dereglării C5 la șoareci cu deficiență combinată de FH și properdină.8,9 Nivelurile circulante de properdină pot fi reduse în C3G și par să se coreleze cu activitatea convertazei C5 de suprafață, spre deosebire de C5 plasmatic sau C5b solubil. {30}}.31,32 Datele noastre susțin o legătură strânsă între nivelurile de properdină și activitatea convertazei C5 și susțin utilizarea nivelurilor de properdină ca biomarker al activării glomerulare în curs de desfășurare a C5.

În special, proteina IgG-FH1-5 a fost încă detectabilă în circulație până la 11 zile după o singură injecție. Aceasta este mult mai lungă decât ceea ce am raportat anterior pentru proteina neconjugată FH1-5 de șoarece, care a fost eliminată din circulație în 24 de ore.14 Această constatare indică faptul că timpul de înjumătățire plasmatică mai lung al IgG-FH{ proteina {9}} este derivată din conjugarea anticorpilor. Timpul de înjumătățire plasmatică al proteinei IgG-FH1-5 a fost, de asemenea, mai lung decât ceea ce am observat anterior pentru FH de lungime completă.10,11 De exemplu, FH umană a fost eliminată din circulație la 96 de ore după o singură injecție. la șoarecii Cfh–/–.11 În combinație cu datele noastre care demonstrează eficacitatea proteinei IgG-FH1-5 în reglarea complementului, considerăm că conjugarea proteinei FH{1-5 pentru a prelungi profilul său farmacocinetic are potențiale terapeutice. utilitate în C3G.

În rezumat, arătăm că, în ciuda lipsei domeniilor de recunoaștere a suprafeței, proteinele de fuziune FH1-5 au fost eficiente în reducerea activării glomerulare C3 și restabilirea reglării complementului plasmatic în deficiența FH. Nu a existat niciun avantaj evident în conjugarea domeniilor FH1-5 cu antiproperdină, iar proteina IgG-FH{1-5 a redus leziunea renală în nefrita experimentală. Spre deosebire de provocările legate de producerea de preparate la scară largă de FH pentru uz terapeutic, producția pe scară largă de terapii pe bază de anticorpi este bine stabilită, ceea ce face ca IgG-FH1-5 să fie un potențial terapeutic atractiv pentru C3G.

METODE

Proteine ​​de fuziune

IgG-FH1-5. Primele 5 domenii FH SCR de mouse (mFH1-5) conectate

la o Ig de șoarece IgG1 care nu vizează (un anticorp anti-idiotipic crescut împotriva unui anticorp monoclonal de șoarece).

Anti-P-FH1-5. Murine FH1-5 legat de anticorpul anti-properdină de șoarece (anti-P),30 furnizat lui Alexion de W. Song, Universitatea din Pennsylvania).

Controale. Controalele au fost Ig de șoarece care nu vizează izotip (control IgG) și anti-properdin de șoarece (anti-P) (Figura suplimentară S1). Proteinele au fost generate folosind vectori pVEK și celule Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purificate folosind proteina A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Test hemolitic specific AP

Ser normal de șoarece 20% titrat de la 60 nM la 0,5 nM a fost incubat cu eritrocite de iepure (1,5 106 celule/ml) la 37 C timp de 30 de minute. Eliberarea hemului a fost cuantificată spectrofotometric (densitate optică 415 nm); Liza 100% a fost ser fără inhibitor.

Plasma FB și FH

Plasma a fost obținută după centrifugarea sângelui colectat în tuburi care conțineau acid etilendiamin tetraacetic (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Germania). Proteinele au fost măsurate prin imunotest de electroforeză capilară (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Anticorpii utilizați au fost anticorpi policlonali anti-șoarece FH (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) și anticorpi anti-șoarece FB (Abcam, Cambridge, Marea Britanie); A fost utilizat modulul de detectare anti-iepure WES (ProteinSimple, San Jose, CA). Semnalele chemiluminescente au fost analizate cu software-ul Compass for SW (ProteinSimple, versiunea 5.0.1), cuantificate ca zone de vârf și normalizate la controlul testului.

Șoareci

Toți șoarecii au fost găzduiți în condiții specifice fără agenți patogeni; procedurile au fost efectuate conform ghidurilor instituționale și aprobate de Biroul de Interne al Regatului Unit. Șoarecii de tip sălbatic C57BL/6 au fost achiziționați de la Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), iar șoarecii Cfh–/– au fost generați așa cum s-a descris anterior.7 Șoarecii au fost potriviți pentru vârstă și sex; Doze echimolare de proteine ​​au fost administrate prin injecție ip (1 mg pentru anti-properdină și control IgG; 1,4 mg pentru IgG-FH1-5 și anti-P-FH1-5). Nefrita nefrotoxică serică accelerată a fost indusă prin injectarea iv de ser nefrotoxic de oaie la șoareci pre-imunizați cu IgG de oaie.7 Administrarea proteinelor de fuziune a fost efectuată cu 24 de ore înainte de inducerea serului nefrotoxic de oaie (Figura 4a).

C3, C5 și propriedină liberă. Plasma C3 au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime.14 Nivelurile de properdin „liber” și C5 din plasmă au fost măsurate utilizând teste imunologice de electrochimiluminiscență (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) cu anti - properdin sau un C5 anti-murin personalizat acoperit pe plăci MSD cu legare ridicată. Properdina „liberă” legată și C5 au fost detectate cu anti-properdin (de la W. Song) sau anti-C5 monoclonal biotinilat (Alexion) combinat cu streptavidină-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Semnalul chemiluminiscent a fost achizitionat cu ajutorul unui imager SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) si a fost analizat cu software-ul MSD Discovery Workbench (Meso Scale).

Diagnosticare, versiunea 4.0.12.1). Propedinul murin recombinant și C5 au fost utilizate ca standarde.

Funcția renală și histologie

Hematuria și proteinuria au fost evaluate folosind Hema-Combistix (Bayer, Reading, Marea Britanie); ureea plasmatică a fost măsurată și țesutul renal a fost procesat așa cum s-a descris anterior.9 Creatinina urinară a fost determinată pe probe de urină spot utilizând testul Creatinine Companion Protocol (#1012; Excell, Philadelphia, PA) și urina spot/ Albumina plasmatică a fost măsurată prin test imunosorbent legat de enzime (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Secțiunile renale colorate cu acid periodic-Schiff au fost evaluate în mod orb și clasificate în funcție de severitatea leziunii glomerulare și tubulointerstițiale (0 [niciuna], 1 [ușoară], 2 [moderată]). Au fost evaluați zece glomeruli pe secțiune pentru a determina numărul mediu de celule glomerulare. Colorarea prin imunofluorescență a fost efectuată pe criosecțiuni de 5-mm montate folosind mediu Vectashield cu DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Anticorpii utilizați au fost C3b/C3c/iC3b de capră policlonală conjugată cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; IgG anti-şoarece de capră policlonală conjugată cu FITC specifică lanţului de smochine (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG monoclonal de șoarece anti-capră/oaie conjugat cu FITC (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); sau propriedină anti-umană de capră conjugată cu FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immu- no logic Laboratories, Copenhaga, Danemarca).9 C3d anti-șoarece de capră biotinilată (1:10; # BAF2655; Sisteme de cercetare și dezvoltare , Minneapolis, MN) a fost utilizat pe secțiuni blocate cu biotină (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA), cu anticorp secundar streptavidin AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH a fost vizualizat în secțiuni purificate anti-șoarece CD16/CD32-blocate (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) utilizând FH anti-uman de capră (1:1000; #A312; Quidel, San Diego). , CA) și anticorp secundar monoclonal anti-IgG-FITC de capră (1:100; clona GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Macrofagele glomerulare au fost identificate utilizând CD68 anti-șoarece de șobolan conjugat cu FITC (clona FA{-11 GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Analiza cantitativă de imunofluorescență a fost efectuată folosind un microscop optic Leica DM4B cuplat cu o cameră digitală Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) și software-ul Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versiunea 7). Zece glomeruli au fost examinați pe secțiune, iar intensitatea medie a fost exprimată în unități arbitrare din știința fluorescentei.

analize statistice

GraphPad Prism, versiunea 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) a fost folosit pentru analiza statistică. Analiza varianței cu măsuri repetate 2-modale cu testul de comparații multiple Bonferroni (factorii au fost timpul și tratamentul) a fost utilizată pentru analiza timp-curs. Testul de comparații multiple Kruskal-Wallis cu Dunn a fost utilizat la compararea mai multor grupuri, iar testul Mann-Whitney a fost utilizat pentru 2 grupuri.

DEZVĂLUIRE

MCP a primit taxe de consultanță de la Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope și Achillion Pharmaceuticals. HTC a primit taxe de consultanță de la Alexion, Novartis, Aurinia și Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ și SK-K sunt angajați ai Alexion Pharmaceuticals. SK este un fost angajat al Alexion Pharmaceuticals și este în prezent angajat al Gemini Pharmaceuticals. Toți ceilalți autori au declarat că nu există interese concurente.

MULȚUMIRI

MCP este un membru senior al Wellcome Trust în științe clinice (referința grantului 212252/Z/18/Z), iar ACG și DPL sunt susținute de această bursă. YZ, SK, YW, KKJ și SK-K au fost finanțate de Alexion Pharmaceuticals.

MATERIAL SUPLIMENTAR

Fișier suplimentar (PDF)

Figura S1. Proteinele de fuziune utilizate în acest studiu. Anti-P-FH1-5 constă din mFH1-5 legat de un anticorp neutralizant anti-propiedină de șoarece (anti-P; vezi Miwa și colab.30). Proteinele de control au inclus un Ig de șoarece care nu vizează izotip (control IgG) și anticorpul neutralizant de șoarece anti-propiedină de șoarece (Anti-P). Figura S2. Analiza WES blot pentru a detecta FH1-5 în probe de plasmă de la șoareci cu deficiență de FH injectați fie cu (A) IgG-FH1-5, fie cu (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH{1-5) este detectabil până la 11 zile după injectarea IgG-FH1-5 și până la 4 zile după injectarea proteinei anti-P-FH{1-5 (cutii roșii Controalele au inclus plasmă de la șoareci de tip sălbatic la care este detectată proteina factor H de lungime completă (FH, cutii negre, banda C1) și șoareci neinjectați cu deficit de FH, unde nu este evidentă nicio FH (cutii negre, banda C2). După cum era de așteptat, nici FHnorFH1-5 nu este detectabil în probele de plasmă de la șoareci injectați cu Anti-P sau control IgG.

Figura S3. Imunocolorarea complementului glomerular la 96 de ore după injectarea de control IgG sau anti-P-FH1-5 la șoarecii de tip sălbatic. Sunt prezentate imagini glomerulare reprezentative (bară ¼ 100 mm).

Figura S4. Rolul properdinei asupra depunerii de anti-P-FH1-5 în glomerulii șoarecilor cu deficiență de FH. Șoarecii Cfh–/– au fost injectați fie cu control IgG, fie cu anti-P (tratamentul 1), urmat 24-ore mai târziu de control cu ​​IgG sau cu anti-P-FH1-5 (tratamentul 2). Animalele au fost sacrificate la 120 de ore după primul tratament și a fost evaluată colorarea glomerulară pentru IgG, properdină și FH/FHR. Sunt afișate imagini reprezentative. Injecția cu anti-P a redus semnificativ colorarea cu properdină (rândul 1, coloana 2), dar nu FH/FHR (rămâne neschimbată) sau IgG (rămâne absentă). Administrarea de anti-P-FH1-5 24-ore după controlul IgG a dus la apariția colorării granulare cu anticorpi anti-IgG, anti-FH/FHR și anti-P, așa cum se observă după injectarea anti-P-FH 1-5 singur (vezi Figura 3b). Această colorare granulară a fost redusă atunci când injecția anti-P-FH1-5 a fost precedată de injecția anti-P, care epuizează atât circulația (a se vedea figura 1h) cât și cea glomerulară (a se vedea figura 3b). Colorația glomerulară cu anti-IgG a fost evidentă numai la șoarecii cărora li s-a injectat anti-P-FH1-5 (rândul 3, coloanele 3 și 4) și a fost semnificativ mai scăzută la șoarecii care au primit anti-P-FH1-5 precedat de anti-P. Am ajuns la concluzia că depunerea de anti-P-FH1-5 în glomerulii șoarecilor Cfh–/– a fost parțial dependentă de properdină. Barele orizontale indică valorile mediane, iar mustățile denotă intervalul intercuartil. Valoarea P a fost derivată din testul Mann-Whitney. Bară ¼ 100 mm.

REFERINȚE

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al C glomerulopathy∶ anew dassification. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy—înțelegerea bolii reale rare determinate de complement. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Serii de mini-revizuiri translaționale despre factorul complement H: boli renale asociate cu factorul complement H noi perspective de la oameni și animale. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, factorul C3necritic （C3NeF）∶stabilizarea fazei fluide și convertaza căii alternative legate de celule. J Immunol 1976;116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, efectul și colab al unui factor nefritic asupra C3 și asupra căii terminale a complementului in vivo și in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. Factorul nefritic G3 (C3NeF): disocierea legată de celule și stabilizarea fazei fluide a convertazei C3 a căii alternative. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al. Activarea necontrolată a C3 provoacă glomerulonefrită membranoproliferativă la șoareci cu deficit de factor de complement H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et al. Combinația dintre mutația factorului H și deficitul de properdin provoacă glomerulonefrită C3 severă. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et al. Pierderea properdinei exacerbează glomerulopatia C3 rezultată din deficiența factorului H. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. Factorul H facilitează eliminarea iC3b legat de GBM prin controlul activării C3 în faza fluidă. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al Tratamentul cu factorul H de complement uman inversează rapid depunerea de complement renal la șoarecii cu deficiență de factor H. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll și colab. Factorul uman H optimizat pentru glicozilare produs de Moss pentru aplicare terapeutică în tulburările complementului. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y și colab. O moleculă extinsă a factorului H mini-complement ameliorează glomerulopatia C3 experimentală. Rinichi Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA și colab. Eficacitatea inhibării complementului vizat în glomerulopatia C3 experimentală. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, și colab. Un construct al factorului complement H conceput pentru tratamentul glomerulopatiei C3. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et al C3clocalizarea glomerulară indică formarea continuă a depozitelor imune și activarea complementului în glomerulonefrita experimentală. Sunt J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, și colab. Glomerulopatia familială C3 asociată cu mutațiile CFHRS, caracteristicile clinice ale 91 de pacienți din 16 pedigree. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, și colab. Patologia și protecția în nefrita nefrotoxică este determinată de angajarea selectivă a receptorilor Fc specifici. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, et al. Protecție împotriva membranei bazale anti-glomerulare (nefrita mediată de GBM la șoarecii cu deficit de C3-și C{4-. C Exp Immunol. 1997;110:403-409).

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H și colab. Comparație între recunoașterea suprafeței și proprietățile de legare C3b ale factorului complementului uman și de șoarece H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp icre EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al. Dezvoltarea sindromului hemolitic uremic tipic depinde de complement C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al Sindromul hemolitic uremic spontan declanșat de factorul complement H lipsit de domenii de recunoaștere a suprafeței. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 Herbert AP. Mike E, Chen ZAet al. Evaziunea complementului mediată de îmbunătățirea factorului H capturat: implicații pentru protecția suprafețelor de sine față de complement.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al Dimerizarea proteinelor legate de factorul complement H modulează activarea complementului în cu. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, și colab. Ingineria rațională a unui inhibitor imunitar minimizat cu proprietăți unice de triplu-țintire. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et al. Complexul de atac al membranei glomerulare nu este un marker de încredere al activării C5 în curs de desfășurare în nefrita lupică. Rinichi Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F și colab. Modularea căii alternative a complementului prin proteinele înrudite cu factorul H murin. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. Proteina înrudită cu factorul H murin FHR-B promovează activarea complementului. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ și colab. Proteina 5 legată de factorul complement glomerular H (FHR5) este foarte răspândită în glomerulopatia C3 și asociată cu insuficiență renalăKdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D și colab. Blocarea propriedinului, a căii alternative și a receptorilor de anafilatoxină ameliorează leziunile renale de ischemie-reperfuzie la șoarecii cu factor de accelerare a cariilor și CD59 dublu knockout. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P și colab. Consumul de properdin seric ca biomarker al dereglării convertazei C5 în glomerulopatia C3. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, și colab. Combinația dintre mutația factorului H și deficitul de properdin provoacă glomerulonefrită C3 severă.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. Zhang Y, Nester OM Martin B. et al Definirea profilului de biomarker al complementului glomerulopatiei C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.