Izolarea ghidată de dereplicare a noilor diglicozide substituite cu fenilpropanoid din salsa Cistanche și activitatea lor inhibitoare asupra producției de NO în macrofage

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai mult

Abstract:

Dereplicarea permite identificarea rapidă a compușilor cunoscuți și necunoscuți din extractele de plante. În acest studiu, am efectuat dereplicarea pe bază de cromatografie lichidă-spectroscopie de masă (LC-MS), folosind date din ESI plus QTOF-MS pentru analizaglicozide substituite cu fenilpropanoid, constituenții activi majori ai salsa Cistanche (CA Mey.) Beck. Folosind numai TOF-MS, substructurile acestor compuși ar putea fi confirmate fără ambiguitate pe baza modelelor de fragmentare caracteristice ale diferitelor producții. Profilarea bazată pe HPLC-MS a C. salsa a permis, de asemenea, detectarea de noifenilpropanoid-substituitglicozide dinaceastă plantă. Dintre acestea, cinci noi substituite cu fenilpropanoiddiglicozide, denumite cistansalsides A–E (5, 6, 12, 17 și 18), au fost izolate. Structurile lor au fost elucidate prin metode spectroscopice, inclusiv analiza RMN și MS. Toate izolatele au fost testate pentru activitatea lor inhibitoare împotriva producției de NO în celulele RAW 264.7 stimulate de LPS. Dintre compușii testați, compușii 5, 11, 13 și 18 au prezentat activitate inhibitorie moderată asupra NO sintazei inductibile. Compușii 11, 13 și 18 au inhibat, de asemenea, fosforilarea NF-kB în macrofage. Niciunul dintre compuși nu a prezentat semnificativcitotoxicitate. 

Cuvinte cheie:dereplicarea; diglicozide substituite cu fenilpropanoid; salsa Cistanche; antiinflamator

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck, aparținând familiei Orobanchaceae, este o plantă parazită care își obține hrana din rădăcina Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) și a altor plante de deșert [1]. Această plantă a fost folosită în medicina tradițională pentru tratamentul nevrasteniei, disfuncției sexuale și deficienței renale [2,3]. În studiile fitochimice anterioare, s-a raportat că întreaga plantă de C. salsa conținea diferite tipuri de compuși, inclusiv glicozide feniletanoide și glicozide iridoide [4–7]. Glicozidele feniletanoide, cum ar fi actozidul și echinacozidul, sunt constituenții activi majori ai plantei [8]. Extractele de C. salsa au prezentat proprietăți benefice, inclusiv activități imunomodulatoare, anticancerigene și antiinflamatorii [9,10]. Dereplicarea este un proces prin care amestecurile de probe ar fi testate pentru a diferenția constituenții necunoscuți de compușii cunoscuți. Strategiile de dereplicare se bazează pe tehnicile analitice și pe căutarea bazelor de date pentru a identifica metaboliții secundari la începutul procesului de cercetare fitochimică [11]. Dintre tehnicile analitice, ESI-QTOF-MS (electrospray ionization-quadrupole-time of flight-mass spectroscopy) ar putea oferi informații valoroase despre structurile chimice ale metaboliților secundari. S-a demonstrat că fracționarea ghidată de dereplicare pe bază de LC-MS permite extracția și purificarea metaboliților țintă din extracte brute de plante cu eficiență ridicată [12-15]. Acest studiu a efectuat dereplicarea pe bază de LC-MS folosind date de la ESI plus TOF-MS pentru analiza diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid, constituenții activi majori ai C. salsa. Datele TOF-MS ar putea sugera substructurile acestor compuși pe baza modelelor de fragmentare caracteristice ale diferiților ioni de produse. Pe baza acestei dereplicari, s-au analizat profilurile LC-MS ale fracțiunii de acetat de etil (EtOAc) și ale fracțiunii solubile în apă. Fracția EtOAc a fost supusă strategiei de dereplicare pentru o separare ulterioară, a dus la izolarea a cinci noi diglicozide substituite cu fenilpropanoid și a 13 compuși cunoscuți (Figura 1). S-a confirmat că structurile anticipate ale diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid s-au potrivit corect cu structurile lor reale. În plus, au fost explorate activitățile antiinflamatorii ale izolatelor.

Rezultate si discutii

Diglicozidele substituite cu fenilpropanoid izolate din C. salsa au de obicei structuri bazate pe glicozide dizaharide, care constau dintr-o glucoză și o ramnoză cu o legătură Rha (1→3) Glc și un substituent cinamoil, cum ar fi acidul cumaric (Cou), cafeic. acid (Caf) și acid feruloil (Fer), în poziția C-4 sau C-6 a glucozei. Agliconul este în mod obișnuit atașat la poziția C-1 a glucozei. Au fost raportate frecvent structurile diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid cu o grupare acetil la C-2 glucozei [6,12,16]. Pentru a efectua dereplicarea, modelele de fragmentare MS ale acestor compuși au fost analizate prin modul pozitiv ESI-QTOF-MS. În spectrele MS, toate diglicozidele substituite cu fenilpropanoid au produs vârfuri de ioni de aduct la [M plus NH4] plus, [M plus K] plus și [M plus Na] plus, care au furnizat greutatea moleculară și formula. Modelul ionilor de fragment ar putea fi găsit prin pierderi succesive de agliconi și reziduuri glicozide ([M plus H − Aglicon] plus , [M plus H − Aglicon − Rha] plus și [M plus H − Agliconă – Figura 1. Structuri ale compușilor 1–18 2. Rezultate și discuții Diglicozidele substituite cu fenilpropanoid izolate din C. salsa au de obicei structuri bazate pe glicozide dizaharide, care constau dintr-o glucoză și o ramnoză cu o legătură Rha (1→3) Glc și un substituent cinamoil, cum ar fi acidul cumaric (Cou), acidul cafeic (Caf) și acidul feruloil (Fer), în poziția C-4 sau C{-6 a glucozei. Agliconul este de obicei atașat la C{{24 }} poziția glucozei.S-au raportat frecvent structurile diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid cu o grupare acetil la C-2 glucozei [6,12,16].Pentru a efectua dereplicarea, modelele de fragmentare MS ale acestor compuși au fost analizate prin modul pozitiv ESI-QTOF-MS În spectrele MS, toate diglico-substituite cu fenilpropanoid laturile au produs vârfuri de ioni de aduct la [M plus NH4] plus , [M plus K] plus și [M plus Na] plus , care au furnizat greutatea moleculară și formula. Modelul ionilor de fragment ar putea fi găsit prin pierderi succesive de aglicon și reziduuri glicozide ([M plus H − Aglicon] plus , [M plus H − Aglicon − Rha] plus și [M plus H − Agliconă – Rha − Glc (sau Acetil -Glc)] plus ), care au fost utile pentru prezicerea tipului de substituent cinamoil și a zaharurilor. Ionii de fragment la m/z 163 ai grupării cafeoil, m/z 147 ai grupării cumaroil sau m/z 177 ai grupării feruloil dau semnalul caracteristic al unui substituent cinamoil în diglicozidele substituite cu fenilpropanoid [4,15] ( Figura 2). Analiza ionilor de fragment ar oferi informații utile pentru identificarea structurilor diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid. Cu toate acestea, izomerii lor nu au putut fi diferențiați numai prin spectrometrie MS. Pentru identificarea precisă a structurilor lor complete, sunt necesare spectre RMN.

Toate izolatele au fost testate pentru efectele lor inhibitoare asupra producției de NO indusă de LPS în celulele RAW 264.7. Dexametazona a fost utilizată ca martor pozitiv și IC50 a fost de 7,0 µM. Dintre compușii testați, compușii 5 (IC50 42,7 ± 6,6 uM), 11 (IC{50 37,3 ± 2,2 uM), 13 (IC{50 40.{{2{{ 24}}}} ± 4,0 µM) și 18 (IC{50 27,9 ± 0,8 µM) au prezentat activități inhibitorii moderate asupra NO sintazei inductibile, în timp ce ceilalți compuși au fost inactivi în acest test (IC50 valori > 100 µM). Pentru a verifica dacă acești compuși au avut citotoxicitate, viabilitatea celulară a fost măsurată folosind testul MTT. Ca rezultat, niciunul dintre ei nu a prezentat citotoxicitate semnificativă (Figura suplimentară S6-1). Acești patru compuși au fost selectați pentru a evalua activitatea lor inhibitoare împotriva căii NF-kB în celulele RAW 264.7 stimulate cu LPS. Stimularea celulelor RAW 264.7 cu LPS a indus fosforilarea IkB și NF-kB (p65) după 0,5 ore de incubare. Fosforilarea NF-kB (p65) a fost redusă semnificativ prin pretratarea cu compușii 11, 13 și 18, așa cum se arată prin analiza Western blot (Figura 5). Prin urmare, compușii 11, 13 și 18 ar putea exercita efecte antiinflamatorii prin inhibarea NF-kB în macrofage.

Materiale și metode

Rotațiile optice au fost măsurate cu un polarimetru digital Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Japonia). Spectrele UV au fost înregistrate pe un spectrometru Chirascan plus Circular Dicroism (Chirascan, APL, UK). Spectrele IR au fost înregistrate folosind spectrofotometrul Jasco FT/IR-4200. Spectrometria de masă de înaltă rezoluție cu electrospray ionizare cu patrupol în timpul zborului (HR-ESI-qTOF-MS) a fost efectuată pe un Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS echipat cu seria Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, SUA), iar coloana utilizată a fost o coloană Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id150 × 4,6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software a fost folosit pentru achiziția de date.

Spectrele RMN 1D (H și 13C) și 2D('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) au fost obținute cu un Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japonia), Bruker AVANCE-400, Spectrometre Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 și Bruker AVANCE 800 HD cuplate cu criosondă (Bruker, Ettlingen, Germania). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, SUA) a fost utilizat ca solvent RMN și vârfuri de referință (6H 2,50 și δc 39,5). Cromatografia pe coloană （CC） a fost efectuată utilizând Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Suedia) sau Kieselgel 60 silicagel ({40-63 um,230-400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt, Germania). Cromatografia în strat subțire (TLC) a fost efectuată pe plăci pre-acoperite cu gel de silice Kieselgel 60 F254 (Art.5715; Merck). Petele pe TLC au fost detectate utilizând o lampă UV la 254 nm și 365 nm (VL-4.LC, 365). /254;Vilber Lourmat, Torcy, Franţa). Cromatografia lichidă la presiune medie (MPLC) a fost efectuată pe o coloană rapidă de silice RediSep de 120 g (lsco, Lincoln, NE, SUA) și gel de silice Kiesegel 60 (40-63 um,230-400 mesh, Art.9385; Merck )folosind un însoțitor Combiflash (Isco). Sistemul de cromatografie lichidă de înaltă presiune (HPLC) a fost un Gilson HPLC echipat cu o pompă Gilson 321 și detector UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, SUA), folosind coloane ODS semi-preparative (Luna 5 um C18 （2） 100). Å, id 250×10 mm, 5 μm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, SUA; Hypersil GOLDrM aQ 175A,id250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf,Germania;Inno C18column 120 A,id250× 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea).The analytical RP-. Sistemul HPLC a fost un sistem de alianță Waters 2695 cu un detector 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, SUA), iar coloana utilizată a fost o coloană HypersilTM BDS C18 （130 A, id150×4,6 mm, 5 μm, Thermo ScientificTM）. Acidul formic a fost achiziționat de la Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seul, Coreea). Solvenții de calitate HPLC au fost achiziționați de la Fisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Coreea). HSOA, Na, CO și solvenți de primă calitate pentru extracție, fracționare și izolare au fost achiziționați de la Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seul, Coreea). Clorhidratul de ester metilic al L- și D-cisteină și o-tollizotiovanatul au fost achiziționate de la Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japonia).

Concluzii

În acest studiu, am izolat și elucidat structurile a cinci noi diglicozide substituite cu fenilpropanoid, denumite cistansalside AE ​​(5,6, 12, 17 și 18), pe lângă izolarea și identificarea a 13 compuși cunoscuți, folosind o strategie de dereplicare. S-a determinat că compușii cunoscuți sunt lipedozida AI(1)[21], 2’-acetilacteozida (2)[22], izocistanozida C(3)[15], osmantuzida B (4)[21], epimeridinozida A(7) [15], cistanozid D(8)[23], salsaside B(9) [6l, tubulozid E (10)[16]cistanozid M(11)[15], izomartynoside(13) [24], salsaside C(14) )[6], jionozid C(15)[25] și salsaside F (16)[6]. Structurile lor au fost stabilite prin analiza datelor spectroscopice extinse și prin comparație cu datele raportate în literatură. S-a confirmat că structurile anticipate ale diglicozidelor substituite cu fenilpropanoid s-au potrivit corect cu structurile lor reale.

În testul inhibitor de NO, compușii 5 （IC50 42.7±6.6 μM), 11（IC{50 37.3±2.2 μM）, 13 （IC50 40.0 ±4.0 μM） și 18（ICs{0 27.9±0.8uM au prezentat activități inhibitorii moderate. Dintre acești compuși, s-a descoperit că compușii 11, 13 și 18 inhibă fosforilarea NF-kB în macrofage și ar putea astfel exercita o activitate antiinflamatoare care va trebui dovedită în experimente ulterioare.

Extragere din: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ („Licența”). Fără a aduce atingere Termenilor și condițiilor ProQuest, puteți utiliza acest conținut în conformitate cu termenii licenței.