Determinarea echinacozidei în extract de apă de Cistanche Herba prin HPLC

Abstract:

Obiectiv A fost stabilită o metodă HPLC pentrudeterminarea echinacozideiînextract apos de Cistancheherba.

Metode Echinacozidul a fost determinat prin HPLC. Separarea a fost efectuată pe coloana Inertsil ODS-SP C18 cu o fază mobilă constând din acetonitril(A) și soluție de acid fosforic 0,4% (B), prin eluare în gradient. Lungimea de undă de detecție a fost setată la 333 nm, iar temperatura coloanei a fost de 30 grade. Debitul a fost de 1,0 mL·min-1 iar volumul de injectare a fost de 10 μL. Rezultate Relația liniară a echinacozidei în intervalul de concentrație de 44.939 7-539.{276 4 ug ·mL{- 1 a fost bună (r=0.999 8). Recuperările au fost de 94,59%-105,31% (RSD= 2,93%, n=9). Conținutul de echinacozidă din extractele apoase de Cistanche herba a fost de 15,527,7,347,12,267 mg·g-1. Concluzie Metoda HPLC stabilită, cu o bună repetabilitate, este precisă, simplă și fezabilă. Este potrivit pentru determinarea echinacozidei din extractul apos de Cistanche herba.

Cuvinte cheie:HPLC;extract apos de Cistanche herba; echinacozid; determinarea continutului

Cistanche deserticola este un medicament tonic tradițional chinezesc folosit în mod obișnuit în practica clinică și este cunoscut sub numele de „ginseng de deșert” [1]. Cistanche deserticola înregistrată în ediția din 2015 a Farmacopeei Chineze este tulpina cărnoasă uscată cu frunze solzoase de Cistanche deserticola YC Ma sau Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Este cald, dulce și sărat și revine la meridianele rinichilor și intestinului gros. Are efecte de hrănire a rinichilor yang, de completare a esenței și a sângelui și de hidratare a intestinelor și a laxativelor [2]. „Materia Medica a lui Shen Nong”, spune că poate „tonifica mijlocul, hrăni cele cinci organe interne, întărește yinul și hrănește esența”. Cistanche deserticola conține în principal glicozide feniletanoide, iridoide și glicozide ale acestora, lignani și glicozide ale acestora, polizaharide, compuși esteri și alcaloizi [3]. Glicozidele de feniletanol sunt principalele ingrediente active ale Cistanche deserticola. Printre acestea, echinacozidul și verbascozidul sunt enumerate în Cistanche deserticola în Farmacopeea Chineză.

Componente indicative pentru identificare și determinarea conținutului. Studiile farmacologice [4] arată că Cistanche deserticola are diverse efecte farmacologice, cum ar fi laxativ, protecție hepatică, anti-osteoporoză, antioxidant, anti-îmbătrânire și anti-oboseală. Extractul apos de Cistanche deserticola poate promova expresia genei proteinei morfogenetice osoase 2 în osteoblastele de șobolan, fosfataza acidă rezistentă la tartrat, osteocalcina în serul șoarecilor ovariectomizați și genele Smad1, mad5, factorul de creștere transformator- etc. în măduva osoasă. , are efecte anti-osteoporoză [5-6].

Echinacea poate promova proliferarea osteoblastelor și poate promova diferențierea celulelor stem mezenchimale ale măduvei osoase cultivate in vitro în osteoblaste [7-9]. În ultimii ani, au existat multe rapoarte de cercetare privind determinarea conținutului de echinacozidă și verbascozidă în extractul etanolic de Cistanche deserticola și preparatele sale compuse [10-12], dar există puține rapoarte privind determinarea conținutului componentelor indexului în Cistanche deserticola extract apos. În acest studiu, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) a fost utilizată pentru a determina conținutul de echinaceaside din extractul apos de Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instrumente

LC-20AT cromatografie lichidă de înaltă performanță, SPD-20A detector, SIL-20A autosampler, CTO-10ASvp coloană cuptor, LC soluție de cromatografie lichidă stație de lucru, Shimadzu Corporation of Japonia; MES125P-OCE-DU balanta analitica electronica, Sartorius Company, Germania; SHZ-D (Ⅲ) pompa de vid multifuncțională cu apă în circulație, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistem de circulație de răcire cu evaporator rotativ RC2B SO25, evaporator rotativ RV 10 D S96, Compania IKA, Germania; DK-S26

Baie de apă electrică cu temperatură constantă, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co, Ltd.; Mașină de apă ultrapură din seria UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materiale medicinale și reactivi

Materialul medicinal Cistanche deserticola a fost achiziționat de la Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., număr de lot: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, farmacistul șef tradițional chinez la Spitalul al treilea afiliat al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou, l-a identificat. ca tulpina cărnoasă uscată cu frunze solzoase de Cistanche deserticola YCMa. Eșantionul este stocat în camera de testare a medicamentelor a celui de-al treilea spital afiliat al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou; Substanță de referință glicozidă Echinacea, conținut 89,7%, Institutul Chinez pentru Controlul Alimentelor și Medicamentelor, număr de lot: 111670-

201706; acetonitrilul este cromatografic pur (Merck, Germania); metanolul și acidul fosforic sunt puri din punct de vedere analitic (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); apa este apa ultrapura.

2 Metode și rezultate

2.1 Prepararea extractului apos de Cistanche deserticola

Se ia pulberea grosieră de material medicinal Cistanche deserticola, se adaugă de 10 ori cantitatea de apă distilată, se încălzește și se refluxează pentru extracție de două ori, câte o oră de fiecare dată, se filtrează, se combină filtratul și se concentrează filtratul cu un evaporator rotativ. la un conținut de droguri brute de 0,100 g·mL-1 și păstrați-l la 4 grade pentru utilizare ulterioară.

2.2 Condiții cromatografice și adecvarea sistemului

Coloană cromatografică: coloană Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fază mobilă: acetonitril (A)-0.4% soluție de acid fosforic (B), gradient de eluție: 0 ~ 5 min, 17%

O; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; lungime de undă de detecție: 333 nm; temperatura coloanei: 30 de grade; debit: 1,0 mL·min-1;

Volumul de injectare: 10 μL. În aceste condiții cromatografice, separația dintre vârfurile echinacozidei și componentele adiacente este mai mare de 1,5, iar numărul de plăci teoretice bazat pe vârful echinaceasidei nu trebuie să fie mai mic de 4,000. Cromatograma este prezentată în figura 1.

2.3 Prepararea soluției

2.3.1 Soluție de substanță de referință Cântăriți o cantitate adecvată de substanță de referință echinacozidă, cântăriți-o cu precizie, puneți-o într-un balon cotat de 10 ml, adăugați metanol pentru a o dizolva și pregătiți o soluție de substanță de referință care conține 898,794 ug de echinaceaside per ml, 4 grade Salvați pentru utilizare ulterioară.

2.3.2 Soluție de testare

Se măsoară cu precizie 2,0 ml de extract apos de Cistanche deserticola, se evaporă până la uscare într-o baie de apă, se adaugă metanol pentru a se dizolva, se diluează la volum într-un balon cotat de 10 ml, se agită bine și se filtrează cu se obţine o membrană microporoasă de 0,22 μm.

2.4 Investigarea relației liniare

Măsurați cu precizie {{0}}.25, 0.5{0, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 ml de soluție de referință de la punctul 2.3.1, puneți-o într-un balon cotat de 5 ml, adăugați metanol pentru a aduce la volum și agitați bine pentru a obține o concentrație de gradient de 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL{-1 soluție de referință, filtrată prin membrană microporoasă de 0,22 μm. Se măsoară în conformitate cu condițiile cromatografice de la punctul 2.2 și se înregistrează aria vârfului. Efectuați regresia liniară cu concentrația de masă a substanței de referință ca abscisă (X, ug·mL-1) și aria vârfului ca ordonată (Y), și se obține ecuația de regresie: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Rezultatele arată că echinacea are o relație liniară bună în intervalul de concentrație de 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Test de precizie

Luați 539.276 4 ug ·mL- 1 soluție de referință, injectați și măsurați de 6 ori continuu în conformitate cu condițiile cromatografice de la 2.2 și înregistrați zona vârfului. Rezultatele au arătat că RSD-ul zonei vârfului echinacozidului a fost de 1,81%, indicând o bună precizie a instrumentului.

2.6 Test de stabilitate

Se măsoară cu precizie 2.0 mL de extract apos de Cistanche deserticola, se evaporă până la uscare într-o baie de apă, se adaugă metanol pentru a se dizolva, se diluează într-un balon cotat de 10 mL, se agită bine, se filtrează cu un {{ 7}}.22 μm membrana microporoasă, urmați condițiile cromatografice de la punctul 2.2 și plasați la 0 și, respectiv, 2. , 4, 8, 12, 24 de ore de măsurare a injecției, înregistrați zona vârfului. Rezultatele au arătat că RSD-ul zonei vârfului echinacozidului a fost de 1,16%, ceea ce indică faptul că soluția de testat a avut o stabilitate bună în 24 de ore.

2.7 Test de repetabilitate

Se măsoară cu precizie 2,0 mL de extract de apă de Cistanche deserticola și se prepară 6 soluții de testare în paralel, conform metodei de la 2.3.2. Se injectează probe pentru măsurare în conformitate cu condițiile cromatografice de la punctul 2.2 și se înregistrează aria vârfului. Rezultatele au arătat că RSD-ulechinacozidconcentrația de masă a fost de 1,28%, indicând o bună repetabilitate a metodei.

2.8 Test de recuperare a probei

Măsurați cu precizie 9 porții de 1,0 mL de extract de apă de Cistanche deserticola, adăugați 0,8, 1,0 și 1,2 mL de soluție de referință (1,552 mg·mL{{11) }}), respectiv, se evaporă până la uscare într-o baie de apă, se adaugă metanol pentru a se dizolva și se ajustează la un balon cotat de 10 mL; Se agită bine și se filtrează printr-o membrană microporoasă de 0,22 μm pentru a prepara soluții de testare cu concentrație mare, medie și mică. Pregătiți 3 copii ale fiecărei concentrații în paralel. Se măsoară în conformitate cu condițiile cromatografice de la punctul 2.2. Înregistrați aria vârfului și calculați recuperarea probei. Rata. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1.

2.9 Determinarea conținutului probei

Se măsoară cu precizie 3 porții de extract apos de Cistanche deserticola a 2,0 mL, se evaporă până la uscare într-o baie de apă, se adaugă metanol pentru a se dizolva, se diluează într-un balon cotat de 1{0 mL, se agită bine, se filtrează cu o membrană microporoasă de 0,22 μm și se măsoară în conformitate cu condițiile cromatografice de la punctul 2.2. Înregistrați zona vârfului și calculați conținutul de echinaceaside. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 1 Rezultatele testelor de recuperare a echinacozidei

Tabelul 2 Rezultatele determinării conținutului de echinacozidă în extractul apos de Cistanche herba