Șoarecii knockout cu diaminooxidază nu sunt hipersensibili la histamina administrată oral sau subcutanat

Abstract

1. Obiectiv

Pentru a evalua contribuția diaminoxidazei endogene (DAO) în inactivarea histaminei exogene, pentru a găsi o tulpină de șoarece cu sensibilitate crescută la histamină și pentru a testa eficacitatea rhDAO într-un model de provocare a histaminei.

2. Metode

Șoarecii knockout (KO) de diaminoxidază au fost provocați cu histamina administrată pe cale orală și subcutanată în combinație cu blocantul adrenergic propranolol, cu cei doi inhibitori ai histamin-N-metiltransferazei (HNMT), metopren și tacrină, cu acid folic pentru a imita leziunea renală acută și tratați cu DAO uman recombinant. Temperatura de bază a corpului a fost măsurată folosind un microcip implantat subcutanat și nivelurile plasmatice de histamină au fost cuantificate utilizând un test de fluorescență omogen rezolvat în timp.

3. Rezultate

Temperatura centrală a corpului și nivelurile de histamină în plasmă nu au fost semnificativ diferite între șoarecii de tip sălbatic (WT) și DAO KO după provocarea orală și subcutanată a histaminei cu și fără leziune renală acută sau administrare de inhibitori HNMT. Tratamentul cu DAO uman recombinant a redus aria medie de sub curbă (AUC) pentru pierderea temperaturii corporale centrale cu 63% (p=0,002) și scorul clinic cu 88% (p).<0.001). The AUC of the histamine concentration was reduced by 81%.

4. Concluzii

Inactivarea histaminei exogene nu este determinată de degradarea enzimatică și filtrarea rinichilor. Tratamentul cu DAO uman recombinant a redus puternic pierderea de temperatură corporală de bază indusă de histamină și concentrațiile de histamină și a prevenit dezvoltarea simptomelor clinice severe.

Cuvinte cheie

Aminoxidază (conținând cupru) · Histamina N-metiltransferază · Leziuni renale acute · Metabolism · Tacrină · Metoprină · Temperatura corpului

Click aici pentru a cumpara suplimentul Cistanche

Introducere

Mai mult de 95% din toată histamina la om este stocată în mastocite și bazofile. Același lucru este probabil să fie valabil și pentru multe mamifere. La om, densitățile mastocitelor sunt cele mai mari în tractul gastrointestinal, piele și plămâni [1] și, în consecință, aceste organe prezintă simptome induse de histamină în bolile cu implicare clară a activării mastocitelor. Concentrațiile interstițiale locale de histamină după degranularea acută pot atinge 10–1000 µMs [2, 3, vezi Resurse online]. La oameni, similar câinilor și porcilor, concentrațiile normale de histamină în plasmă sunt sub 1 ng/ml (9 nM) și simptomele încep să se dezvolte la câteva nanograme pe mililitru [4-7]. Hipotensiunea arterială semnificativă cu frecvență cardiacă crescută poate fi măsurată de la 5 ng/ml și atunci când nivelurile cresc peste 10 ng/ml, dezvoltarea bronhospasmului, aritmiilor cardiace, hipotensiunii arteriale severe și spasmului coronarian poate duce la disfuncții multi-sistem care pun viața în pericol [8, 9]. Histamina nu este implicată numai în vasodilatație, creșterea permeabilității vasculare, hipoxie și dezvoltarea edemului vascular, dar demonstrează și implicarea proinflamatoare care influențează sistemul imunitar adaptativ prin recrutarea, maturarea și activarea celulelor efectoare imune. În plus, joacă un rol în sistemul imunitar înnăscut prin interacțiunea cu celulele dendritice, celulele ucigașe naturale și granulocitele [10, 11].

Concentrațiile inițiale de histamină la șoareci și șobolani sunt între 20 și 100 ng/ml atunci când sunt măsurate folosind metode fiabile și, prin urmare, sunt de multe ori mai mari decât cele găsite la om [6, 7]. Nu este clar dacă aceste niveluri ridicate de histamină joacă vreun rol fiziologic. Rozătoarele sunt notoriu rezistente la histamina cu doze letale de 50% (DL50) în diferite tulpini de șoarece de 3000–4000 și 400–500 mg/kg după administrare orală și respectiv intravenoasă [12, 13]. Concentrația de vârf a histaminei în plasmă după o administrare în bolus de 400 mg/kg la un șoarece de 20 g ar fi de aproximativ 8 mg/ml presupunând un volum de plasmă de 1 ml. Când anafilaxia a fost indusă la om printr-o provocare controlată de înțepături de viespi, concentrațiile de histamină de 140 ng/ml au fost asociate cu hipotensiune arterială severă care pune viața în pericol [14]. Cum este metabolizată și inactivată histamina?

Histamina prezintă o legare medie de 13% la proteinele plasmatice și este filtrată liber în rinichi [15]. Rata de filtrare glomerulară (RFG) poate contribui teoretic cu aproximativ 15-20 la sută la timpul de înjumătățire de 3-4 minute găsit la voluntari sănătoși [5, vezi Resurse online]. La un RFG normal de 100 ml/min și un volum plasmatic de 3000 ml timpul de înjumătățire al histaminei ar fi de 20 min. La șoareci, un GFR normal de 10 µl/min/g ar duce la un timp de înjumătățire al histaminei de 3 minute [16, vezi Resurse online]. Cu toate acestea, histamina prezintă o rată mare de extracție în rinichi, depășind ratele bazate pe RFG, iar această extracție este atribuită absorbției și reabsorbției în celulele tubulare proximale prin intermediul transportorului de cationi organici 2 (OCT2), urmată de inactivarea enzimatică [17, vezi de mai jos]. La oameni, mai puțin de 1% din histamina radioactivă injectată a fost găsită în urină în primele 6 ore [18]. Rata scăzută de excreție a histaminei la om, care este observată și la câini și pisici, a fost confirmată de alții [19]. La șoareci și șobolani, mai mult de 50% din radioactivitatea injectată se găsește în rinichi și mai puțin de 2% sub formă de histamina la 30 de minute după administrarea intravenoasă [20]. Rinichii au fost, de asemenea, organul cu cea mai mare radioactivitate după administrarea de doze mari de histamină la șobolani [21]. Transportorul OCT2 este foarte exprimat în rinichii umani și de rozătoare și ar putea fi responsabil atât pentru extracția histaminei din compartimentul plasmatic, cât și pentru reabsorbția histaminei în filtratul primar de urină în celulele tubulare proximale [22, vezi mai jos].

Transportul rapid al histaminei extracelulare din lichidul interstițial după eliberarea din mastocite sau plasmă către alte compartimente departe de celulele endoteliale ar fi o altă posibilitate de a inactiva histamina. Acest lucru ar putea inhiba inducerea hipotensiunii severe și a scurgerilor vasculare mediate prin semnalizarea endotelială a oxidului nitric sintazei (NOS) și legarea de receptorii de histamină [23-25]. Cu toate acestea, nu sunt disponibile date in vivo la animale care să studieze ratele de transport ale histaminei din circulația sistemică în celulele endoteliale sau parenchimatoase. În mai multe studii in vitro, histamina este transportată bidirecțional folosind OCT2 și OCT3 cu afinitate scăzută, de mare capacitate [22, 26, 27]. Histamina este un substrat excelent pentru transportatorul OCT2 și OCT3 de șobolan, prezentând eficiențe de transport mai mari în comparație cu proteinele OCT umane echivalente [26].

Herba Cistanche

Atunci când la șoareci sunt utilizate concentrații scăzute de histamină radioactivă, metilarea prin histamină-N-metiltransferază (HNMT) pare să fie calea majoră de inactivare. Provocarea șoarecilor cu doze mai mari de histamină, totuși, schimbă metabolismul la acid imidazol acetic (IMAA) și conjugați de ribozidă, cu doar o cantitate mică de derivați metilați detectați [28-30]. Concentrațiile inițiale de histamină serice crescute de cinci ori la șoarecii knock-out HNMT susțin aceste date [31]. Acidul imidazolacetic este generat prin oxidarea histaminei de către diaminoxidaza (DAO) eliberând imidazol acetaldehidă, care este transformată în IMAA și derivați de ribozidă, în principal în ficat. Oxidarea histaminei prin DAO pare să joace un rol mai mare în catabolismul histaminei după provocarea orală la șoareci, ceea ce nu este surprinzător având în vedere că la șoareci expresia DAO este ridicată numai în tractul gastrointestinal [30]. Când o provocare orală a histaminei este efectuată la om, dezaminarea oxidativă prin DAO este calea catabolică dominantă cu IMAA ca principal metabolit urinar [18].

Diaminoxidaza este o aminoxidază care conține cupru și una dintre cele două enzime capabile să inactiveze histamina [32]. În țesuturile selectate, în principal intestinul subțire și celulele tubulare proximale ale rinichilor, DAO este localizat în structuri granulare intracelulare prost definite și legat extracelular de proteoglicanii heparan sulfat, în timp ce HNMT este prezent doar în citoplasmă [33, 34]. Expresia HNMT este larg răspândită în întregul corp, cu niveluri mai ridicate găsite în sistemul nervos central, vezică urinară, inimă, rinichi, ficat, plămâni și țesutul adipos.

După inhibarea DAO folosind aminoguanidină, oile au prezentat simptome clinice extinse de toxicitate a histaminei după provocarea orală cu histamină, comparativ cu martorii fără pretratament cu aminoguanidină [35]. Un experiment similar la porci a dus la morbiditate și mortalitate severă la animalele pre-tratate cu aminoguanidină și ulterior provocate cu histamina orală [36]. Concentrațiile plasmatice medii de histamină au crescut de 20-ori la porcii cu inhibare a DAO. Tratamentul șobolanilor cu aminoguanidină urmat de provocarea orală cu histamină a crescut IMAA urinar și a redus concentrația de histamină de aproximativ cinci ori [37]. Aceste date au indicat că DAO joacă un rol crucial în degradarea histaminei exogene administrate oral.

La șoareci, tratamentul cu aminoguanidină a crescut puternic concentrațiile de histamină în intestin după provocarea intravenoasă a histaminei [30]. Cu toate acestea, aminoguanidina nu este un inhibitor specific DAO, dar blochează și toate cele trei enzime NOS și pare să blocheze transportul histaminei din sânge în țesuturi [38, 39]. Administrarea de burimamide, un antagonist al receptorului histaminic 2, a arătat efecte dăunătoare cu mortalitate crescută într-un model de șoc circulator la șobolani. Cu toate acestea, în același timp, a fost publicat că burimamida este un inhibitor puternic DAO [40, 41]. La câini, burimamida a provocat o creștere de 17-ori a concentrației medii a histaminei plasmatice și o reducere puternică a presiunii arteriale medii [42]. Se credea că efectul se datorează posibilei activări mastocite.

În mod similar, rolul HNMT a fost studiat folosind metilhistamină ca inhibitor al HNMT, dar metil-histamina este, de asemenea, un substrat excelent pentru DAO [43]. Amodiachina și quinacrina sunt inhibitori puternici ai HNMT [44–46], dar inhibă și DAO cu o concentrație inhibitoare de 50% (IC50) de aproximativ 500 nM [47, date nepublicate]. Prin urmare, datele obținute folosind inhibitori, care sunt adesea utilizați la concentrații mari, trebuie interpretate cu prudență, deoarece efectele în afara țintă cunoscute și necunoscute sunt probabile și pot distorsiona semnificativ relevanța fiziologică a studiilor in vivo.

Studiile metabolice ar putea oferi unele indicații ale importanței celor două enzime în degradarea histaminei, dar catabolismul histaminei ar putea fi decuplat de efectele fiziologice sau patofiziologice. Concentrațiile de histamină în compartimente ar putea fi critice, iar metabolismul ar putea fi în aval.

Prin urmare, am decis să folosim șoarecele DAO knock-out (KO) pentru a studia rolul DAO în degradarea histaminei exogene. Un al doilea obiectiv cheie a fost dezvoltarea unui model de șoarece cu sensibilitate crescută la histamină pentru a ne permite să studiem mai bine rolul histaminei în diferite tulpini genetice mutante și să testăm eficacitatea DAO umană recombinată într-un model de provocare a histaminei.

Cistanche capsule

Material si metode

Modele animale

Experimentele au fost efectuate folosind șoareci KO C57BL6/J Aoc1tm1b(EUCOMM)Hmgu (DAO) în vârstă de 10-18-săptămâni și tovarăși de tip sălbatic (WT). Embrionii heterozigoți au fost furnizați de către Arhiva Europeană Mouse Mutant, München, Germania și implantați în șoareci C57BL6/N pseudogravi. Șoarecii descendenți heterozigoți C57BL6/J au fost confirmați folosind PCR (vezi Resurse online) și folosiți în continuare pentru a reproduce șoareci DAO KO la Divizia de Cercetare Biomedicală, Universitatea de Medicină din Viena, prin protocolul animal GZ 66.009/{ {14}}WF/V/3b/2016. Toate experimentele pe animale au fost efectuate conform protocolului GZ 66.009/0258- V/3b/2019. Protocoalele experimentale au fost aprobate de Ministerul Austriac al Educației, Științei și Cercetării. Animalele au fost ținute la un ciclu de 12:12 ore zi-noapte la 22 de grade cu apă și hrană ad libitum. Pentru măsurătorile neinvazive de temperatură, un transponder (IPTT-300, BioMedic Data Systems Inc., SUA) a fost implantat subcutanat cu 2 săptămâni înainte de experiment folosind anestezie scurtă cu izofluran. Transponderul măsoară temperatura de trei ori într-o secundă, iar media acestor măsurători este înregistrată din exteriorul cuștii cu ajutorul unui cititor. Această valoare medie este apoi utilizată pentru calcule ulterioare. Aceste transpondere subcutanate sunt utilizate pentru a evita manipularea excesivă a animalelor și pentru a preveni rănirea prin introducerea repetată a sondelor de temperatură rectală [48]. La mai multe specii de animale, inclusiv rozătoare, s-a dovedit că administrarea de histamină scade temperatura corpului și este considerată citirea de ultimă generație pentru efectele histaminei [49, 50]. În timpul perioadei de observație, simptomele clinice au fost evaluate de un medic veterinar cu experiență conform unui scor de hipersensibilitate publicat [51]. Scorul a variat de la 0 (fără simptome) la 1 (frecare și zgâriere a capului și a nasului), 2 (activitate redusă cu frecvență respiratorie crescută și/sau activitate redusă, umflături în jurul gurii și ochilor), 3 (respirație dificilă, cianoză în jurul cozii). și gura, respirație șuierătoare) și 4 (fără activitate după instigare sau tremor și convulsii). Un scor de 5 a indicat moartea. Toate experimentele de provocare au fost începute între orele 9:00 și 11:00 pentru a evita variațiile dependente de timpul zilei [52].

Configurație experimentală generală

Toate substanțele au fost aplicate într-un volum de 5 ml/kg. Propranololul (P0884, Sigma-Aldrich, Austria) a fost dizolvat în soluție salină și aplicat intraperitoneal (ip) la o concentrație de 2 mg/kg cu 20 de minute înainte de provocarea histaminei pentru a crește sensibilitatea pentru histamină [53]. Diclorhidratul de histamină (H7250, Sigma-Aldrich, Austria) a fost dizolvat în H2O dublu distilat (dd) și apoi diluat în soluție salină. Toate concentrațiile de histamină declarate se referă la baza de histamină (111,15 Dalton).

1. Administrare orală și subcutanată de histamină

Șoarecii au fost ținuți în post timp de 60 de minute în total. După 40 de minute de post, s-a administrat propranolol și 20 de minute mai târziu s-a aplicat histamina la o concentrație de 30 mg/kg per os (po) folosind gavaj oral. Pentru modelul de provocare subcutanată (sc) șoarecii fie au primit histamina la o concentrație de 50 mg/kg fără propranolol, fie 5 mg/kg cu propranolol. Pentru determinarea concentrațiilor plasmatice de histamină, un subset de șoareci a fost anesteziat la diferite momente după provocarea histaminei folosind 10 mg/kg xilazină și 100 mg/kg ketamina. Plasma cu citrat a fost colectată de la șoareci anesteziați folosind puncție cardiacă. Un până la cinci șoareci au fost utilizați pentru fiecare punct de timp și genotip.

2. Inhibarea concomitentă a histamin-N-metiltransferazei (HNMT).

Metoprină (M338835, Toronto Research Chemicals, Canada) a fost dizolvată în acid lactic 10% (L1875, Sigma-Aldrich, Austria), diluată în continuare în soluție salină și administrată ip la 3 mg/kg 1 oră înainte de provocare cu 5 mg/kg histamină. Tacrina (A79922, Sigma-Aldrich, Austria) a fost dizolvată în ddH2O, diluată în continuare în soluție salină și, ulterior, s-a aplicat 10 mg/kg ip cu 1 oră înainte de 25 mg/kg histamină sc și 2 mg/kg propranolol. O concentrație de 2 mg/kg Tacrine ip a fost utilizată în combinație cu 30 mg/kg histamină po combinată cu 2 mg/kg propranolol.

Cistanche standardizate

3. Inducerea leziunii renale acute (AKI) înainte de provocarea histaminei

Folic acid (F7876, Sigma-Aldrich, Austria) was reconstituted in ddH2O, further diluted in saline, and applied i.p. at a concentration of 100 mg/kg 48 h before challenge with 5 mg/kg s.c. histamine and 2 mg/kg propranolol. The degree of acute kidney injury was estimated using plasma creatinine values. As a cut-off for inclusion, a creatinine value of at least threefold above the mean baseline value was used as described [54]. Baseline plasma creatinine concentrations of 0.11 and 0.17 mg/dl were measured in two mice and therefore an inclusion cut-off of>S-au selectat 42 mg/dl. Plasma de citrat extrasă prin puncție cardiacă a fost utilizată pentru a măsura creatinina utilizând un analizor Cobas (analizor Cobas C311, Roche, Elveția). Pentru a determina concentrațiile plasmatice de histamină la diferite momente în timpul provocării sc histaminei cu propranolol în leziuni renale acute, doi până la patru șoareci pe moment au fost anesteziați și plasma citrat a fost colectată prin puncție cardiacă.

4. Salvare DAO după administrarea histaminei

(rh)DAO recombinant uman cu un motiv mutant de legare a heparinei (descris în Gludovacz et al. [55]) a fost aplicat intravenos (iv) la o concentrație de 4 mg/kg cu 40 min înainte de aplicarea a 2 mg/kg propranolol și 60 min înainte de provocare cu 5 mg/kg histamina sc.

Pentru determinarea concentrațiilor de histamină și DAO în plasmă, șoarecii au fost tratați fie cu 4 mg/kg DAO, fie cu tampon iv 60 min înainte de provocare cu 5 mg/kg sc de histamină combinat cu 2 mg/kg propranolol. Șoarecii au fost anesteziați în momente diferite. Plasma cu citrat a fost colectată prin puncție cardiacă de la doi până la trei șoareci pe moment. Sângele a fost colectat în citrat de sodiu 3,8% și o parte a fost amestecată imediat cu diminazen-aceturat (D7770, Sigma-Aldrich, Austria) rezultând o concentrație finală de 10 pM pentru a inhiba degradarea histaminei de către rhDAO.

Analiza expresiei genelor

Probele de țesut au fost congelate la șoc în azot lichid și ARN-ul total a fost obținut folosind kit-ul FavorPrep Tissue Total ARN (FATRK001, Favorgen, Taiwan) după omogenizarea țesuturilor folosind tuburi de lizare (Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Germania) pe un Precellys 24 (Bertin Instruments, Franța). Transcripția inversă a fost efectuată folosind kitul de sinteză OneScript Plus cADN (G236, ABM Good, Canada). Pentru PCR cantitativă a fost folosit BrightGreen Express 2× Mastermix (MasterMix-EL, ABM Good, Canada). Primerii de acoperire a exonilor pentru DAO, HNMT și histidin decarboxilază (HDC) au fost proiectați folosind software-ul Primer3 (Tabelul de resurse online 1). Gena de menaj RPLP0 a fost utilizată pentru normalizare [56].

Vest blot

Pentru analiza Western blot, probele de țesut congelat au fost lizate în tampon K-fosfat de 20 mM (pH 7,2) folosind tuburi de lizare (tuburi Lysing Matrix E, MP Biomedicals, Germania) pe un Precellys 24 (Bertin Instruments, Franța) . Concentrația totală de proteine ​​a fost determinată utilizând kitul de testare QuantiPro BCA (QPBCA-1KT, Sigma, Austria). Pentru electroforeza pe gel de poliacrilamidă, 40 µg de proteină totală și 40 ng de DAO murin recombinant (furnizate de EG, Universitatea de Resurse Naturale și Științe ale Vieții, Viena, Austria, folosind metodele descrise în [57]) au fost separate folosind un gel Tris-glicină de 12% ( 4561043, Bio-Rad, SUA). Un anticorp monoclonal ABP1 (sc-515908, Santa Cruz, SUA) a fost utilizat pentru detectarea DAO la o concentrație de 0,4 µg/ml, iar un anticorp monoclonal GAPDH (2118, Cell Signal Technology, SUA) a fost utilizat ca încărcare control la o diluție de 1:2000. Anticorpul monoclonal anti-șoarece IgG-HRP (A2554, Sigma Aldrich, Austria) și anticorpul anti-iepure IgG-HRP (A0545, Sigma Aldrich, Austria) au fost utilizați ca anticorpi de detecție la o diluție de 1:40.000. Imaginile au fost achiziționate folosind substratul Clarity Max Western ECL (1705062, BioRad, SUA) pe un sistem de imagistică ChemiDoc (17001401, Bio-Rad, SUA).

Cistanche tubulosa

Măsurarea activității DAO

Activitatea diaminooxidazei diferitelor omogenate tisulare și inhibarea de către metopren și tacrină au fost măsurate așa cum este descris [58]. Probele de țesut congelate au fost lizate în tampon K-fosfat 20 mM (pH 7,2) folosind tuburi de lizare pe un Precellys 24. Concentrația totală de proteine ​​a fost determinată utilizând kitul de testare QuantiPro BCA și 500 ug extracte totale de proteine ​​din diferite țesuturi au fost incubate timp de 120 de minute cu orto-aminobenzaldehidă (oABA) și fie ddH2O, fie 200 uM cadaverină (CAD). Delta-1-piperidina, produsul de autociclizare al CAD după dezaminarea prin DAO, se condensează cu oABA formând un fluorofor, care poate fi măsurat la EX440/30 și EM620/40 nm. Pentru determinarea inhibării DAO, rhDAO a fost preincubat cu metopren și tacrină la diferite concentrații timp de 30 de minute și măsurat așa cum este descris mai sus.

Pentru determinarea activității DAO, omogenate tisulare cu o concentrație de proteină de 200 µg/ml au fost amestecate cu HRP (concentrație finală 1,2 µg/ml, P6782, Sigma-Aldrich, Austria) și aminoguanidină (concentrație finală 10 µM, 396494, Sigma-Aldrich). , Austria) sau tampon K-fosfat (pH 7,2) a fost adăugat și incubat timp de 15 minute la 37 de grade. Amplex red™ (concentrație finală 100 pM, A12222, Thermo Scientific, SUA) a fost adăugat și reacțiile au fost începute prin adăugarea a 200 pM concentrație finală de putrescină (51799, Sigma-Aldrich, Austria). Tampon fosfat de potasiu (pH 7,2) a fost utilizat ca martor negativ. Probele au fost incubate la 37 de grade și măsurate la fiecare 10 minute timp de 120 de minute utilizând EX550 și EM590 nm. Semnalul specific DAO a fost calculat prin scăderea probelor cu aminoguanidină, un inhibitor DAO puternic și ireversibil, din probele cu tampon K-fosfat.

Pentru măsurătorile activității DAO în plasmă la șoarecii cărora li s-a administrat iv Rhoda a fost utilizat un test hibrid folosind un anticorp monoclonal din clona de linie celulară hibridom anti-DAO 8/119 furnizată de Prof. Quaroni (Universitatea Cornell, Ithaca, NY) și Amplex red™. Plăcile de fluorescență negre cu legare ridicată de proteine ​​(475.515, Thermo Scientific Nunc, Danemarca) au fost acoperite cu 100 µl de 5 µg/ml anti-DAO 8/119 în tampon carbonat-bicarbonat de 50 mM ( C3041, Sigma-Aldrich, Austria), incubat peste noapte la 4 grade și ulterior blocat cu 120 ui 1% BSA (A4503, Sigma-Aldrich, Austria) timp de 50 de minute la temperatura camerei. După blocarea a 100 ui de probe de plasmă și standarde, s-au adăugat anterior diluate 1:10 în PBS și s-au incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Ulterior s-au adăugat 90 pl peroxidază de hrean (concentrație finală 1,2 pg/ml) și Amplex red™ (concentrație finală 100 pM) în PBS cu 0,1 % BSA și reacțiile au fost începute prin adăugarea a 10 pl putrescină (concentrație finală 200 pM) sau PBS. Fluorescența a fost măsurată la 37 de grade la fiecare 5 minute timp de 120 de minute utilizând EX550 și EM590 nm. Soluția de spălare a fost 0,1% Tween-20 (P1379, Sigma-Aldrich, Austria) în PBS. O curbă standard de 3-30 ng/ml rhDAO a fost preparată în plasmă de șoarece. Toate măsurătorile au fost efectuate în dublu exemplar.

Măsurătorile histaminei

Plasmă de citrat care conține 10 uM diminazen-aceturat (D7770, Sigma-Aldrich, Austria) a fost utilizată pentru a măsura concentrațiile de histamină folosind kitul dinamic de fluorescență omogenă rezolvată în timp (HTRF) de histamină (62HTMDPET, Cisbio, Franța). Setul a fost folosit conform instructiunilor furnizate de producator. Pentru cuantificare a fost utilizată o curbă standard de histamină în plasmă combinată de șoareci C57Bl/6J. Toate concentrațiile de histamină se referă la baza de histamină și toate măsurătorile au fost efectuate în duplicat.

analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism Versiunea 8.4.0. (GraphPad Software Inc. San Diego). Semnificația statistică pentru diferențele în activitatea DAO în omogenate tisulare a fost calculată utilizând un ANOVA cu măsuri repetate cu corecție Geisser-Greenhouse. Aria de sub curbe (AUC) de la măsurătorile individuale ale temperaturii corporale de bază și scorurile clinice în timpul unui experiment au fost comparate folosind teste t cu două fețe, nepereche, fără corecția lui Welch. Concentrațiile de histamină în plasmă între grupuri au fost comparate cu un ANOVA bidirecțional. Pentru compararea concentrațiilor plasmatice de histamină după sc provocarea între șoarecii cu genotipuri diferite, cu și fără leziune renală acută și care au primit fie DAO, fie tampon, datele au fost grupate în intervale pentru a ține cont de valorile lipsă în subgrupuri individuale (genotipuri: 5, 1{{{ 14}}, 20, 30, 40, 45, 60 min; leziune renală acută: 0, 10–15, 20–30, 40–45 și 60 min; DAO: 0, 10, 30 și 45 min). Un test t cu două fețe, nepereche a fost utilizat pentru a testa diferențele în concentrațiile plasmatice de creatinine de la șoarecii tratați cu și fără 100 mg/kg acid folic. Semnificația statistică a fost definită ca p<0.05 in all tests.

Extract de Cistanche

Concluzie

Șoarecii DAO KO au fost în esență imposibil de distins de șoarecii WT folosind provocări exogene orale și subcutanate cu histamină. Implicarea HNMT în inactivarea histaminei care duce la reducerea simptomelor - topologia este în cel mai bun caz moderată, dar rezultatele din inhibarea farmacologică ar putea fi considerate preliminare. Datele care utilizează inhibarea HNMT cu metopren au arătat o tendință spre implicarea DAO endogenă în inactivarea histaminei. Rinichii sunt implicați în extracția rapidă a histaminei din circulație, dar șoarecii knockout cu 509 Diaminoxidază de șapte ori nu sunt hipersensibili la administrarea orală sau subcutanată... 1 3 concentrațiile de histamină nu s-au tradus într-un fenotip exagerat măsurat folosind temperatura centrală. pierdere ca citire fenotipică. Utilizarea DAO recombinată umană sau de șoarece ar putea sprijini sau ajuta la înlăturarea implicării histaminei în diferite modele animale cu degranulare suspectată a mastocitelor însoțită de eliberare rapidă și masivă de histamină sau cu inducerea îmbunătățită a enzimei histidin decarboxilază urmată de eliberarea de enzime proaspăt sintetizate. histamina peste ore. Creșterea unui adevărat șoarece dublu KO cu copii inactive atât ale genei DAO, cât și ale genei HNMT, dacă este viabilă, ar putea merita studiată. Șoarecii KO unici ai DAO sau HNMT nu prezintă fenotipuri evidente. [date nepublicate, 31] În mod similar, testarea implicării celor doi transportatori principali de histamină, OCT2 și OCT3, în modificările fenotipice induse de histamină ne-ar putea permite să obținem o mai bună înțelegere a mecanismelor din spatele dezvoltării simptomelor mediate de histamină la rozătoare și în consecință, potențial și la oameni. În ciuda eforturilor semnificative de cercetare de mai bine de 100 de ani de la descoperirea sa, mai avem încă ceva de parcurs înainte de a obține o înțelegere adevărată a catabolismului histaminei.

Referințe

1. Boehm T, Ristl R, Joseph S, et al. Dereglarea metabolomului și a lipidomului în timpul unui eveniment sever de activare a mastocitelor la un pacient cu mastocitoză sistemică indolentă. J Allergy Clin Immunol. 2021. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2021.03.043. 2. Packard KA, Khan MM. Efectele histaminei asupra Th1/Th

2 echilibru de citokine. Int Imunofarmacol. 2003;3:909–20. https://doi.org/ 10.1016/S1567-5769(02)00235-7.

3. Hesterberg R, Sattler J, Lorenz W, et al. Conținutul de histamină, activitatea diaminooxidazei și activitatea histaminmetiltransferazei în țesuturile umane: realitate sau ficțiune? Acțiuni ale agenților. 1984;14:325– 34. https://doi.org/10.1007/BF01973821.

4. Dyer J, Warren K, Merlin S, et al. Măsurarea histaminei plasmatice: descrierea unei metode îmbunătățite și a valorilor normale. J Allergy Clin Immunol. 1982;70:82–7. https://doi.org/10.1016/ 0091-6749(82)90233-0.

5. Pollock I, Murdoch RD, Lessof MH. Histamina plasmatică și toleranța clinică la histamina perfuzată la subiecții normali, atopici și urticarieni. Acțiuni ale agenților. 1991;32:359–65. https://doi.org/10. 1007/BF01980899.

6. Liu J, Wang L, Hu W, et al. Dezvoltarea unei metode UHPLC-MS/MS pentru determinarea histaminei plasmatice la diferite specii de mamifere. J Chromatogr B. 2014;971:35–42. https:// doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.08.043.

7. Xu Y, Kang T, Dou D și colab. Evaluarea și optimizarea modelului animal pentru reacția anafilactoidă indusă de injecții. Asian Pac J Allergy Immunol. 2015;33:330–8. https://doi.org/ 10.12932/AP0619.33.4.2015.

8. Maintz L, Novak N. Histamina și intoleranță la histamină. Am J Clin Nutr. 2007;85:1185–96. https://doi.org/10.1093/ajcn/85.5. 1185.

9. Ginsburg R, Bristow MR, Kantrowitz N, et al. Provocarea histaminică a spasmului clinic al arterei coronare: implicații privind patogeneza variantei anginei pectorale. Am Heart J. 1981;102:819–22. https://doi.org/10.1016/0002-8703(81) 90030-2.

10. O'Mahony L, Akdis M, Akdis CA. Reglarea răspunsului imun și a inflamației de către receptorii de histamină și histamină. J Allergy Clin Immunol. 2011;128:1153–62. https://doi. org/10.1016/j.jaci.2011.06.051.

11. Thurmond RL, Gelfand EW, Dunford PJ. Rolul receptorilor histaminei H1 și H4 în inflamația alergică: căutarea de noi antihistaminice. Nat Rev Drug Discov. 2008;7:41–53. https://doi.org/10.1038/nrd2465.

12. Pericin C, Thomann P. Comparația toxicității acute a cliochinolului, histaminei și cloroformului la diferite tulpini de șoareci. În: Chambers PL, Günzel P, editori. Mecanism de acțiune toxică asupra unor organe țintă. Berlin: Springer; 1979. p. 371–3.

13. Lamanna C, Ross HE. Relația dintre doza toxică letală și greutatea corporală a șoarecelui. Toxicol Appl Pharmacol. 1968;13:307–15. https://doi.org/10.1016/0041-008X(68)90104-X.

14. Van der Linden P, Hack C, Poortman J, et al. Provocarea înțepăturii de insecte la 138 de pacienți: relația dintre severitatea clinică a anafilaxiei și activarea mastocitelor. J Allergy Clin Immunol. 1992;90:110–8. https://doi.org/10.1016/S0091-6749(06) 80017-5.

15. Williams WR, Shale DJ. Deplasarea in vitro a mediatorilor vasoactivi din proteinele plasmatice: un posibil mecanism pentru reacții pseudo-alergice la medicamentele de blocare neuromusculară. Fr. J Anaesth. 1992;69:508–10. https://doi.org/10.1093/bja/69.5.508.

16. Sasaki Y, Iwama R, Sato T, et al. Estimarea ratei de filtrare glomerulară la șoarecii conștienți folosind o ecuație simplificată. Physiol Rep. 2014;2:e12135. https://doi.org/10.14814/phy2.12135.

17. Helander CG, Lindell SE, Westling H. Îndepărtarea renală a histaminei marcate C14-din sânge la om. Scand J Clin Lab Investig. 1965. https://doi.org/10.1080/00365516509083360.

18. Sjaastad O, Sjaastad ÖV. Catabolismul histaminei l4C administrate oral la om. Acta Pharmacol Toxicol. 1974;34:33–45. https://doi.org/10.1111/j.1600-0773.1974.tb02011.x.

19. Schayer RW. Metabolismul histaminei la diferite specii. Br J Pharm Chemoth. 1956;11:472–3. https://doi.org/10.1111/j. 1476-5381.1956.tb00020.x.

20. Snyder SH, Axelord J, Bauer H. Soarta C14-Histaminei în țesuturile animale. J Pharmacol Exp Ther. 1964;144:373–9.

21. Rose B, Browne JSL. Distribuția și rata de dispariție a histaminei injectate intravenos la șobolan. Am J Physiol. 1938;124:412–20. https://doi.org/10.1152/ajplegacy.1938.124.2. 412.

22. Koepsell H, Lips K, Volk C. Transportatori de cationi organici polispecifici: structură, funcție, roluri fiziologice și implicații biofarmaceutice. Farm Res. 2007;24:1227–51. https://doi.org/ 10.1007/s11095-007-9254-z.

23. Lantoine F, Iouzalen L, Devynck MA, et al. Producția de oxid nitric în celulele endoteliale umane stimulate de histamină necesită un aflux de Ca2 plus. Biochim. 1998;330:695–9. https://doi.org/10.1042/ bj3300695.

24. Mikelis CM, Simaan M, Ando K, et al. RhoA și ROCK mediază scurgerile vasculare induse de histamină și șocul anafilactic. Nat Commun. 2015;6:6725. https://doi.org/10.1038/ncomms7725.

25. Ashina K, Tsubosaka Y, Nakamura T, et al. Histamina induce hiperpermeabilitatea vasculară prin creșterea fluxului sanguin și întreruperea barierei endoteliale in vivo. Plus unu. 2015;10:e0132367. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132367.

26. Schömig E, Lazar A, Gründemann D. Transportor extraneuronal de monoamine și transportatori de cationi organici 1 și 2: o revizuire a eficienței transportului. În: Sitte HH, Freissmuth M, editori. Transportatori de neurotransmitatori. Berlin: Springer; 2006. p. 151–80.

27. Ohtsu H. Progrese în cercetarea semnalelor alergice asupra mastocitelor: rolul histaminei în bolile imunologice și cardiovasculare și sistemul de transport al histaminei în celulă. J Pharmacol Sci. 2008;106:347–53. https://doi.org/10.1254/jphs.FM0070294.

28. Karjala SA, Turnquest B, Schayer RW. Metaboliți urinari ai histaminei radioactive. J Biol Chem. 1956;219:9–12. https://doi. org/10.1016/S0021-9258(18)65762-X.

29. Schayer RW. Catabolismul cantităților fiziologice de histamina in vivo. Physiol Rev. 1959;39:116–26. https://doi.org/10.1152/ physrev.1959.39.1.116.

30. Reilly MA, Schayer RW. Studii in vivo privind catabolismul histaminei și inhibarea acesteia. Br J Pharmacol. 1970;38:478–89. https://doi. org/10.1111/j.1476-5381.1970.tb10590.x.

31. Naganuma F, Nakamura T, Yoshikawa T, et al. Histamina N-metiltransferaza reglează agresivitatea și ciclul somn-veghe. Sci Rep. 2017;7:15899. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16019-8.

32. McGrath AP, Hilmer KM, Collyer CA, et al. Structura și inhibarea diaminooxidazei umane. Biochimie. 2009;48:9810–22. https://doi.org/10.1021/bi9014192.

33. Schwelberger HG. Analiza țesuturilor și a localizării subcelulare a diaminoxidazei de mamifere prin microscopie de fluorescență cu scanare laser confocală. Infamm Res. 1998;47:60–1. https://doi.org/ 10.1007/s000110050273.

34. Nishibori M, Tahara A, Sawada K, et al. Localizarea neuronală și vasculară a histaminei N-metiltransferazei în sistemul nervos central bovin. Eur J Neurosci. 2000;12:415–24. https://doi.org/ 10.1046/j.1460-9568.2000.00914.x.

35. Sjaastad ÖV. Potențarea prin aminoguanidină a sensibilității oilor la histamina administrată pe cale orală. Efectul amino-guanidinei asupra excreției urinare a histaminei endogene. Exp Physiol. 1967;52:319–30. https://doi.org/10.1113/expphysiol.1967.sp001 918.

36. Sattler J, Häfner D, Klotter HJ și colab. Histamine induse de alimente ca problemă epidemiologică: creșterea histaminei plasmatice și modificări hemodinamice după administrarea orală de histamină și blocarea diaminooxidazei (DAO). Acțiuni ale agenților. 1988;23:361–5. https://doi.org/10.1007/BF02142588.

37. Bowman MA, Simell OG, Peck AB, et al. Farmacocinetica administrării aminoguanidinei și efectele asupra frecvenței diabetului la șoarecii diabetici neobezi. J Pharmacol Exp Ther. 1996;279:790–4.

38. Matejovic M, Krouzecky A, Martinkova V, et al. Inhibarea selectivă inductibilă a oxidului nitric sintazei în timpul bacteriemiei porcine hiperdinamice pe termen lung. Şoc. 2004;21:458–65. https://doi. org/10.1097/00024382-200405000-00010.

39. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Sintazele de oxid nitric: structură, funcție și inhibiție. Biochem J. 2001;357:593–615. https://doi.org/10.1042/bj3570593.

40. Altura BM, Halevy S. Acțiuni benefice și dăunătoare ale antagoniștilor receptorilor H1- și H2-histaminei în șoc circulator. PNAS. 1978;75:2941–4. https://doi.org/10.1073/pnas.75.6.2941.

41. Thomas LL, Bochner BS, Lichtenstein LM. Inhibarea activității histaminazei derivate din leucocite polimorfonucleare umane de către antagoniştii H-2. Biochem Pharmacol. 1978;27:2562–5. https:// doi.org/10.1016/0006-2952(78)90327-1.

42. Thermann M, Lorenz W, Schmal A, et al. Influența antagoniștilor receptorilor H1-și H2- asupra sistemului circulator și asupra concentrațiilor plasmatice endogene de histamină la câini. Acțiuni ale agenților. 1977;7:97–101. https://doi.org/10.1007/BF01964888.

43. Elmore BO, Bollinger JA, Dooley DM. Diaminoxidaza renală umană: expresie heterologă, purificare și caracterizare. J Biol Inorg Chem. 2002;7:565–79. https://doi.org/10. 1007/s00775-001-0331-1.

44. Duch DS, Bowers SW, Nichol CA. Creșterea nivelurilor de histamină din creier de către inhibitorii diaminopirimidin ai histaminei N-metil transferazei. Biochem Pharmacol. 1978;27:1507–9. https://doi. org/10.1016/0006-2952(78)90109-0.

45. Horton JR, Sawada K, Nishibori M, et al. Baza structurală pentru inhibarea histaminei N-metiltransferazei de către diverse medicamente. J Mol Biol. 2005;353:334–44. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005. 08.040.

46. ​​Horton JR, Sawada K, Nishibori M, et al. Două forme polimorfe de histamină metiltransferază umană: comparații structurale, termice și cinetice. Structura. 2001;9:837–49. https:// doi.org/10.1016/S0969-2126(01)00643-8.

47. Duch DS, Bacchi CJ, Edelstein MP, et al. Inhibitori ai metabolismului histaminei in vitro și in vivo: corelații cu activitatea antitripanosomală. Biochem Pharmacol. 1984;33:1547–53. https:// doi.org/10.1016/0006-2952(84)90426-X.

48. Hox V, Desai A, Bandara G, et al. Estrogenul crește severitatea anafilaxiei la șoarecii femele prin creșterea expresiei endoteliale de oxid nitric sintazei și producția de oxid nitric. J Allergy Clin Immunol. 2015;135:729-736.e5. https://doi.org/ 10.1016/j.jaci.2014.11.003.

49. Packman EW, Rossi GV, Harrisson JWE. Efectul histaminei și antihistaminicelor asupra temperaturii corpului. J Pharm Pharmacol. 1953;5:301–10. https://doi.org/10.1111/j.2042-7158.1953.tb{139 90.x.

50. Morris SC, Perkins C, Potter C, et al. Optimizarea inhibării medicamentoase a anafilaxiei mediate de IgE la șoareci. J Allergy Clin Immunol. 2021;149:671–84. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2021.06.022.

51. Li XM, Serebrisky D, Lee SY, et al. Un model murin de anafilaxie a arahidei: răspunsurile celulelor T și B la un alergen major de arahide imită răspunsurile umane. J Allergy Clin Immunol. 2000;106:150–8. https://doi.org/10.1067/mai.2000.107395.

52. Hasegawa A, Watanabe M, Osada H, et al. Influența glucocorticoizilor asupra variațiilor dependente de timpul zilei în anafilaxia sistemică mediată de factorul activator de IgE, histamină și trombocite la diferite tulpini de șoarece. Biochem Biophys Res Commun. 2018;495:2184–8. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.12.099.

53. Fishel CW, Szentivanyi A, Talmage DW. Sensibilizarea și desensibilizarea șoarecilor la histamină și serotonină prin neuroumori. J Immunol. 1962;89:8–18.

54. Stallons LJ, Whitaker RM, Schnellmann RG. Biogeneza mitocondrială suprimată în leziunea renală acută indusă de acid folic și fibroza precoce. Toxicol Lett. 2014;224:326–32. https://doi. org/10.1016/j.toxlet.2013.11.014.

55. Gludovacz E, Schuetzenberger K, Resch M, et al. Mutațiile motivului de legare a heparinei ale diaminoxidazei umane permit dezvoltarea unui produs biofarmaceutic de degradare a histaminei de prim rang. Elife. 2021;10:e68542. https://doi.org/10.7554/eLife. 68542.

56. Eissa N, Kermarrec L, Hussein H, et al. Adecvarea genelor de referință pentru normalizarea ARN-ului mesager în colita indusă de acid dinitrobenzen sulfonic (DNBS) de șoarece 2, folosind PCR cantitativ în timp real. Sci Rep. 2017;7:42427. https://doi.org/10. 1038/srep42427.

57. Gludovacz E, Maresch D, Bonta M, et al. Caracterizarea diaminoxidazei umane recombinate (rhDAO) produsă în celulele ovarelor de hamster chinezesc (CHO). J Biotechnol. 2016;227:120–30. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.04.002.

58. Boehm T, Karer M, Gludovacz E, et al. Cuantificare simplă, sensibilă și specifică a activității diaminooxidazei în matrice complexe folosind fluorofori nou descoperiți, derivați din substraturi naturale. Infamm Res. 2020;69:937–50. https://doi.org/10. 1007/s00011-020-01359-5.

59. Matsumura Y, Tan EM, Vaughan JH. Hipersensibilitate la histamină și anafilaxia sistemică la șoareci cu blocaj beta-adrenergic farmacologic: protecție prin nucleotide. J Allergy Clin Immunol. 1976;58:387–94. https://doi.org/10.1016/0091- 6749(76)90119-6.

60. Hunter AJ, Murray TK, Jones JA, et al. Farmacologia colinergică a tetrahidroaminoacridinei in vivo și in vitro. Br J Pharmacol. 1989;98:79–86. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381. 1989.tb16865.x.

61. Rabe M, Schaefer F. Modele de șoarece non-transgenice ale bolii renale. Nefron. 2016;133:53–61. https://doi.org/10.1159/00044 5171.

62. Miyamoto Y, Nakano S, Kaneko M, et al. Evaluarea clinică a unui nou inhibitor sintetic de protează în chirurgia pe cord deschis. Efect asupra eliberării serotoninei și histaminei plasmatice și conservării sângelui. ASAIO. 1992;38:M395-8. https://doi.org/10.1097/00002480- 199207000-00063.

63. Oncologie de rasă — oncologie de precizie. https://www.raceoncology. com/. Accesat 23 noiembrie 2021

64. Myers JW, Von Hof DD, Kuhn JG, et al. Reacții anafilactoide asociate cu perfuzii cu bisantren. Investigarea noilor droguri. 1983;1:85–8. https://doi.org/10.1007/BF00180195.

65. Reilly MA, Schayer RW. Studii suplimentare privind catabolismul histaminei in vivo. Br J Pharmacol. 1971;43:349–58.

66. Malinski T, Taha Z, Grunfeld S, et al. Difuzia oxidului nitric în peretele aortei monitorizată in situ de microsenzori porfirinici. Biochem Biophys Res Commun. 1993;193:1076–82. https://doi. org/10.1006/bbrc.1993.1735.

67. Ginsburg M, Wajda I, Waelsch H. Transglutaminase and histamine incorporation in vivo. Biochem Pharmacol. 1963;12:251–64. https://doi.org/10.1016/0006-2952(63)90148-5.

68. Vowinckel J, Stahlberg S, Paulmann N, et al. Histaminilarea reziduurilor de glutamină este o nouă modificare posttranslațională implicată în semnalizarea proteinei G. FEBS Lett. 2012;586:3819–24. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.09.027.

69. McNally W, Roth M, Young R și colab. Determinarea autoradiografică cantitativă a întregului corp a distribuției țesutului tacrin la șobolani după o doză intravenoasă sau orală. Farm Res. 1989;6:924– 32. https://doi.org/10.1023/A:1015933210803.

70. Cumming P, Reiner PB, Vincent SR. Inhibarea histamin-N-metiltransferazei creierului de șobolan de către 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridină (THA). Biochem Pharmacol. 1990;40:1345–50. https://doi.org/10. 1016/0006-2952(90)90402-7.

71. Cavallito JC, Nichol CA, Brenckman WD, et al. Inhibitori liposolubili ai dihidrofolat reductazei. I. Cinetica, distribuția tisulară și gradul de metabolizare a pirimetaminei, metoprenului și etorfinei la șobolan, câine și om. Drug Metab Dispos. 1978;6:329–37.

72. Nishibori M, Oishi R, Itoh Y, et al. 9-Amino-1, 2, 3, 4-Tetrahidroacridina este un inhibitor puternic al histaminei N-metiltransferazei. Jpn J Pharmacol. 1991;55:539–46. https://doi.org/10.1254/jjp.55. 539.

73. Hough LB, Khandelwal JK, Green JP. Inhibarea metabolismului histaminei cerebrale de către metopren. Biochem Pharmacol. 1986;35:307–10. https://doi.org/10.1016/0006-2952(86)90530-7.

74. Kaneko H, Koshi S, Hiraoka T, et al. Inhibarea leziunii post-ischemice de reperfuzie a rinichiului de către diaminoxidază. Biochim Biophys Acta. 1998;1407:193–9. https://doi.org/10.1016/S0925- 4439(98)00039-8.

75. Koshi S, Inoue M, Obayashi H, et al. Inhibarea leziunii post-ischemice de reperfuzie a intestinului subțire de către diaminoxidază. Biochim Biophys Acta. 1991;1075:231–6. https://doi.org/10.1016/ 0304-4165(91)90271-H.

Matthias Karer1 · Marlene Rager‑Resch1 · Teresa Haider2 · Karin Petroczi1 · Elisabeth Gludovacz3 · Nicole Borth3 · Bernd Jilma1 · Thomas Boehm1

1 Departamentul de Farmacologie Clinică, Universitatea de Medicină din Viena, Waehringer Guertel 18-20, 1090 Viena, Austria

2 Departamentul de Neurofiziologie, Centrul de Cercetare a Creierului, Universitatea de Medicină din Viena, Viena, Austria

3 Departamentul de Biotehnologie, Universitatea de Resurse Naturale și Științe ale Vieții, Viena, Austria