Expunerea la gazele de eșapament diesel modifică expresia rețelelor implicate în neurodegenerarea în creierul peștilor zebră Partea 1

Abstract

Bolile neurodegenerative sunt o cauză majoră a dizabilității în lume, dar etiologiile lor rămân în mare măsură evazive. Factorii genetici pot reprezenta doar o minoritate de risc pentru majoritatea acestor tulburări, ceea ce sugerează că factorii de mediu joacă un rol semnificativ în dezvoltarea acestor boli.

Bolile neurodegenerative se referă la un tip de boală care provoacă degenerarea celulelor creierului din diferite motive. Cele obișnuite includ boala Alzheimer, boala Parkinson, boala Huntington etc. Aceste boli afectează neuronii din creier, ducând la afectarea funcției cerebrale și la simptome precum memoria, gândirea și schimbările comportamentale.

Cu toate acestea, nu trebuie să ne pierdem atitudinea pozitivă din cauza acestor boli. Există multe modalități de a ajuta pacienții să îmbunătățească memoria și să amelioreze simptomele. Să aruncăm o privire la câteva dintre aceste metode:

În primul rând, fă niște exerciții fizice. Cercetările arată că activitatea fizică îmbunătățește circulația sângelui în creier și crește eliberarea de substanțe chimice precum dopamina și endorfinele, care ajută la protejarea și îmbunătățirea funcției neuronilor. În același timp, exercițiile fizice pot contribui și la reducerea problemelor precum anxietatea, depresia și insomnia, făcându-i pe pacienți mai plăcut să înfrunte viața.

În al doilea rând, menține relațiile sociale. De asemenea, este foarte important ca rețelele noastre sociale să fie strâns legate de zonele conexe ale creierului, iar interacțiunea socială poate nu numai să reducă stresul, ci și să îmbunătățească sănătatea creierului prin creșterea fericirii, combaterea depresiei și multe altele.

În cele din urmă, mâncați bine și dormiți suficient. Ambele aspecte pot avea efecte importante asupra sănătății creierului. O dietă bună nu trebuie doar să includă suficienți nutrienți, dar trebuie și să evite consumul în mod repetat de prea mult zahăr, grăsimi saturate și colesterol. În plus, somnul suficient poate ajuta la combaterea problemelor de memorie în diferite stadii, în special a bolilor precum boala Alzheimer.

Pe scurt, bolile neurodegenerative nu înseamnă renunțarea la așteptările de viață. Menținând o atitudine pozitivă, este, de asemenea, necesar să se adopte metode științifice și eficiente pentru a îmbunătăți calitatea vieții. Mai multe râs și mai mult soare te vor ajuta să fii sănătos. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche deserticola este un material medicinal tradițional chinezesc care are multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea Cistanche deserticola provine din multiplele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid tanic, polizaharide, glicozide flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului printr-o varietate de căi.

Faceți clic pe cunoaște 10 moduri de a îmbunătăți memoria

Expunerea prelungită la poluarea aerului a fost recent identificată pentru a crește riscul de apariție a bolilor Alzheimer și Parkinson, dar mecanismele moleculare prin care acționează nu sunt bine înțelese.

Embrionii de pește-zebră expuși la extractul de particule de eșapament diesel (DEPe) duc la autofagie disfuncțională și pierderi neuronale. Aici, am expus embrionii de pește zebra la DEPe și am efectuat analize de expresie proteomică și transcriptomică de mare capacitate din creier pentru a identifica căile patogene induse de poluarea aerului. Tratamentul DEPe a modificat mai multe procese biologice și căi de semnalizare relevante pentru procesele neurodegenerative, inclusiv metabolismul xenobiotic, maturarea fagozomului și procesarea amiloidului. Cea mai mare inducție a expresiei genelor în creier a fost în Cyp1A (de peste 30-ori).

Relevanța acestei modificări de expresie a fost confirmată prin blocarea inducției folosind CRISPR/Cas9, ceea ce a dus la o creștere dramatică a sensibilității la toxicitatea DEPe, confirmând că inducerea Cyp1A a fost un mecanism de protecție compensator.

Aceste studii au identificat căi moleculare perturbate care pot contribui la patogeneza afecțiunilor neurodegenerative. În cele din urmă, determinarea bazei moleculare a modului în care poluarea aerului crește riscul de neurodegenerare va ajuta la dezvoltarea terapiilor de modificare a bolii.

Cuvinte cheie

Poluarea aerului · Demență · Boala Parkinson · Boala Alzheimer · Transcriptomica · Proteomica.

Introducere

Poluarea aerului contribuie major la mortalitate și este asociată cu boli respiratorii, boli de inimă, accident vascular cerebral, cancer pulmonar și diabet. Dovezile epidemiologice emergente susțin o legătură între expunerea la poluarea aerului și dezvoltarea bolilor neurodegenerative, inclusiv bolile Alzheimer și Parkinson (AD și PD) (Fu et al. 2019). Există puține cercetări care investighează mecanismele prin care poluarea aerului poate crește riscul de AD și PD, dar puținele care există susțin o relație cauzală (Fu et al. 2019).

Acumularea de incluziuni de proteine ​​în creier este o caracteristică universală a tulburărilor neurodegenerative și este probabil o cale comună care duce la disfuncție neuronală și moarte. De exemplu, formarea structurilor amiloid-beta (A-beta) și tau sunt semnele distinctive patologice ale agregatelor AD și -synuclein (-syn) sau corpii Lewy în PD (Ross și Poirier 2004; Woulfe 2008).

Modificările proteostazei par să sublinieze cel puțin parțial formarea acestor agregate, dar mecanismele precise sunt încă necunoscute și pot varia la indivizi, în funcție de factorii de risc genetici și de mediu. Știm că expresia crescută sau degradarea scăzută a A-betaor -syn poate duce la AD și PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Alte caracteristici comune în tulburările neurodegenerative sunt inflamația și stresul oxidativ. Microglia activată, celulele inflamatorii din SNC, pot fi ușor apreciate în autopsiile creierului AD și PD și contribuie probabil la patogeneza neurodegenerării (Kannarkat et al. 2013). Se crede că această inflamație și posibil disfuncție mitocondrială duc la stres oxidativ, care este, de asemenea, apreciat în creierul autopsiat (Picca și colab. 2020).

Majoritatea studiilor mecaniciste asupra poluării aerului și neurodegenerării până în prezent s-au concentrat pe inflamație (Jayaraj et al. 2017). Poluarea aerului pare să crească atât inflamația SNC, cât și stresul oxidativ în creierul animal și uman (Calderón-Garcidueñas și colab. 2004, 2007, 2008a,b și c; Levesque și colab. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw și colab. 2017; Yokota et al.2013a, b).

De un interes deosebit sunt descoperirile că poluarea aerului crește expresia unor gene inflamatorii în bulbul olfactiv (OB) de șoareci, o regiune a creierului în care patologia PD este observată foarte devreme în boala (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a) . Inflamația a fost, de asemenea, observată la indogi care trăiesc în zonele urbane, comparativ cu cei care trăiesc în zonele rurale, iar autorii au speculat că aceste schimbări s-au datorat nivelurilor ridicate de poluare a aerului (Calderón-Garcidueñas și colab. 2003).

Aceiași autori au sugerat, de asemenea, că -syn s-a acumulat în creierul oamenilor care trăiesc în orașe din cauza poluării aerului (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). Într-un studiu recent într-un model de pește-zebră, sa raportat că expunerea la DEPe provoacă neurotoxicitate și o scădere semnificativă a numărului de neuroni prin perturbarea autofagiei (Barnhill et al. 2020).

DEPe conține multe dintre componentele toxice ale poluării aerului și este utilizat în mod obișnuit pentru a modela expunerea în sistemele de cultură celulară (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autofagia este un mecanism intracelular esențial pentru îndepărtarea și eradicarea proteinelor pliate greșit și a organelelor deteriorate.

Într-adevăr, activitatea autofagică precisă este necesară pentru homeostazia celulară, iar autofagia disfuncțională în neuroni duce la supraviețuire alterată și la neurodegenerare (Kesidou et al. 2013). Există limitări clare în multe dintre aceste studii, dar toate sugerează că expunerea la poluarea aerului crește riscul de AD. și PD. Înțelegerea noastră a mecanismelor prin care poluarea crește acest risc este limitată, dar particulele ultrafine și mai multe componente ale poluării aerului pot pătrunde în creier fie direct prin bulbul olfactiv, fie prin plămâni prin fluxul sanguin (Kilian și Kitazawa 2018).

Aceste particule sunt compuse din miez de acarbon și compuși adsorbiți, cum ar fi hidrocarburi aromatice policiclice, metale, nitrat, sulfat și alte elemente și constituie o proporție semnificativă a poluanților atmosferici, în special în zonele urbane. Mulți dintre acești compuși au fost implicați stresul oxidativ și celular. toxicitatea adăugând plauzibilitate unei asocieri cauzale a poluării aerului și a neurodegenerarii.

Investigațiile multidisciplinare detaliate, inclusiv modele celulare și animale, pot oferi o perspectivă asupra cauzelor bolii și pot direcționa abordările terapeutice viitoare (Cannon și Greenamyre 2011). Printre organismele model utilizate pentru studii in vivo, Danio rerio (peste zebra) este un model puternic pentru studierea toxicologiei, geneticii moleculare, toxicogenomica si descoperirea medicamentelor.

Majoritatea căilor biologice sunt foarte conservate la vertebrate, iar majoritatea genelor umane funcționale au omologi la peștele-zebră (Vaz et al.2018). În plus, embrionii de pește zebra se dezvoltă rapid și independent, permițând analiza în orice stadiu de dezvoltare dorit. Aceste caracteristici, împreună cu reproducerea rapidă și costul scăzut al creșterii, fac peștele-zebră un model favorabil pentru studierea efectelor toxice ale expunerii mediului.

Pentru a înțelege mai bine mecanismele moleculare din spatele patogenezei bolii, au fost dezvoltate o gamă largă de abordări de profilare a expresiei genice de mare debit. Proteomica bazată pe spectrometrie de masă și secvențierea ARN de mare randament sunt deosebit de promițătoare în identificarea căilor biologice de interes. Aceste tehnici au fost utilizate pe scară largă pentru a înțelege răspunsul modelelor celulare și animale la stimulii de mediu (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

În acest studiu, am urmărit analize de expresie ale efectelor tratamentului DEPe atât asupra profilurilor proteomului, cât și asupra transcriptomului din capetele embrionilor de pește zebră. Izolarea probelor din cap, care este compus în principal din țesut cerebral, a permis obținerea mai multor profiluri specifice țesutului și reducerea la minimum a efectelor care provin din alte țesuturi. Descriem aici expresia genică și profilele proteinelor modificate în mai multe căi implicate în neurodegenerarea în capetele peștilor zebra expuși la DEPe. Aceste rezultate oferă noi perspective asupra posibilelor mecanisme prin care poluarea aerului crește riscul de AD și PD.

Material si metode

Tratamentul cu pește și CRISPR/Cas{0}}geneknockdown mediat

Toate studiile au fost aprobate de Comitetul pentru Drepturile Animalelor UCLA. Peștii zebra (AB) au fost crescuți prin stimulare luminoasă timp de 1 oră și un număr total de 200 de ouă au fost incubate timp de 24 de ore la 28 de grade. Embrionii rezultați au fost dechorioonați în pronază (2 mg/ml) și tratați fie cu DEPe (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) la o concentrație finală de 20 ug/ml sau vehicul până la 5 zile post-fertilizare (DPF).

Această concentrație a fost selectată deoarece a dus la pierderea neuronilor, așa cum s-a raportat anterior, dar fără o mortalitate semnificativă (Barnhillet al. 2020). Peștele knockdown Cyp1A a fost preparat după cum urmează. Folosind instrumente disponibile la http://crispr.mit.edu, ARN-ul CRISPR (Cyp1A-crRNA). ) a fost proiectat pe baza locației site-urilor PAM adecvate în primul exon al genei Cyp1A.

Cel mai bun design a fost achiziționat de la IDT DNA (www.idtdna.com) împreună cu standardul CRISPR-Cas9 tracrRNA. ARNcr pentru Cyp1Agene și tracrRNA au fost resuspendate separat în 10 mM Tris-EDTA pentru a produce o concentrație finală de 100 μM. Apoi, tracrARN a fost combinat cu crRNAin 1 x tampon duplex (100 mM acetat de potasiu; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT ADN) pentru a produce o concentrație finală de 10 μM. Amestecul a fost încălzit la 95 de grade timp de 5 minute într-o baie de apă clocotită și răcit lent la temperatura camerei pentru a permite recoacerea secvențelor de nucleotide complementare incrRNA și tracrRNA și formarea ARN-ului ghid funcțional (gARN).

Un volum de 3 μL de ARNg recoat a fost apoi combinat cu același volum al unui ADN donor monocatenar (ssDNA; 200 μM) ca secvența șablon pentru Cyp1A mutantă. O cantitate de 3 ug de Cas9 Nuclează (IDT) în tampon de injecție 1 x (5 mM KCI; fosfat de sodiu 0,1 M, pH 6,8) a fost adăugată la amestec pentru a forma complexele finale CRISPR/Cas9ribonucleoproteină (Cyp1A-RNP).

Pentru prepararea Scramble RNP (SC-RNP), ARNcr Cyp1A specific a fost înlocuit cu un ARNcr Scramble comercial fără țintă pe genom. Această secvență a tuturor oligonucleotidelor utilizate în această lucrare este listată în Tabelul suplimentar 1. Ouăle au fost injectate sub un stereomicroscop cu aproximativ 3 nL de amestec de injecție RNP.

Au fost efectuate cinci injecții replicate biologice (fiecare replicat a inclus 400-600 de ouă injectate cu Cyp1A-RNP și 100-200 injectate cu SC-RNP) și toate microinjecțiile au fost finalizate în 60 de minute. Ouăle au fost plasate în vase Petri de plastic de 100 mm și incubate la 28 de grade în apă cu ou. Rata de supraviețuire a embrionilor a fost monitorizată timp de până la 7 zile.

Imaginile peștilor supraviețuitori au fost revizuite pentru a marca malformația. Fiecare larvă a primit un punctaj în orb pentru prezența a 4 malformații de dezvoltare, inclusiv malformații ale capului, malformații ale cozii, edem cardiac și edem gălbenuș. Testul T statistic a fost utilizat pentru a evalua diferențele semnificative.

For more information:1950477648nn@gmail.com