Controlul diferențial al celulelor T Treg și efectoare umane în imunitatea tumorală prin anticorpi anti-CTLA-4 realizat de Fc

mAb anti-CTLA-4 este eficient în creșterea imunității tumorale la om. CTLA-4 este exprimat de celulele T convenționale la activare și de celulele FOXP3 plus CD4 plus Treg care apar în mod constitutiv, ridicând întrebarea cum mAb anti-CTLA-4 poate controla diferențial aceste populații de celule T opuse funcțional în imunitatea tumorii. Aici arătăm că celulele Treg efectoare puternic supresoare FOXP3 au fost abundente în țesuturile melanomului, exprimând CTLA-4 la niveluri mai mari decât celulele CD8 plus T cu infiltrare tumorală. La stimularea antigenului tumoral in vitro a celulelor mononucleare din sângele periferic de la indivizi sănătoși sau de la pacienți cu melanom, mAb anti-CTLA-4 modificat în regiune Fc cu citotoxicitate mediată celulară dependentă de anticorpi (ADCC) și fagocitoză celulară (ADCP) ) activitatea a epuizat selectiv CTLA-4 plus FOXP3 plus celule Treg și, în consecință, a extins celulele CD8 plus T specifice antigenului tumoral.

Este important că expansiunea a avut loc numai atunci când stimularea antigenului a fost întârziată cu câteva zile de la tratamentul cu anticorpi pentru a economisi CTLA-4 plus CD8 efector activat plus celulele T de la uciderea mediată de mAb. În mod similar, la șoarecii purtători de tumori, tratamentul cu mAb anti-CTLA-4 cu ADCC/ADCP ridicat cu vaccinare întârziată cu antigen tumoral le-a prelungit în mod semnificativ supraviețuirea și a crescut semnificativ producția de citokine prin celulele CD8 plus T cu infiltrare tumorală, în timp ce tratamentul cu anticorpi concomitent cu vaccinarea nu a făcut-o. Anti-CTLA4 mAb modificat pentru a prezenta o activitate mai mică sau deloc de legare a Fc nu a reușit să prezinte o astfel de creștere a imunității in vitro și in vivo dependentă de sincronizare. Astfel, mAb anti-CTLA-4 ADCC ridicat poate să epuizeze selectiv celulele Treg efectoare și să evoce imunitatea tumorală în funcție de CTLA-4-exprimând starea celulelor efectoare CD8 plus T. Aceste descoperiri sunt esențiale în proiectarea imunoterapiei pentru cancer cu mAbs care vizează moleculele exprimate în mod obișnuit de FOXP3 plus celulele Treg și celulele T efectoare reactive la tumori.

Celulele T reglatoare|CTLA-4|FOXP3|imunoterapia cancerului|citotoxicitate mediată celular dependentă de anticorpi.

Celulele CD25 plus CD4 plus Treg care apar în mod natural, care exprimă factorul de transcripție FOXP3, joacă roluri indispensabile în menținerea autotoleranței imunologice și a homeostaziei (1). Cu toate acestea, ele împiedică, de asemenea, răspunsurile imune eficiente împotriva celulelor tumorale care decurg din sine, așa cum este ilustrat de constatările că tumorile de șoarece pot fi eradicate pur și simplu prin epuizarea celulelor Treg (2-5).

La om, există dovezi acumulate pentru infiltrarea abundentă a celulelor Treg în diferite țesuturi tumorale (6-8) și o corelație semnificativă între infiltrarea Treg și prognosticul nefavorabil în diferite tipuri de cancer (9). Controlul celulelor Treg în țesuturile tumorale este, prin urmare, probabil să fie o modalitate promițătoare de evocare a imunității tumorale eficace la pacienții cu cancer.

Pentru antitumoral, am constatat că Cistanche deserticola are un efect antitumoral evident în cercetarea pe șobolani. 3 Componentele polizaharide din Cistanche deserticola pot îmbunătăți funcția imunitară a organismului, promovează activarea celulelor albe din sânge, îmbunătățesc starea imunitară a organismului și pot acționa direct asupra celulelor tumorale. Inhiba proliferarea, metastaza și invazia celulelor tumorale. De asemenea, inhibă angiogeneza. Creșterea tumorii și metastazele au nevoie de sprijinul creșterii noilor vase de sânge, iar componentele polizaharide din Cistanche pot inhiba angiogeneza, reducând astfel creșterea tumorii și metastazele.

Click aici pentru a cumpăra cistanche

Celulele T CD4 plus care exprimă FOXP3-umane au funcții eterogene, inclusiv celulele Treg și celulele T convenționale nesupresive. Ele pot fi fracționate în trei subpopulații prin nivelurile lor diferite de expresie ale FOXP3 și CD45RA (10) (Fig. 1A): (i) CD45RA plus celule Treg naive/repaus FOXP3lo [Fracție (Fr). I];(ii) celule Treg (Treg) efectoare CD45RA-FOXP3hi (Fr. II), care sunt diferențiate terminal și foarte supresive; și (iii) celule non-Treg CD45RA-FOXP3lo (Fr. III), care nu au activitate supresoare și sunt capabile să secrete citokine proinflamatorii. La stimularea antigenică, pr. Celulele Treg naive se diferențiază în Fr. II Celulele Treg, care exprimă puternic CTLA-4 (10).

Fig. 1. Expresia preferențială a CTLA-4 de către celulele FOXP3hi Treg în țesutul melanomului. (A și B) Grafice reprezentative ale colorării cu celule T CD4 plus (A) și frecvențele fiecărei fracțiuni (B). PBMC ale donatorilor sănătoși (HD, n=5) și PBMC și TIL ale pacienților cu melanom (n=11 și, respectiv, 14) au fost supuse colorării directe pentru CD4, CD45RA și FOXP3. (C și D) Grafice reprezentative ale expresiei CCR7 și CD45RA de către celulele CD8 plus T (C) și rezumatul fiecărui subset de celule CD8 plus T (D). (E) clustere care exprimă CTLA-4 (linie punctată) în PBMC și TIL de la pacienții cu melanom prin analiza CyTOF. Sunt prezentate grafice viSNE ale celulelor T CD4 plus și CD8 plus cu hărți termice pentru nivelurile de expresie a markerului indicate (n=2). (F) Numai suprafața sau colorarea de suprafață și intracelulară a CTLA-4 în PBMC HD. (G) Expresii de suprafață CTLA-4 de către fiecare fracțiune celulară din TIL și PBMC ale pacienților cu melanom. Mijloace ± SEM. *P mai mic sau egal cu {{20}}.05, **P mai mic sau egal cu 0,01, ***P mai mic sau egal cu 0,001 și ****P Mai mică sau egală cu 0,0001 prin ANOVA unidirecțională cu testul HSD al lui Tukey post-hoc.

Deși majoritatea celulelor din pr. III sunt celule non-Treg și nu se diferențiază în Fr. II Celulele eTreg, un subset circulant de celule reglatoare T-foliculare, care sunt CXCR5 plus CD45RA-, este inclus în Fr. III (11), indicând eterogenitatea pr. III populaţie. În contrast, cu prezența acestor trei populații FOXP3 plus în sânge, majoritatea tumorilor prezintă infiltrare predominantă a celulelor Treg, care par a suprima răspunsurile imune antitumorale eficiente la pacienții cu cancer (12). Aceste descoperiri sugerează că epuizarea/reducerea celulelor Treg în tumori și ganglionii limfatici regionali este esențială în evocarea și creșterea răspunsurilor imune antitumorale, așa cum s-a demonstrat recent cu unii anticorpi monoclonali (mAb) specifici pentru moleculele exprimate în mod specific de celulele Treg (13).

CTLA-4 este exprimat de celulele T convenționale la activare și de către FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus celulele Treg în mod constitutiv. Joacă un rol cheie în suprimarea mediată de Treg, cel puțin parțial, prin controlul exprimării CD80/CD86 de către celulele prezentatoare de antigen (APC) (14-16). mAb anti-uman CTLA-4, care este eficient din punct de vedere clinic în tratarea melanomului (17, 18), sa considerat inițial că blochează semnalul negativ mediat de CTLA-4 în celulele T efectoare activate, susținând starea lor activată în ataca celulele tumorale. Cu toate acestea, studii preclinice recente au arătat că mAb anti-CTLA-4 poate epuiza celulele FOXP3 plus Treg, în special în țesuturile tumorale, crescând astfel imunitatea tumorii (19-21). La om, totuși, este controversat dacă mAb CTLA-4 afectează numărul sau funcția celulelor Treg sau a celulelor T efectoare, sau ambele, în îmbunătățirea răspunsurilor imune antitumorale în contexte clinice.

În acest studiu, am investigat in vivo și in vitro, la oameni și șoareci, efectele mAb-urilor anti-CTLA-4 modificate cu Fc asupra celulelor FOXP3 plus Treg și a celulelor CD8 plus T specifice auto/tumoral. Arătăm că mAb anti-CTLA-4 care epuizează celulele cu activitate de citotoxicitate mediată celulară dependentă de anticorpi (ADCC) poate evoca răspunsuri imune antitumorale în funcție de nivelurile și cinetica expresiei CTLA-4 de către doua populatii. Rezultatele pot fi extinse la mAbs care epuizează celulele care vizează alte molecule de suprafață celulară pe care atât celulele Treg, cât și celulele efectoare T (Teff) le exprimă în mod obișnuit la diferite niveluri și cu cinetici diferite.

Semnificaţie

Anti-CTLA-4 mAb poate crește imunitatea tumorii în ciuda expresiei CTLA-4 prin populații de celule T opuse funcțional: celule T efectoare activate (Teff) și FOXP3 plus CD4 plus celule Treg. Aici arătăm că mAb anti-CTLA-4 a fost conceput pentru a fi celule Treg epuizate citotoxice în mod eficient in vitro la oameni și in vivo la șoareci. A extins celulele CD8 plus Teff specifice antigenului atunci când stimularea antigenului tumoral a fost amânată cu câteva zile pentru a le proteja de uciderea de către mAb. Anti-CTLA-4 mAb modificat pentru a prezenta o activitate de epuizare celulară mai mică sau nu a reușit să arate astfel de efecte. Această strategie de control diferențial al celulelor Treg și Teff prin mAb citotoxic anti-CTLA-4 pentru a evoca o imunitate tumorală eficientă va ajuta la proiectarea imunoterapiei împotriva cancerului care vizează alte molecule exprimate în mod obișnuit de celulele Treg și Teff.

Contribuții ale autorului: cercetarea concepută de DH, A. Tanaka, HN și SS; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA și IK au efectuat cercetări; A. Tanemura a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; Datele analizate DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN și SS; și DH, A. Tanaka și SS au scris lucrarea.

Revizori: MA, Universitatea de Medicină și Stomatologie din Tokyo; și SAQ, University College London.

Declarație privind conflictul de interese: HN a primit un grant de cercetare de la Bristol Myers Squibb. SS a primit un grant de cercetare de la Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK este angajat de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. care a furnizat unii dintre anticorpii utilizați în acest studiu.

Publicat sub licență PNAS.

1 Adresă actuală: Departamentul de Imunologie, Școala Absolventă de Medicină, Universitatea Nagoya, 466-8550 Nagoya, Japonia.

2 Adresa actuală: Departamentul de Imunologie, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Adresa actuală: Divizia de Imunologie Cancerului, Centrul de Cercetare în Oncologie Explorativă și Studii Clinice, Centrul Național al Cancerului, 277-8577 Kashiwa, Japonia.

4 Cui trebuie adresată corespondența. E-mail: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Publicat online pe 26 decembrie 2018.

Rezultate

Acumularea de CTLA-4-exprimând celule FOXP3hi Treg diferențiate terminal în țesuturile melanomului.

Am evaluat mai întâi frecvența diferitelor subpopulații de celule T în rândul limfocitelor infiltrante tumorale (TIL) la pacienții cu melanom. Celulele CD45RA− FOXP3hi eTreg (Fr. II) au fost predominant (de ∼10-ori) crescute în raport între CD4 plus TIL, în comparație cu celulele CD4 plus T din sângele periferic la donatorii sănătoși sau la pacienții cu melanom (Fig. 1 A și B ). Frecvența CD45RA− FOXP3lo Fr. Celulele III non-Treg au crescut ușor (de aproximativ două ori) printre CD4 plus TIL. În schimb, celulele Treg naive CD45RA plus FOXP3lo (Fr. I) au fost reduse semnificativ în TIL-uri la un sfert, în medie, din fracția corespunzătoare din celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC).

Printre celulele T CD4 plus convenționale FOXP3 în TIL, celulele CD4 plus T efectoare/memorie CD45RA-FOXP3, care ar putea fi disecate în continuare în populațiile CD25 plus (Fr. IV) și CD25- (Fr. V) (10) , a crescut ușor (~1,3-ori, în timp ce CD45RA plus FOXP3-naive CD4 plus celule T (Fr. VI) s-au redus semnificativ la o zecime din cele din PBMC. În fracția de celule T CD8 plus a TIL, în comparație cu PBMC ale pacienților sau donatorilor sănătoși, a existat o creștere semnificativă (~1,6-ori) a celulelor T de memorie efectoare CD45RA-CCR7-(TEM), cu o scădere semnificativă a celulelor CD45RA plus CCR7 plus naive și CD45RA plus CCR7− celulele de memorie efector diferențiat terminal (TEMRA) la jumătate și, respectiv, o cincime din cele din PBMC și nicio modificare semnificativă a CD45RA− CCR7 plus memoria centrală T (TCM) celule (Fig. 1 C și D). S-a observat, de asemenea, la pacienții cu melanom că celulele CD8 plus T naive din PBMC au scăzut semnificativ (de ∼14-ori) în comparație cu donatorii sănătoși.

Apoi am evaluat care populație de celule T a exprimat CTLA-4 în TIL-uri sau PBMC-uri ale pacienților cu melanom prin citometrie prin citometru cu spectrometrie de masă cu timp de zbor (CyTOF) (Fig. 1E și apendicele SI, Fig. S1A). Clusterul de celule CD4 plus CD45RA− Foxp3hi, reprezentând Fr. Celulele eTreg II, au exprimat predominant CTLA4 în PBMC și TIL, în timp ce celulele CD8 plus T au exprimat cu greu CTLA-4 fie în PBMC, fie în TIL. La șoareci, expresia predominantă a CTLA4 de către celulele FOXP3 plus Treg a fost observată în mod similar în splină și țesutul tumoral CMS5a (Anexa SI, Fig. S1B). CTLA4 exprimat de către uman Fr. II Celulele Treg au fost în mare parte în compartimentul intracelular și CTLA de la suprafața celulară -4 a fost limitat (Fig. 1F). Cu toate acestea, în TIL, celulele Treg și, într-o măsură mai mică, Fr. S-a descoperit că celulele III non-Treg exprimă CTLA de suprafață-4 la niveluri semnificativ ridicate (Fig. 1G și apendicele SI, Fig. S2). TIL CD8 plus celulele TCM și TEM au exprimat, de asemenea, un nivel mai ridicat de CTLA de suprafață-4 în comparație cu oricare dintre fracțiile de celule T circulante, deși celulele Treg au arătat o expresie mult mai mare la pacienții cu melanom (Fig. 1G și apendicele SI, Fig. S2).

Luate împreună, caracteristicile cardinale ale țesuturilor melanomului uman sunt o creștere și o scădere marcată a celulelor Treg și, respectiv, a celulelor Treg naive și o creștere marcată a celulelor CD8 plus T efectoare/memory cu o reducere a celulelor CD8 plus T naive. Aceste celule Treg și celule CD8 plus T din TIL-uri exprimă CTLA-4 pe suprafața celulei, cu o expresie mai mare de către primele decât cele din urmă. Spre deosebire de celulele eTreg TIL, celulele eTreg circulante la pacienții cu melanom sunt semnificativ mai scăzute în nivelul de expresie a CTLA4 de suprafață, sugerând că acestea pot fi mai puțin afectate de tratamentul mAb anti-CTLA-4.

Reducerea atât a celulelor Treg, cât și a celulelor CD8 plus T specifice antigenului prin tratamentul in vitro cu mAb anti-CTLA{3}} care epuizează celulele și stimularea antigenului concomitent.

Pentru a stabili dacă efectele antitumorale ale mAb anti-CTLA-4 s-ar baza pe capacitatea sa de a epuiza celulele Treg prin ADCC, am modificat porțiunea Fc a mAb anti-CTLA-4 IgG1 (clona MDX{{3 }}, ipilimumab), care poseda o activitate ADCC moderată, pentru a-și schimba afinitatea pentru Fc RIIIa (CD16a), un Fc R activator exprimat de celule NK, monocite/macrofage și alte celule (22) (Fig. 2A). Un mAb anti-CTLA-4 generat astfel cu o activitate ADCC ridicată, pe care l-am numit tehnologie de reinginerie asimetrică-domeniu Fc (ART-Fc), a avut substituții diferite de aminoacizi pe fiecare lanț greu (23); adică substituții L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A într-o regiune Fc cu lanț greu și substituții D270E/K326D/A330M/K334E în cealaltă. AcM reconstruit a arătat o afinitate de legare de 1,000-ori mai mare pentru Fc RIIIa uman decât mAb nemodificat, fără a crește afinitatea pentru Fc RIIb inhibitor. De asemenea, am generat un mAb anti-CTLA-4 care abia se leagă de Fc Rs, pe care l-am numit anti-CTLA-4 silențios, prin substituții de aminoacizi; adică L235R, G236R și S239K în regiunea Fc a ambelor lanțuri grele. În comparație cu mAb anti-CTLA-4 Fc nemodificat sau silențios, ART-Fc a arătat o citotoxicitate mult mai mare in vitro pentru celulele CTLA-4 - care exprimă ovar de hamster chinezesc (CHO) în prezența PBMC de la donatori sănătoși , cu citotoxicitate crescută prin incubație mai lungă (Fig. 2B). În mod similar, mAb anti-CTLA-4 ART-Fc a ucis efectiv Fr. proaspăt preparat. II Celulele Treg și, într-o măsură mai mică, pr. III non-Treg sau Fr. Celulele Treg naive, în timp ce IgG1 (ipilimumab) sau mAb Fc silențios abia au prezentat activitate de distrugere (Fig. 2C).

Apoi, am evaluat efectele acestor mAb-uri proiectate cu Fc asupra expansiunii specifice antigenului in vitro a celulelor CD8 plus T prin stimularea PBMC-urilor de la HLA-A*0201 – care exprimă donatori sănătoși sau pacienți cu melanom timp de 9 zile cu diferite peptide, de exemplu: derivat din Melan-A/MART-1, un antigen auto/tumoral exprimat de melanocite normale și unele celule de melanom (24); și NY-ESO-1, antigen de cancer/testicul exprimat de diferite tipuri de celule canceroase și celule germinale umane (25), citomegalovirus (CMV) sau virus gripal (gripă). Această stimulare a peptidei in vitro, de exemplu de către peptida Melan-A, a menținut expresia ridicată a CTLA4 de către celulele Treg (Fig. 2D și apendicele SI, Fig. S3). Numai stimularea peptidică a extins, de asemenea, tetramerul specific peptidei (Tet) plus celulele CD8 plus T, care au exprimat niveluri mai mari de CTLA-4, în special pe suprafața celulei, în comparație cu celulele Tet- (Fig. 2 E, F, și eu). Când mAb anti-CTLA-4 ART-Fc a fost prezent de la începutul stimulării peptidice a PBMC de la donatori sănătoși sau de la pacienți cu melanom, raportul dintre celulele Treg care exprimă CTLA-4 printre celulele CD4 plus T a fost redus semnificativ într-o manieră dependentă de doză, în timp ce mAb Fc silențios nu a reușit să prezinte acest efect (Fig. 2 D și Apendicele G și SI, Figurile S4 și S5).

Cu toate acestea, reducerea celulelor Treg nu a însoțit expansiunea celulelor CD8 plus T specifice antigenului; mai degrabă, tratamentul a provocat o reducere profundă a raportului dintre celulele Tet plus CD8 plus T între celulele CD8 plus T (Fig. 2H). În aceste stimulări in vitro, mAb anti-CTLA-4 IgG1 nemodificat sau Fc silentios nu au prezentat activitate semnificativă de epuizare a eTreg (Fig. 2I). Gradul de reducere a celulelor eTreg de către acești mAb a fost într-adevăr corelat cu reducerea celulelor CD8 plus T specifice antigenului, indiferent de antigenul de stimulare, de exemplu, peptida Melan-A sau CMV (Fig. 2I).

Astfel, în timp ce celulele Treg exprimă constitutiv CTLA-4, în special CTLA-4 intracelular, stimularea antigenului extinde celulele CD8 plus T care exprimă niveluri ridicate de CTLA-4, în special pe suprafața celulei. ART-Fc anti-CTLA-4 mAb cu activitate ADCC ridicată este, prin urmare, capabil să epuizeze nu numai CTLA-4 plus celulele Treg, ci și CTLA-4 activat de antigen plus CD8 plus celulele T . Acest efector CD8 plus epuizarea celulelor T poate compensa un efect de îmbunătățire a sistemului imunitar al epuizării celulelor eTreg în răspunsurile imune in vitro.

Fig. 2. Stimularea concomitentă a peptidei in vitro cu mAb ART-Fc anti-CTLA-4 restrânge răspunsurile celulelor T CD8 plus specifice antigenului. (A) Rezumatul substituțiilor de aminoacizi efectuate în porțiunea Fc a mAb anti-uman CTLA-4 IgG1 (clona MDX{-010, ipilimumab) pentru a genera mAb-uri ART-Fc sau Fc silentioase și afinitățile acestora la Fc RIIb inhibitor sau la Fc RIIIa activator. Afinitatea mAb Fc silențioasă a fost sub limita de detecție a testului BIACORE. (B) Activitatea ADCC a diferitelor mAb anti-CTLA4 împotriva celulelor CHO care exprimă CTLA-4 umane. Anti-CTLA-4 mAb (ART, ADCC-enhanced anti-CTLA{-4 ART-Fc; IgG1, convențional nemodificat anti-CTLA{-4 IgG1; Silențios, anti-inactivat de regiune Fc; CTLA-4 silent-Fc) au fost incubate cu celule CHO și HD PBMC (n=3) la un raport E/T de 5{0:1. Mijloace ± SEM. Asteriscurile indică diferențe semnificative între fiecare anticorp și Fc silențios la concentrațiile respective pentru culturi de {{3{0}}h (negru) sau 24-h (roșu). (C) Activitate ADCC la fiecare fracțiune celulară a celulelor T CD4 plus și CD8 plus din PBMC-uri prin mAb-uri ART-Fc, IgG1 sau Fc silențios anti-CTLA-4 (n=4 sau 5). Frecvențele celulelor moarte printre celulele preetichetate CTV după cultura de {{40}}h este indicată. (D) Expresia CTLA-4 de Fr. II Celulele Treg după 9 zile de stimulare cu peptida Melan-A și 1 ug/mL ART-Fc, Fc silent sau IgG1 anti-CTLA-4 tratament cu mAb la PBMC întregi (n {{50 }}). (E și F) Expresii de suprafață CTLA-4 de către celulele T Tet plus și Tet− CD8 plus după stimulările peptidice indicate. Histograme reprezentative (E) și rezumatul intensității medii a fluorescenței (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Gripe, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G și H) Grafice și frecvențe reprezentative ale lui Fr. II celule eTreg (G) și celule CD8 plus T (H) specifice antigenului de la HD (n=6) sau pacienți cu melanom (n=5) după cultura cu peptida indicată și 1 ug/mL ART -Fc anti–CTLA-4 mAb ca în D. (I) Cuantificarea frecvenței celulelor Treg (Super) și Tet plus CD8 plus celule T (Inferioare) după 9 zile de stimulare a antigenului Melan-A sau CMV la PBMC HD cu mAbs anti-CTLA-4 indicați în G și H. Mijloace ± SEM. Semnificația ilustrată între cele două grupuri a fost calculată utilizând testul t pereche, ANOVA unidirecțional sau ANOVA cu două sensuri cu testul HSD al lui Tukey post hoc. *P mai mic sau egal cu 0,05, **P mai mic sau egal cu 0,01, ***P mai mic sau egal cu 0,001 și ****P mai mic sau egal cu 0,0001.

Expansiunea robustă a celulelor CD8 plus T specifice antigenului prin epuizarea celulelor eTreg înainte de stimularea antigenului.

. În continuare, am încercat să epuizăm celulele CTLA-4 plus Treg înainte de stimularea antigenului pentru a preveni CTLA-4-exprimând CD8 plus celulele T activate de antigen de la distrugerea de către mAb anti-CTLA-4. Am cultivat PBMC întregi de la donatori sănătoși sau de la pacienți cu melanom în prezența mAb ART-Fc anti-CTLA-4 timp de 5 zile fără stimulare cu antigen, am îndepărtat mAb, apoi am stimulat celulele cu diverse peptide timp de 8 zile și le-am analizat pentru raportul dintre celulele Treg și Tet plus CD8 plus celulele T dintre celulele CD4 plus T sau, respectiv, CD8 plus celulele T (Fig. 3A). Raportul celulelor FOXP3hi Treg a fost redus semnificativ în 5 zile prin pretratamentul ART-Fc (Fig. 3A și apendicele SI, Fig. S6) și menținut la un nivel scăzut în timpul stimulării peptidice ulterioare (Fig. 3B), indicând faptul că Treg. celulele nu s-au recuperat complet în timpul perioadei de stimulare a antigenului. Acest pretratament ART-Fc combinat cu stimularea antigenului a indus o expansiune robustă a celulelor T CD8 plus Melan-A-specifice de la PBMC donatori sănătoși și a celulelor CD8 plus T specifice NY-ESO-1 de la PBMC ale pacienților ale căror țesuturi de melanom au exprimat NY-ESO-1 (Fig. 3C). Celulele CD8 plus T specifice CMV nu au fost foarte afectate de epuizarea Treg mediată de ART-Fc. Spre deosebire de ART-Fc, mAb anti-CTLA-4 silent-Fc nu a modificat frecvența celulelor Treg și nu a reușit să extindă celulele Tet plus CD8 plus T, indiferent de speciile de antigen (Fig. 3D).

Unul dintre diferitele mecanisme de suprimare utilizate de celulele Treg este reglarea în jos dependentă de CTLA-4 a exprimării CD80 și CD86 de către celulele dendritice (DC) (14, 15). Pentru a investiga posibilele contribuții ale acestui mecanism la extinderea celulelor CD8 plus T specifice antigenului auto/tumoral după tratamentul in vitro cu mAb ART-Fc anti-CTLA-4, am evaluat expresia CD80 și CD86 prin DC, care au fost definite fenotipic ca Lin-1− CD11c plus HLA-DR plus, în PBMC donatori sănătoși. Atât expresia CD80, cât și CD86 au prezentat o reglare ascendentă distinctă în grupul pretratat cu ART-Fc, spre deosebire de expresia CD80/CD86 nemodificată într-un Fc pretratat cu IgG1- nemodificat, pretratat –grup pretratat sau netratat (Fig. 3E). În plus, gradul de afinități de legare la Fc R al mAb-urilor a avut o corelație bună cu activitatea lor de epuizare Treg și, de asemenea, cu Tet plus CD8 plus activitatea de inducere a celulelor T (Fig. 3F). Deoarece simpla blocare a CTLA-4 de către Fc silențios nu a suprareglat CD80/86, rezultatele au indicat că epuizarea Treg de către ART-Fc a activat DC, deși există posibilitatea ca ART-Fc în sine să poată fi contribuie în plus la activarea DC-urilor prin legarea cu afinitate ridicată la receptorii lor Fc activatori.

Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că epuizarea Treg de către mAb ART-Fc anti-CTLA-4 cu câteva zile înainte de expunerea la antigen poate preveni distrugerea celulelor CTLA-4 plus CD8 plus T activate de antigen de către anticorp, extinzându-le, cel puțin parțial, prin îmbunătățirea expresiei CD80/CD86 de către APC-uri.

Fig. 3. Predepleția celulelor Treg utilizând mAb anti-CTLA-4 ART-Fc îmbunătățește răspunsurile CD8 plus CD8, specifice antigenului auto/tumoral. (A-D) Celulele CD8 plus T specifice antigenului au fost induse din PBMC întregi ale HD-urilor (n=7) sau pacienților (n=5) ​​după 5 zile de pretratament cu ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Schema experimentului și colorarea reprezentativă cu FOXP3 și CD45RA a celulelor CD4 plus T în ziua -5 și ziua 0 a experimentului. Rezumatul pr. II frecvențe eTreg în ziua 0 (jos). (B și C) Colorare reprezentativă FOXP3 a celulelor CD4 plus T (B) și a celulelor CD8 plus T specifice antigenului (C) cu sau fără pretratament ART-Fc pentru fiecare peptidă după cultură. Rezumatul frecvențelor de celule Treg și antigen-specific CD8 plus T după cultură (partea de jos). (D) Rezumatul pr. II eTreg și Tet plus frecvențele celulelor T CD8 plus cu pretratament mAb anti-CTLA-4 Fc silențios în loc de ART-Fc ca în A-C. (E) Nivelurile de expresie ale CD80 și CD{86 de către Lin{-1-CD11c plus HLA-DR plus DC după 5 zile de stimulare Melan-A cu pretratamentul anti-CTLA indicat -4 mAbs (n=6). Cifrele de pe histograme arată MFI. (F) Rezumatul frecvențelor Treg și Tet plus CD8 plus celulele T după pretratamentul cu mAbs anti-CTLA-4 indicați urmat de stimularea Melan-A26-35 ca în A-C. Mijloace ± SEM. Semnificația reprezentată între cele două grupuri a fost calculată folosind testul t pereche. *P mai mic sau egal cu 0,05.

CTLA-4–Depleția Treg mediată înainte de vaccinarea antigenului tumoral îmbunătățește răspunsurile antitumorale la șoareci.

Pentru a valida la șoareci constatările in vitro cu PBMC-uri umane și mAb-uri CTLA-4 anti-umane, am generat mAb-uri cu un ADCC ridicat sau scăzut și activitate de fagocitoză celulară dependentă de anticorpi (ADCP) din CTLA{{4} anti-șoarece. }} mAb (clona UC10) al izotipului IgG2a (numit în continuare mIgG2a) prin substituirea aminoacizilor în domeniul Fc (Fig. 4A). Mutația S239D în ambele lanțuri grele a crescut afinitatea pentru Fc RIV de șoarece de aproximativ șapte ori (varianta mFa55 mIgG2a), în timp ce mutațiile L235R, G236R și S239K în ambele lanțuri grele le-au făcut să nu se lege de Fc Rs de șoarece (varianta mFa31 mIgG2a); primul a fost numit mouse ADCC/ADCP-enhanced-Fc (îmbunătățit), cel de-al doilea mouse silent-Fc (mSilent) mAb. Pentru a compara activitatea antitumorală a acestor mAb anti-șoarece-CTLA-4 modificați cu Fc în combinație cu vaccinarea antigenului tumoral, am inoculat subcutanat la șoareci BALB/c celule de fibrosarcom CMS5a care exprimă antigenul uman NY-ESO-1, iar în ziua 9, când tumora s-a stabilit, s-au tratat șoarecii cu 100 ug din fiecare mAb și au fost vaccinați cu peptida NY-ESO-1 în aceeași zi (ziua 9; în continuare numim protocolul „tratament concomitent”). sau 3 zile mai târziu (ziua 12; în continuare „pretratament cu Ab”) (Fig. 4B). Pretratamentul Ab cu mAb mEnhanced a fost mai eficient decât tratamentul concomitent sau pretratamentul fie cu mIgG2a, fie cu mAb mSilent în întârzierea creșterii tumorii; efectele ultimilor doi mAb asupra creșterii tumorii au fost scăzute și nu sunt semnificativ diferite între pretratamentul cu Ab și tratamentul concomitent (Fig. 4C). Supraviețuirea a fost semnificativ mai bună la șoarecii pretratați cu mAb mEnhanced și, de asemenea, la șoarecii cu tratament concomitent sau pretratament cu mIgG2a, deși oricare dintre metodele de tratament cu mIgG2a nu a reușit să inducă regresia tumorii la majoritatea șoarecilor (Fig. 4 C și D).

Fig. 4. Pretratamentul cu mAb anti-CTLA-4 îmbunătățit cu ADCC/ADCP induce efecte antitumorale puternice la șoareci. (A) Rezumatul substituțiilor de aminoacizi efectuate în porțiunea Fc a mAb anti-șoarece CTLA-4 IgG2a (clona UC10; mIgG2a) pentru a genera ADCC/ADCP-amplificat anti-șoarece-CTLA{{ Sunt afișate 10}} (îmbunătățit) sau silențios-Fc anti-mouse–CTLA-4 (mSilent) mAbs și afinitățile lor față de mouse-ul Fc RIV. Afinitatea mAb mSilent a fost sub limita de detecție a testului BIACORE. (B– D) Schema experimentului (B). Șoarecii au fost provocați cu 2 × 106 fibrosarcom CMS5a care exprimă NY-ESO-1 uman în ziua {{4{0}} și au fost lăsați netratați sau tratați cu mEnhanced, mIgG2a sau silentios mAb anti-șoarece-CTLA-4 în ziua 9. Vaccinarea NY-ESO-181–88 de peptide amestecate cu CFA a fost efectuată în aceeași zi (ziua 9, tratament concomitent) sau 3 zile mai târziu (zi 12, pretratare Ab). Creșterea tumorii a fiecărui șoarece cu o linie îngroșată care indică media fiecărui grup de tratament (C) (n=8-13 per grup). Rezumatul creșterii medii a tumorii pentru fiecare grup de tratament (D, Stânga). Asteriscurile indică valorile P între grupul de pretratare mAb îmbunătățit prin ANOVA bidirecțională cu testul de comparație multiplă Tukey. Rezumatul ratei de supraviețuire (D, dreapta) a fiecărui grup de tratament. Valorile P între supraviețuirea fiecărui grup și supraviețuirea martor numai cu vaccin au fost calculate prin testul log-rank. Evenimentul de deces corespunde lungimii tumorii mai mare sau egală cu 200 mm sau moartea șoarecelui. *P mai mic sau egal cu 0,05, **P mai mic sau egal cu 0,01, ***P mai mic sau egal cu 0,001 și ****P mai mic sau egal cu 0,0001.

Pretratamentul îmbunătățit cu mAb a dus, de asemenea, la o creștere semnificativă a numărului de celule T CD8 plus care infiltrează tumori și a raportului CD8/Treg în TIL, deși procentul de celule FOXP3 plus dintre celulele CD4 plus T a crescut ușor (Fig. 5 A–). C). În plus, în timp ce frecvența CD8 plus TIL-uri specifice peptidei NY-ESO-1 nu a fost diferită din punct de vedere statistic între șoarecii tratați cu fiecare mAb sau între pretratament și tratamentul concomitent, CD8 specific antigen plus TIL din mAb îmbunătățit pretratat șoarecii, în comparație cu alte grupuri, au prezentat producție de IL-2 și IFN semnificativ mai activă la restimularea in vitro cu peptida NY-ESO-1 (Fig. 5 D și E). Mai mult, celulele CD8 plus T de memorie efectoare definite ca populația CD44highCD62Llow au crescut semnificativ în rândul CD8 plus TIL-uri specifice NY-ESO-1 la șoarecii pretratați cu mAb îmbunătățit (Fig. 5 F și G).

Luat împreună, pretratamentul mAb mEnhanced a fost cel mai eficient în evocarea imunității tumorii, urmat de pretratamentul cu mIgG2a, care a avut o anumită activitate ADCC, în timp ce mSilent mAb a fost mult mai puțin eficient. Rezultatele indică faptul că pretratamentul șoarecilor purtători de tumori cu mAb anti-CTLA-4 îmbunătățit cu ADCC/ADCP, urmat de vaccinarea cu antigen tumoral poate evoca în mod eficient răspunsuri imune antitumorale in vivo.

Discuţie

Constatările majore din acest raport sunt: ​​(i) celulele eTreg diferențiate terminal, foarte supresive sunt abundente în țesuturile tumorale și exprimă CTLA de suprafață-4 la niveluri mai mari decât celulele CD8 plus T cu infiltrare tumorală; (ii) mAb anti-CTLA-4 cu activitate ADCC ridicată este capabil să epuizeze/reducă celulele CTLA-4eTreg înalte și CTLA-4 plus celulele efectoare CD8 plus T; și (iii) mAb anti-CTLA-4 care epuizează celulele poate evoca și spori imunitatea tumorală eficientă atunci când regimul de tratament cu anticorpi este conceput pentru a nu afecta CTLA-4 plus celulele efectoare CD8 plus T, de exemplu, prin modificarea momentului de epuizare a celulelor Treg și vaccinarea cu antigen canceros.

Activitatea ADCC a mAb anti-CTLA-4 este un determinant cheie al eficacității reducerii eTreg și expansiunea rezultată a celulelor CD8 plus T reactive tumorale. Sprijinind noțiunea, am demonstrat că mAb anti-CTLA-4 (ART-Fc) cu o activitate ADCC îmbunătățită (și/sau activitate ADCP la șoareci) a fost capabil să mărească răspunsurile imune antitumorale in vitro la oameni și in vivo la șoareci prin epuizarea celulelor Treg care exprimă CTLA-4. Anti-CTLA4 mAbs (silent-Fc) modificați pentru a prezenta o activitate ADCC mult mai mică sau deloc nu au reușit să prezinte o astfel de activitate antitumorală, chiar dacă posedau aceeași specificitate pentru un epitop al moleculei CTLA-4. La om, rămâne neclar dacă efectul antitumoral al ipilimumabului cu porțiunea Fc IgG1 este atribuit blocării moleculei CTLA4 sau epuizării celulelor care exprimă CTLA-4 prin ADCC. S-a demonstrat la șoareci că o îmbunătățire a imunității antitumorale de către un mAb anti-CTLA-4 a necesitat epuizarea celulelor Treg care infiltrează tumora prin ADCC mediat de Fc R (19-21, 26, 27). În mod similar, anticorpii împotriva moleculelor GITR, OX40 și CD25, în care celulele Treg infiltrate în tumori exprimă cele mai mari cantități, s-au dovedit a fi dependenți de epuizarea celulelor Treg mediată de ADCC în respingerea tumorii (19, 26, 28). De asemenea, sa raportat că tratamentul cu ipilimumab la pacienții cu melanom a redus semnificativ celulele FOXP3 plus Treg din țesuturile tumorale, în special la respondenții clinici (29).

În plus, un raport recent a arătat că, printre pacienții cu melanom cu sarcină mare de mutație tumorală, cei care au genetic o variantă cu afinitate ridicată a Fc RIIIa cu ADCC îmbunătățit (varianta V158, spre deosebire de varianta cu afinitate scăzută F158) au prezentat semnificativ mai bune răspunsuri clinice la tratamentul cu ipilimumab și o supraviețuire globală mai bună (27). Această descoperire susține ideea că mAb anti-CTLA-4 cu o activitate mai bună de epuizare a Treg poate fi mai eficient decât ipilimumab în imunoterapia cancerului. Astfel, este probabil ca mAb anti-CTLA4 ART-Fc, care posedă o afinitate mare pentru varianta V158 (KD=3.7 × 10−10 M, comparativ cu 3,1 × 10−6 M pentru ipilimumab sau IgG1) , poate avea o eficacitate clinică mai bună în imunoterapia cancerului prin epuizarea celulelor Treg. Luate împreună, aceste descoperiri la oameni și șoareci indică faptul că mAb anti-CTLA-4 cu ADCC/ADCP ridicat poate fi eficient în evocarea și creșterea imunității tumorale prin epuizarea celulelor Treg.

Fig. 5. Răspunsuri CD8 plus T specifice Ag induse la șoarecii purtători de tumori prin pretratament cu mAb anti-CTLA-4 îmbunătățit cu ADCC/ADCP. (A-G) TIL-urile din Fig. 4 au fost analizate la 19 zile după implantarea tumorii (n=4-6 per grup). Numărul de celule T infiltrate per gram de tumoare (A). Raportul celulelor CD8/Treg (B). Frecvența celulelor Foxp3 plus Treg printre celulele CD4 plus T (C). Grafice reprezentative ale IL-2 plus IFN- plus CD8 plus celule T (D). Producția de citokine a fost măsurată prin restimularea TIL-urilor cu peptide ESO-181–88 in vitro timp de 5 ore. Rezumatul celulelor Tet plus CD8 plus T în tumoră și IL{{20}} plus IFN-plus CD8 plus celulelor T în D după restimulare (E). Grafice reprezentative (F) și rezumatul (G) ale expresiilor CD44 și CD62L de către NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus celule T în tumora fiecărui grup de tratament. Datele au fost obținute din trei experimente independente. Valorile P între Naïve sau EM CD8 plus subseturile de celule T ale fiecărei stări. Mijloace ± SEM. *P mai mic sau egal cu 0.05, † P mai mic sau egal cu 0.05, **P mai mic sau egal cu 0,01, ††P Mai mică sau egală cu 0,01 și ***P Mai mică sau egală cu 0,001 prin ANOVA bidirecțională cu testul de comparație multiplă Tukey.

Materiale și metode

Mostre de donator.

Probele de sânge periferic au fost obținute de la indivizi sănătoși sau de la pacienți cu melanom în stadiul III până la IV. PBMC-urile au fost izolate prin gradient de densitate cu Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL-urile au fost obținute din țesuturile de melanom rezecate. Tumora a fost tocată, iar suspensiile unicelulare generate după disociere blândă a MACS (Miltenyi) au fost preparate prin filtrare printr-o sită celulară de 40-μm. Toți donatorii au furnizat consimțământul informat în scris înainte de prelevare, conform Declarației de la Helsinki. Prezentul studiu a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțional al Universității din Osaka.

Analiza CyTOF.

TIL-urile și splenocitele de la șoarecii purtători de tumori au fost îmbogățite cu celule CD3 plus și colorate cu 198-cisplatină pentru discriminarea celulelor moarte și un panou de anticorpi care include următorii anticorpi conjugați cu metal: 172Yb-CD4 (RM{4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC{-10), 158GdFOXP3 (FJK{-16s). Pentru PBMC-uri și TIL-uri umane, suspensiile celulare au fost codificate de bare de anticorpi anti-CD45 cu diferiți conjugați de metal, așa cum s-a descris anterior (35), înainte de colorarea cu 198-cisplatină pentru discriminarea celulelor moarte și apoi colorarea anticorpilor cu următorul panou. Anticorpii conjugați cu metal au fost obținuți din Fluidigm sau Kitul de etichetare a anticorpilor Maxpar (Fluidigm) a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului pentru a conjuga anticorpii purificați: 89Y-CD45 (clona: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- Anticorpii CD45 (HI30; Biolegend) au fost utilizați pentru codificarea de bare a diferitelor probe; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR{8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotină (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA) -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145Nd-TCD44 Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A); , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), 156Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), 156Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 1654DX2-CD39 (A1; Fluidigm); CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL{{-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3,9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy-CTLA{{188}3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) și 168Er-Ki-67 (Ki{-67; Fluidigm).

Celulele umane și de șoarece au fost fixate cu tampon de colorare eBioscience Foxp3/factorul de transcripție (ThermoFisher) înainte de colorarea intracelulară. Celulele colorate au fost apoi resuspendate în 2% PFA cu intercalator ADN 191/193-iridiu (Fluidigm) peste noapte, apoi spălate și resuspendate în apă Maxpar (Fluidigm) și granule cu patru elemente EQ (Fluidigm) imediat înainte de analiza cu Helios CyTOF sistem (Fluidigm). Datele normalizate au fost analizate cu Cytobank Premium.

Stimularea celulelor T CD8 plus specifice antigenului.

PBMC întregi de la indivizi sănătoși și pacienți cu melanom au fost stimulate cu 10 μM de peptide scurte specifice pentru HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) timp de 8–9 zile: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL) sau NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Pentru a determina efectul mAb anti-CTLA-4 cu diferite ADCC, unul dintre următorii mAb a fost adăugat la cultură la 1 ug/mL (dacă nu se indică altfel) în aceeași zi sau cu 5 zile înainte de stimularea antigenului: ADCC -IgG1 anti-CTLA-4 uman îmbunătățit (MDX{-010-ART-Fc), IgG1 anti-CTLA-4 convențional nemodificat (MDX{-010-IgG1) sau Fc silențios Anticorpi anti-CTLA-4 IgG1 (MDX{-010-silent-Fc): Toate mAb-urile au fost furnizate cu amabilitate de Chugai Pharmaceutical. O jumătate din mediu a fost înlocuită cu mediu proaspăt care conține 10 U/mL IL-2 și 40 ng/mL IL-7 la fiecare 3 zile.

Testul de eliberare a lactat dehidrogenazei cu celule CHO care exprimă CTLA-4 uman.

A fost efectuat un test de eliberare a lactat dehidrogenazei (LDH) pentru a determina activitatea ADCC în PBMC. Celulele CHO DG44-hCTLA4 (de la Chugai Pharmaceutical) au fost însămânțate pe plăci cu fund rotund de 96-godeuri (1 × 104 celule per godeu) și incubate cu diferite concentrații de mAb timp de 15 minute. PBMC-urile obținute de la donatori sănătoși au fost apoi adăugate la cultură la un raport efector-țintă (E∕T) de 50:1. Celulele au fost incubate la 37 de grade, 5% CO2 timp de 6 sau 24 de ore, s-au colectat 100 μL de supernatant din fiecare godeu și s-a măsurat absorbanța de 492 nm și 630 nm folosind cititorul multimodal Cytation 5 Cell Imaging (BioTek Instruments). Eliberarea de LDH a fost considerată a fi maximă după incubarea celulelor în soluție Nonidet P-40 de 1%. Citotoxicitatea (procentul) a fost determinată din formulă; (AC)∕(BC) × 100, unde A, B și C reprezintă eliberarea de LDH a fiecărui experiment, eliberarea maximă de LDH și, respectiv, eliberarea de fond LDH. Toate experimentele au fost efectuate în duplicat.

Test ADCC cu PBMC uman proaspăt izolat.

PBMC-urile de la donatori sănătoși au fost sortate FACS pentru fiecare fracțiune de celule T și Treg au fost preetichetate cu CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) și cultivate cu celule non-T, ca celule efectoare, la un raport țintă-efector de 1:50. Apoi, 1 ug/mL de mAb anti-CTLA-4 indicat a fost adăugat la 10% ser uman AB care conține mediu RPMI1640 cu 5 UI/mL IL-2. După cultură de 24-h la 37 de grade , frecvența celulelor moarte, indicată prin colorare fixabilă LIVE/DEAD (ThermoFisher), printre celulele CTV plus a fost evaluată de FACS.

Experimente cu tumori murine.

Șoarecii BALB/c în vârstă de șase până la 7-săptămâni au fost achiziționați de la CLEA Japonia și menținuți în condiții specifice fără agenți patogeni. Șoarecii au fost provocați subcutanat cu 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. La nouă zile după implantarea tumorii, șoarecii au primit intravenos 100 ug de mAb anti-șoarece-CTLA4 (clonă UC-10; mIgG2a, mEnhanced sau mSilent, de la Chugai Pharmaceutical). Varianta mEnhanced (varianta mFa55 mIgG2a) a fost generată de mutația S239D în domeniul CH2 și prezintă o afinitate îmbunătățită de legare la RIV Fc de șoarece de aproximativ șapte ori în comparație cu mIgG2a de tip sălbatic. Șoarecii au fost tratați cu vaccinarea cu 100 ug de peptide ESO-181–88 (Operon Biotechnology) amestecate cu 200 μL de CFA/PBS (raport 1:1), fie în aceeași zi (ziua 9, tratament concomitent) fie 3 d mai târziu (ziua 12, pretratament Ab) subcutanat. Dimensiunea tumorii a fost măsurată la fiecare 3-4 zile. Experimentele au fost aprobate de Consiliul de revizuire instituțional și efectuate în conformitate cu reglementările Universității din Osaka.

Citometrie în flux.

După cum s-a descris anterior (12, 23), celulele CD8 plus T specifice antigenului generate in vitro au fost colorate cu Melan-A, CMV sau tetramer Flu (TC Matrix) sau NY-ESO marcat cu PE-1 tetramer (MBL) timp de 10 minute la 37 de grade și apoi colorat cu diferite mAb de suprafață. Pentru colorarea CTLA de suprafață-4 în acest studiu, a fost utilizat un anticorp biotinilat-anti-uman CD152 (clona BNI3; BD Biosciences) la 4 grade timp de 15 minute cu alți anticorpi împotriva moleculelor de suprafață. După spălare, am adăugat APC-streptavidină (Biolegend) și la 4 grade timp de 15 minute pentru a evita colorarea moleculelor CTLA-4 exteriorizate la suprafață după o condiție de colorare extinsă la 37 de grade. Aceste proceduri de colorare au fost efectuate înainte de fixare și permeabilizare, așa cum este descris în studiul nostru anterior (24).

Colorarea intracelulară a FOXP3 a fost efectuată utilizând setul de tampon de colorare a factorului de transcripție FOXP3 (eBioscience). Următorii anticorpi cu etichete fluorescente indicate au fost utilizați pentru colorarea celulelor umane: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotină-CTLA-4 (BNI3) ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA) -T4; eBioscience), amestec FITC-Lineage (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3,9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) și colorant de viabilitate fixabil eFluor780 (eBioscience). Următorii anticorpi au fost utilizați pentru colorarea celulelor de șoarece: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy{7-CD3e ({145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM{{4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK{-16s; eBioscience), FITC-IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL{{-2 (JES{{6-5H4; eBiosciences) și colorant de viabilitate fixabil eFluor780 (eBioscience). Celulele TIL CD8 și T specifice antigenului de la șoareci au fost colorate cu tetrameri ESO-181-88 marcați cu PE, H-2Dd restricționați (TC Matrix), așa cum este descris mai sus. Pentru a măsura producția de citokine din celulele CD8 plus T, TIL-urile de șoarece au fost restimulate timp de 5 ore la 37 de grade în prezența a 10 μM din aceleași peptide ESO-181-88 utilizate pentru o vaccinare cu GolgiPlug (BD Bioscience). Fixarea și permeabilizarea au fost efectuate cu setul de tampon Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). Celulele au fost achiziționate cu LSR Fortessa (BD Bioscience) și analizate folosind software-ul FlowJo v9.9.5.

Analize statistice

Testul t pereche cu două cozi a fost utilizat pentru a evalua semnificația dintre cele două grupuri. ANOVA unidirecțională sau bidirecțională cu testul de diferență semnificativă sinceră (HSD) Tukey post hoc a fost utilizat pentru compararea mai multor grupuri. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul Prism v6 (GraphPad). Valorile p < 0.05 au fost considerate semnificative.

MULȚUMIRI.

Mulțumim membrilor Departamentului de Dermatologie, Școala Absolventă de Medicină, Universitatea Osaka pentru colectarea probelor de pacienți; și K. Teshima, T. Shimizu și N. Mizoguchi pentru asistență tehnică. Anticorpii CTLA-4 anti-umană și șoarece fcengineered au fost generați și furnizați de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Acest studiu a fost susținut de Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (către SS), Grants-in-Aid pentru cercetare științifică (A) 26253030 (către SS) și (B) 26290054 (către HN), Grantin-Aid pentru provocarea cercetării exploratorii 26670581 (către HN) și Grant-inAid pentru tinerii oameni de știință (B) 26860331 și 23K15 (către 157) A. Tanaka) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei din Japonia; și Cercetare de bază pentru Știința și Tehnologia Evoluțională de la Agenția Japoneză pentru Știință și Tehnologie (SS). Acest studiu a fost realizat parțial ca program de cercetare al Proiectului pentru Dezvoltarea Cercetării Inovatoare în Terapia Cancerului (P-DIRECT) și Cercetare practică pentru Controlul inovator al Cancerului și Proiectul pentru Cercetarea Cancerului și Evoluția Terapeutică (P-CREATE) de către Japonia. Agenția pentru Cercetare și Dezvoltare Medicală.

1. Sakaguchi S (2004) CD4 plus celule T reglatoare care apar în mod natural pentru auto-toleranța imunologică și controlul negativ al răspunsurilor imune. Annu Rev Immunol 22:531–562.

2. Zou W (2006) Celulele T de reglare, imunitatea tumorală și imunoterapie. Nat Rev Immunol 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Celulele T reglatoare în imunoterapia cancerului. Cell Res 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) Imunoterapia combinată cu blocarea CTLA4 și GM-CSF modifică echilibrul intratumoral al celulelor T efectoare și reglatoare. J Clin Invest 116:1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Inducerea imunității tumorale prin îndepărtarea celulelor CD25 plus CD4 plus T: O bază comună între imunitatea tumorii și autoimunitate. J Immunol 163:5211–5218.

6. Wolf AM și colab. (2003) Creșterea celulelor T reglatoare în sângele periferic al pacienților cu cancer. Clin Cancer Res 9:606–612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) Recrutarea specifică a celulelor T de reglementare în carcinomul ovarian încurajează privilegiul imun și prezice o supraviețuire redusă. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Foxp3 cu infiltrare tumorală plus celulele T reglatoare sunt asociate cu recurența la pacienții cu NSCLC în stadiul patologic I. Cancer 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Valoarea prognostică a FoxP3 cu infiltrare tumorală plus celulele T de reglementare în cancere: o revizuire sistematică și meta-analiză. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M, et al. (2009) Dinamica de delimitare și diferențiere funcțională a celulelor CD4 plus T umane care exprimă factorul de transcripție FoxP3. Imunitatea 30:899–911.

11. Wing JB, et al. (2017) O subpopulație distinctă de celule reglatoare T-foliculare CD25− se localizează în centrii germinali. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T, et al. (2016) Două subpopulații de celule T FOXP3(plus)CD4(plus) controlează distinct prognosticul cancerelor colorectale. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D, et al. (2013) Anti-CCR4 mAb epuizează selectiv FoxP3 de tip efector plus CD4 plus celulele T reglatoare, evocând răspunsuri imune antitumorale la om. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Mecanisme de foxp3 plus supresia mediată de celule reglatoare T. Imunitatea 30:636–645.

15. Wing K, et al. (2008) Controlul CTLA-4 asupra Foxp3 plus funcția de reglare a celulelor T. Science 322:271–275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) Trans-endocitoza CD80 și CD86: O bază moleculară pentru funcția extrinsecă celulară a CTLA-4. Știința 332:600–603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Supraviețuirea îmbunătățită cu ipilimumab la pacienții cu melanom metastatic. N Engl J Med 363:711–723.

18. Robert C, et al. (2011) Ipilimumab plus dacarbazină pentru melanom metastatic netratat anterior. N Engl J Med 364:2517–2526.

19. Bulliard Y, et al. (2013) Activarea receptorilor Fc contribuie la activitățile antitumorale ale anticorpilor care vizează receptorii imunoregulatori. J Exp Med 210:1685–1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) Depleția dependentă de Fc a celulelor T reglatoare care infiltrează tumora co-definiește eficacitatea terapiei anti-CTLA-4 împotriva melanomului. J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ, et al. (2013) Anticorpii anti-CTLA-4 ai izotipului IgG2a sporesc activitatea antitumorală prin reducerea celulelor T reglatoare intratumorale. Cancer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Receptorii Fcgamma ca regulatori ai răspunsurilor imune. Nat Rev Immunol 8:34–47.

23. Mimoto F, et al. (2013) Varianta Fc de anticorp nou proiectată asimetric cu afinitate și specificitate superioară de legare a Fc R în comparație cu varianta Fc fucozilată. MAbs 5:229–236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Detectarea celulelor CD8 plus T auto-reactive cu un fenotip anergic la indivizi sănătoși. Science 346:1536–1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: Revizuirea unui antigen tumoral imunogen. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, et al.; Consorțiul Melanom TRACERx; Consorțiul Renal TRACERx; Lung TRACERx Consortium (2017) Anti-CD25 optimizat cu Fc epuizează celulele T reglatoare care infiltrează tumorile și face sinergie cu blocarea PD-1 pentru a eradica tumorile stabilite. Imunitatea 46:577–586.

27. Arce Vargas F, et al.; Melanom TRACERx; TRACERx Renal; Consorții pulmonare TRACERx (2018) Funcția efector Fc contribuie la activitatea anticorpilor umani anti-CTLA-4. Cancer Cell 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, et al. (2014) Angajamentul OX40 epuizează Tregs intratumorali prin activarea Fc Rs, ceea ce duce la eficacitatea antitumorală. Immunol Cell Biol 92:475–480.

29. Romano E, et al. (2015) Citotoxicitatea mediată celulară dependentă de ipilimumab a celulelor T reglatoare ex vivo de către monocite neclasice la pacienții cu melanom. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) Rolul emergent al CTLA4 ca regulator extrinsec celular al răspunsurilor celulelor T. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS, et al. (1996) Traficul intracelular al CTLA-4 și localizarea focală către site-urile de implicare TCR. Imunitatea 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Acumularea antigenului limfocitar T citotoxic-4 în sinapsa imunologică este reglată de puterea semnalului TCR. Imunitatea 16:23–35.

33. Ko K, şi colab. (2005) Tratamentul tumorilor avansate cu mAb anti-GITR agonist și efectele sale asupra Foxp3 cu infiltrare tumorală plus CD25 plus CD4 plus celule T reglatoare. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA, et al. (2012) Blocarea CTLA-4 cu ipilimumab: urmărirea pe termen lung a 177 de pacienți cu melanom metastatic. Clin Cancer Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa , Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad , Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga , Ee Lyn Lima , Karen Wei Weng Tenge , Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle , Ichiro Hichiro Katayo,shi 1,3 și Shimon Sakaguchia,b,4.

un Imunologie Experimentală, Centrul de Cercetare de Frontieră în Imunologie, Universitatea Osaka, 565-0871 Osaka, Japonia; b Laboratorul de Imunologie Experimentală, Departamentul de Știință și Inginerie Regenerare, Institutul pentru Științe Medicale și Vieții de Frontieră, Universitatea Kyoto, 606-8507 Kyoto, Japonia; c Divizia de cercetare, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japonia; d Departamentul de Dermatologie, Școala Absolventă de Medicină, Universitatea Osaka, 565-0871 Osaka, Japonia; și e Agenția pentru Știință, Tehnologie și Cercetare, Singapore Immunology Network, 138632 Singapore.

Contribuție de Shimon Sakaguchi, 23 noiembrie 2018 (trimis pentru revizuire 19 iulie 2018; revizuit de Miyuki Azuma și Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com