Subunitatea catalitică a proteinei kinazei dependentă de ADN (ADN-PKcs) conduce la progresia bolii renale cronice la șoarecii masculi

Leziuni renaleiniţiază dediferenţierea epitelială şi miofiactivarea broblastului în timpulprogresia bolii renale cronice. Aici, noifiși că expresia ADN-PKcs este semnifia crescut semnificativ înțesuturile renale atât ale bolii renale cronicepacienţi şi şoareci masculiindusă de obstrucția ureterală unilateralășileziune ischemie-reperfuzie unilaterală. In vivo, eliminarea ADN-PKcs sau tratament cu specificațiile salefiinhibitorul c NU7441 împiedicădezvoltarea bolii renale cronicela soareci masculi. In vitro, ADN-PKcs defiștiința păstrează fenotipul celulelor epiteliale și inhibăfiactivarea broblastului indusă prin transformarea factorului de creștere-beta 1. În plus, rezultatele noastre arată că TAF7, ca un posibil substrat al ADN-PKcs, îmbunătățește activarea mTORC1 prin reglarea exprimării RAPTOR, care promovează ulterior reprogramarea metabolică în celulele epiteliale lezate și mio.fibroblaste. Luați împreună, ADN-PKcs pot fi inhibați pentru a corecta reprogramarea metabolică prin semnalizarea TAF7/mTORC1 înboală cronică de rinichiși să servească drept o țintă potențială pentru tratamentboală cronică de rinichi. 

CLICK AICI PENTRU A INVĂȚI DESPRE FORMULAREA PE IERBE A CISTANCHEI PENTRUBOALA CRONICA DE RINCHI

Boala cronică de rinichi(CKD) afectează 10% dintre adulții din întreaga lume1. CKD reprezintă o povară uriașă pentru sănătatea publică globală, deoarece are o mare probabilitate de a progresaboală renală în stadiu terminal(IRST), care necesită dializă sau transplant de rinichi1,2. Fibroza interstițială renală este una dintre caracteristicile patologice majore ale CKD2-4. Multe dintre caracteristicile fiziopatologice ale fibrozei renale sunt împărtășite de alte boli fibrotice, cum ar fi ciroza hepatică și cardiomiopatiile5. Nu există tratamente eficiente pentru CKD, evidențiind o nevoie urgentă de o mai bună înțelegere a mecanismelor patologiceCKD subiacentă.

În rinichii afectați, fibroza interstițială implică expresia anormală a factorilor profibrotici, cum ar fi factorul de creștere transformant-beta 1 (TGF- 1), dediferențierea epitelială și activarea miofibroblastelor2. Ca mediator cheie al fibrozei interstițiale, TGF- 1 nu numai că activează expresia genelor fibrotice, inclusiv actina musculară netedă (-SMA), fibronectina (FN) și colagenul, dar promovează și reprogramarea metabolică asemănătoare efectului Warburg a celule renale6,7. Recent, dovezile emergente au demonstrat relația dintre dereglarea metabolică și fibroza interstițială, dezvăluind că reprogramarea metabolică are loc în celulele renale (celule epiteliale tubulare renale8,9 și miofibroblaste10) în timpul leziunii renale și contribuie la dezvoltarea BRC. Reprogramarea metabolică în celulele renale determină o reducere drastică a oxidării acizilor grași (FAO) și o schimbare metabolică către glicoliză, contribuind la infiltrarea celulelor imune și la fibroza interstițială7,11,12. Mai mult, datele clinice au dezvăluit că metabolismul și căile de inflamație sunt dereglate la pacienții cu CKD7. Restaurarea FAO sau inhibarea glicolizei prin metode genetice sau farmacologice atenuează fibroza în diferite modele animale de fibroză renală11,13–15.

În mecanismele moleculare ale reprogramării metabolice, ținta mamiferelor a rapamicinei (mTOR), care este o serină/treonin kinază citoplasmatică, acționează pentru a modula metabolismul celular și a menține homeostazia metabolică16,17. Două complexe funcționale distincte ale mTOR au fost definite în funcție de proteinele sale de legare. Complexul MTOR 1 (mTORC1) interacționează cu regulatorul său specific RAP TOR și este sensibil la rapamicin18,19. mTOR complex 2 (mTORC2) este reglementat de RICTOR20. Activarea cronică a mTORC1 promovează reprogramarea metabolică în diferite afecțiuni patologice, inclusiv fibroza interstițială renală9,21–23, dar mecanismele care reglează această activare, în special în fibroza interstițială, rămân în mare parte necunoscute.

Protein kinaza dependentă de ADN (ADN-PK), un complex trimeric compus dintr-o subunitate catalitică (ADN-PKcs) și un heterodimer Ku70/80, este activată prin rupturi dublu catenar ADN (DSB)24,25 sau ROS26. O funcție binecunoscută a ADN-PK este mediarea îmbinării la capăt neomolog (NHEJ), care se alătură DSB-urilor programate create în timpul recombinării V(D)J și joacă un rol cheie în recombinarea limfocitelor25. Ca rezultat, mutațiile în ADN-PKcs stopează dezvoltarea limfocitelor T și B, din cauza deficienței recombinării V (D) J27,28. Cu toate acestea, întârzierea creșterii sau frecvența ridicată a dezvoltării limfomului cu celule T nu a apărut la șoarecii knock-out ADN-PKcs28. Deși este un senzor ADN DSB, DNA-PKcs are unele proprietăți neobișnuite, cum ar fi acumularea în celule la un nivel mult peste ceea ce este probabil necesar pentru NHEJ29. Mai mult, ADN-PKcs este localizat atât în ​​nucleu, cât și în citoplasmă30. În acord cu proprietățile sale neobișnuite, dovezile recente indică faptul că ADN-PKcs are funcții suplimentare, altele decât NHEJ31. De exemplu, fosforilarea mediată de ADN-PKcs a factorului de transcripție USF-1 promovează sinteza acizilor grași indusă de insulină32, iar ADN-PKcs promovează declinul metabolic în timpul îmbătrânirii33. Cercetările privind funcțiile non-NHEJ ale PKc-urilor ADN, cum ar fi metabolismul și îmbătrânirea, tocmai au început să înflorească și o serie de întrebări rămân fără răspuns31. În plus, ca una dintre kinazele înrudite cu fosfoinozitid 3-kinaza (PI3K), s-a descoperit că ADN-PK reglează activarea mTOR34.

În această lucrare, rezultatele noastre arată că ADN-PKcs mediază activarea semnalizării RAPTOR/mTORC1 prin fosforilarea factorului 7 asociat proteinei de legare a casetei TATA (TAF7) în CKD. Inhibarea ADN-PKcs corectează reprogramarea metabolică în celulele epiteliale lezate și miofibroblastele din CKD. ADN-PKcs pot servi ca o nouă țintă potențială pentru tratarea CKD.

Rezultate

ADN-PKcs este crescut la rinichii pacienților cu IRC și la șoarecii cu fibroză renală

Activitatea ADN-PKcs a fost analizată prin colorarea imunohistochimică a autofosforilării S2056 în ADN-PKcs (p-DNA-PKcs) în țesuturile renale umane sănătoase și CKD. Porțiunile netumorale ale probelor de nefrectomie au fost utilizate ca țesuturi renale „sănătoase”, care au fost colectate de la pacienții cu carcinom cu celule renale. Rezultatele au arătat că p-DNA-PKcs a fost aproape nedetectabil în aceste țesuturi renale normale, dar nivelurile de proteine ​​ale p-DNA-PKcs au fost semnificativ crescute în țesuturile renale umane CKD (Fig. 1a). Pentru a determina relevanța activității ADN-PKcs și a fibrozei renale in vivo, expresia fibronectinei (FN), o genă crucială legată de fibroza renală, a fost analizată prin colorare imunohistochimică și a fost efectuată și colorarea cu roșu Sirius pentru a analiza gradul de fibroză interstițială. la pacienții cu BRC (Fig. 1a). Rezultatele noastre au relevat o asociere pozitivă între nivelurile de proteine ​​ale p-ADN-PKcs și gradul de fibroză interstițială (P=0.005, Fig. 1b, c). În plus, nivelurile de expresie ale ADN-PKcs au fost, de asemenea, analizate utilizând seturi de date de microarray CKD umane publicate anterior (Nephroseq). Am constatat că nivelurile de ARNm de ADN-PKc au fost crescute semnificativ de mai mult de 1 ori în țesuturile de biopsie renală a 48 de pacienți cu CKD în comparație cu martorii (Figura suplimentară 1a), prezentând o corelație pozitivă semnificativă cu gradul de fibroza renală la pacienți (Fig. 1b suplimentară). În plus, rezultatele cocolorării prin imunofluorescență a p-ADN-PKcs cu Lotus tetragonolobus lectin (LTL) (un marker tubular renal) sau -SMA (un marker al miofibroblastelor) au arătat că ADN-PKcs a fost reglat în sens pozitiv atât în ​​celulele epiteliale tubulare, cât și în miofibroblaste ale țesuturilor renale de la pacienții cu CKD (Fig. 1d, e). Analiza unei baze de date online de secvențiere a ARN-ului unicelular renal disponibilă (http://humphreyslab.com/SingleCell/) 35 a dezvăluit că ARNm-ul ADN-PKcs a fost exprimat pe scară largă în celulele renale și suprareglat în rinichii diabetici umani în comparație cu rinichii de control (Figura suplimentară). .1c).

Pentru a identifica în continuare asocierea dintre activitatea ADN-PKcs și dezvoltarea fibrozei renale, am examinat apoi expresia și activitatea ADN-PKcs în două modele de șoarece de fibroză renală, obstrucție ureterală unilaterală (UUO) și ischemie-reperfuzie unilaterală (UIR). Colorarea imunohistochimică a p-ADN-PKcs a indicat că p-ADN-PKcs a fost indusă în mod semnificativ în ziua 3 în comparație cu controalele simulate în modelul UUO, iar nivelurile de proteine ​​ale p-DNA-PKcs au fost crescute în continuare pe măsură ce fibroza renală s-a dezvoltat din ziua 3 la zi. 14 (Fig. 1f). Rezultatele Western blot și qRT-PCR au arătat că nivelurile totale de proteine ​​​​și ARNm ale ADN-PKcs au fost, de asemenea, reglate semnificativ în țesuturile renale ale șoarecilor UUO, comparativ cu controalele simulate (Fig. 1g și Fig. 1e suplimentară). Rezultate similare au fost observate la șoarecii UIR (Fig. 1h și Fig. suplimentară 1d, f). Legătura potențială dintre ADN-PKc și CKD ne-a determinat să investigăm în continuare rolul și implicațiile mecaniciste ale ADN-PKc în CKD.

Progresia CKD mediată de ADN-PKcs la șoareci

Apoi, am creat șoareci knockout ADN-PKcs în care gena codificată ADN-PKcs Prkdc a fost eliminată folosind CRISPR/cas9, așa cum este descris în Metode (Fig. 2a suplimentară). ADN-PKcs heterozigoți (+/-) și homozigoți (-/-) șoarecii knockout și de tip sălbatic (WT) s-au distins prin genotipizare, așa cum se arată în Fig. 2a suplimentară. Nivelurile de ARNm Prkdc (Figura suplimentară 2c) și ADN-PKcs (Fig. 2e) nu au fost detectate în țesuturile renale ale șoarecilor ADN-PKcs-/-, ceea ce indică eliminarea cu succes a ADN-PKcs la șoareci. Pentru a evalua efectul strategiei de knockout ADN-PKcs asupra leziunilor renale și a fibrozei, șoarecii masculi adulți (6-8 săptămâni) DNA-PKcs-/- și control WT au fost supuși la UUO și eutanasiați la 7 zile după operație. Colorația PAS a dezvăluit că gradul de atrofie și dilatare tubulară indusă de UUO a fost semnificativ ameliorat la șoarecii ADN-PKcs-/- comparativ cu martorii WT (Fig. 2a). Fibroza renală a fost, de asemenea, ameliorată foarte mult la șoarecii ADN-PKcs-/- în comparație cu șoarecii WT, așa cum s-a observat și cuantificată prin colorarea Masson (Fig. 2b). Imaginile de etichetare imună pentru depunerea interstițială de colagen I și -SMA au arătat că ambii markeri profibrotici clasici au fost reduceți semnificativ în rinichii UUO ai șoarecilor ADN-PKcs-/- comparativ cu martorii WT (Fig. 2c, d). Nivelurile de proteine ​​ale markerilor profibrotici, inclusiv FN și -SMA, au fost, de asemenea, reduse semnificativ în rinichii UUO ai șoarecilor ADN-PKcs-/-, așa cum a fost analizat prin Western blot (Fig. 2e). Analiza QRT-PCR a arătat că eliminarea ADN-PKc la șoareci a redus semnificativ nivelurile de expresie ale genelor cruciale ale fibrozei renale, inclusiv Col1a1, Col3a1, Fn1 și Acta2, care au fost mult reglate în rinichii UUO. În concordanță cu reducerea fibrozei, knockout-ul PKcs ADN a redus, de asemenea, nivelurile de ARNm ale markerului de leziune renală KIM-1 indus de UUO (Figura suplimentară 2c). Mai mult, inflamația este un semn distinctiv major al fibrozei renale și joacă un rol important în patogenia fibrozei renale. Astfel, am analizat markerii legați de inflamație, inclusiv citokinele Il1, Il6, Tnf și Mcp1, prin qRT-PCR. În modelul UUO, am constatat că reglarea ascendentă a citokinelor inflamatorii induse de UUO a fost redusă semnificativ prin knockout-ul ADN-PKcs (Figura 2c suplimentară). Deoarece atât studiile clinice, cât și modelele animale prezintă o corelație puternică între macrofage și extinderea fibrozei renale, macrofagele infiltrate în țesuturile renale au fost evaluate prin colorare imunohistochimică pentru markerul macrofagic F4/80. Imaginile au dezvăluit multe macrofage infiltrate în rinichii obstrucționați ai șoarecilor WT la 7 zile după UUO, care au fost semnificativ scăzute prin knockout ADN-PKcs (Fig. 2f). Interesant, DNA-PKcs

Pentru a evalua în continuare impactul ADN-PKcs tubular renal asupra fibrozei renale, am construit celulă epitelială tubulară renală proximală cu knockout specific ADN-PKcs in vivo utilizând șoareci knockin CRISPR/cas9 (Figura suplimentară 2e, f). După injectarea subcapsulară de virus adeno-asociat (AAV) care conține ARN ghid (gARN) pentru ADN-PKcs timp de trei săptămâni, șoarecii knockout ADN-PKcs specifici celulei tubulare renale proximale au fost supuși la UUO și eutanasiați la 7 zile după intervenție chirurgicală. Colorarea prin imunofluorescență a ADN-PKcs a arătat o absență a ADN-PKcs în celulele tubulare renale (Fig. 2h), dar a fost încă expresie în miofibroblaste pozitive -SMA (Figura suplimentară 2g) ale șoarecilor cas9 injectați cu AAV-gARN, comparativ cu cei din șoarecii cas9 injectați cu un AAV fără gARN pentru ADN PKcs. Analiza Western blot a arătat că nivelurile de proteine ​​ale PKcs ADN și markerilor profibrotici, inclusiv FN și -SMA, au fost, de asemenea, reduse semnificativ în rinichii UUO ai șoarecilor cas9 injectați cu AAV-sgRNA, comparativ cu cei din grupul de control (Fig. 2g) . Similar cu modelul UUO, șoarecii knockout ADN-PKcs au fost, de asemenea, protejați de CKD indusă de UIR (Figura suplimentară 2h-m). Împreună, aceste rezultate sugerează că ștergerea ADN-PKcs atenuează progresia CKD la șoareci.

Pentru a determina dacă supraexpresia ADN-PKcs în rinichi este suficientă pentru a conduce fibroza renală, plasmidele de supraexpresie ADN-PKcs umane (Addgene: 83317) au fost livrate în rinichii de șoarece printr-o metodă de injectare la presiune înaltă a venei cozii, așa cum este descris în mai multe studii anterioare36. La treizeci și șase de ore după injectarea plasmidei ADN-PKcs, șoarecilor li s-a administrat o intervenție chirurgicală UUO timp de 7 zile. Colectiv, rezultatele noastre indică faptul că expresia ectopică a ADN-ului PKc uman este suficientă pentru a conduce progresia fibrozei renale in vivo (Figura 3 suplimentară).

Inhibarea activității ADN-PKcs atenuează dezvoltarea CKD la șoareci

Aceste descoperiri ne-au determinat să luăm în considerare posibilitatea ca inhibitorii PKcs ADN să poată fi utilizați pentru a proteja împotriva fibrozei renale. Pentru a testa ipoteza noastră, șoarecii masculi WT adulți (6-8 săptămâni) au fost tratați zilnic cu inhibitorul ADN-PKcs foarte specific NU7441, începând cu o zi după intervenția chirurgicală UUO. Șoarecii tratați cu NU7441-și de control au fost eutanasiați la 7 zile după operația UUO, iar activitatea ADN-PKcs a fost analizată prin colorare imunohistochimică, iar rezultatele au arătat că tratamentul cu NU7441 a inhibat semnificativ activarea ADN-PKcs în țesuturile renale UUO ( Fig. 3a). Gradul de atrofie și dilatație tubulară induse de UUO a fost mult îmbunătățit după tratamentul cu NU7441 în comparație cu controlul vehiculului, așa cum se arată prin colorarea PAS (Fig. 3b). Analizele histopatologice ale colorației Masson au evidențiat o reducere cu aproximativ 50% a fibrozei interstițiale renale la rinichii obstrucționați (UUO) ai șoarecilor tratați cu NU7441-, comparativ cu rinichii UUO de control cu ​​vehicul (Fig. 3c). Imaginile de colorare cu imunofluorescență au arătat că depunerea de colagen interstițial I indusă de UUO a fost redusă semnificativ prin tratamentul NU7441 (Fig. 3e). Nivelurile de proteine ​​ale markerilor profibrotici, inclusiv FN și -SMA, analizați prin Western blot au fost, de asemenea, reduse semnificativ în rinichii UUO ai șoarecilor tratați cu NU7441- în comparație cu martorii vehicul (Fig. 3f). Analiza QRT-PCR a arătat că tratamentul cu NU7441 a redus semnificativ nivelurile de expresie ale genelor cruciale ale fibrozei renale, inclusiv Col1a1, Col3a1, Fn1 și Acta2, în țesuturile renale ale șoarecilor UUO în comparație cu controalele vehiculului (Figura 4a suplimentară). În plus, infiltrarea macrofagelor în țesuturile renale ale șoarecilor UUO a fost mult redusă după tratamentul cu NU7441 în comparație cu controalele vehiculului (Fig. 3d). NU7441 a scăzut, de asemenea, nivelurile de expresie ale markerilor legați de inflamație, inclusiv citokinele Il1, Il6, Tnf și Mcp1, în țesuturile renale ale șoarecilor UUO, așa cum au fost analizate prin qRT-PCR (Figura 4a suplimentară). În plus, șoarecii knockout ADN PKcs au fost, de asemenea, tratați cu NU7441 pentru a examina posibila ne-țintă a NU7441. Rezultatele noastre au arătat că NU7441 nu a avut un efect anti-fibrotic evident la șoarecii knockout ADN-PKcs (Fig. 3g, h), sugerând o acțiune specifică a NU7441 asupra ADN-PKcs în acest cadru experimental.

Efectul protector al NU7441 împotriva leziunii renale induse de UUO și a fibrozei renale a fost extins la CKD indusă de UIR. După cum era de așteptat, tratamentul NU7441 a protejat, de asemenea, împotriva leziunii renale induse de UIR și a fibrozei în comparație cu controalele vehiculului (Fig. 4b-h suplimentară). Împreună, aceste rezultate indică faptul că inhibarea activității ADN-PKcs de către NU7441 atenuează progresia CKD la șoareci.

Fig. 3|Inhibarea activității ADN-PKcs atenuează dezvoltarea CKD la șoarecii UUO. o Colorare imunohistochimică a p-ADN-PKcs în rinichii șoarecilor tratați cu NU7441 (40 mg/kg) sau vehicul supus la UUO (ziua 7), bare de scară: 20 μm. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). b Colorare PAS a rinichilor șoarecilor tratați cu NU7441 sau vehicul supuși la UUO, bare scalare: 50 μm. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). c Colorația Masson a rinichilor de șoareci tratați cu NU7441 sau vehicul supuși la UUO, bare de scară: 50 μm. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). d Colorarea imunohistochimică a F4/80 în rinichii șoarecilor tratați cu NU7441 sau vehicul supus la UUO, bare de scară: 20 μm. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). e Colorarea prin imunofluorescență a COL1A1 în rinichii șoarecilor tratați cu NU7441 sau vehicul supus la UUO, bare de scară: 20 μm. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). f Nivelurile de proteine ​​ale FN și -SMA în rinichii șoarecilor tratați cu NU7441 sau vehicul supuși la UUO. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). g Nivelurile de proteine ​​ale FN și -SMA în rinichii șoarecilor ADN-PKcs-/- sau WT tratați cu NU7441 sau vehicul supuși la UUO. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). h Colorarea cu roșu Sirius a rinichilor șoarecilor ADN-PKcs-/- sau WT tratați cu NU7441 sau vehicul supuși la UUO. Barele reprezintă rezultatele de cuantificare (media ± SD, n=6 șoareci din fiecare grup). Testul t nepereche cu două cozi a fost utilizat pentru a determina valorile p pentru a, c, e. ANOVA unidirecțională urmată de testul de comparații multiple al lui Tukey a fost utilizată pentru a determina valorile p pentru b, d, h. Pentru a determina valorile p pentru f, g au fost utilizate ANOVA bidirecționale urmate de testul de comparații multiple al lui Šídák. Datele sursă sunt furnizate ca fișier de date sursă.

Inhibarea ADN-PKcs păstrează fenotipul celulelor epiteliale tubulare și reglează activarea fibroblastelor interstițiale in vitro

Leziunile epiteliale și activarea miofibroblastelor sunt evenimente centrale în patogeneza CKD2. Imunocolorarea a arătat că p-DNAPKcs au fost induse în mod evident de stimularea TGF 1 atât în ​​celulele HK -2 (Fig. 4a), cât și în celulele epiteliale tubulare primare (Figura suplimentară 5a). Rezultatele Western blot au arătat că fosforilarea și nivelurile totale de proteine ​​ale ADN-PKc au fost, de asemenea, reglate în mod semnificativ în celulele HK-2 tratate cu TGF 1 sau H2O2 (Fig. 4i și Fig. 5b suplimentară). În plus, celulele HK-2 knockout ADN-PKcs au fost generate folosind CRISPR-Cas9 și au fost cultivate celule epiteliale tubulare primare de șoarece WT și ADN-PKcs-/-. Construcția cu succes a celulelor HK-2 knockout ADN-PKcs a fost confirmată prin Western blot (Figura suplimentară 5c). Rezultatele noastre au arătat că knockout-ul ADN-PKcs sau inhibarea ADN-PKcs de către NU7441 a ameliorat dediferențierea celulelor epiteliale renale, așa cum arată nivelurile mai scăzute ale producției de FN și Col1A1 după expunerea la TGF 1 în Knockout ADN-PKcs sau NU{27 }}celule tratate (Fig. 4b–d, k, l). Cu toate acestea, knockout-ul KU80 a stimulat producția de FN indusă de TGF 1 în celulele epiteliale tubulare (Fig. 4m). La fel ca modelul UUO, knockout-ul ADN-PKcs nu a agravat rupturile ADN-ului în celulele HK-2 induse de H2O2 (Figura suplimentară 5d). KU70/80 recunoaște mai întâi capetele rupte ale ADN-ului la DSB, apoi recrutează ADN-PKcs pentru a forma ADN-PK, care este necesar în repararea DSB prin NHEJ37. Aceste rezultate au sugerat că ADN-PKcs sporit acțiunea profibrotică a celulelor epiteliale renale în CKD independent de funcția sa de reparare a DSB.

Pentru a investiga dacă ADN-PKcs este implicat în activarea și proliferarea fibroblastelor interstițiale au fost cultivate. Rezultatele Western blot au arătat că nivelurile de proteine ​​​​fosforilate și totale ale ADN-PKc au fost, de asemenea, reglate în mod semnificativ la nivelul celulelor NRK-49F tratate cu TGF 1 (Fig. 4j). Imunocolorarea a arătat că activitatea ADN-PKcs a fost indusă semnificativ de tratamentul cu TGF 1 în celulele NRK-49F (Fig. 4e), dar a fost semnificativ inhibată de tratamentul NU7441. Tratamentul celulelor NRK-49F cu TGF 1 a indus activarea fibroblastelor și diferențierea miofibroblastelor cu reglarea în sus a COL1, -SMA și FN, în timp ce pretratamentul cu NU7441 a tocit foarte mult fenotipul profibrotic (Fig. 4f, g, n). Mai mult, tratamentul cu NU7441 a inhibat semnificativ proliferarea celulelor NRK-49F indusă de TGF 1 în comparație cu martorii vehiculului, așa cum este indicat de colorarea EdU (Fig. 4h). Luate împreună, aceste date indică faptul că inhibarea ADN-PKcs păstrează fenotipul celulelor epiteliale tubulare și reglează activarea fibroblastului interstițial indusă de TGF 1 in vitro.

Mai mult, am examinat și mecanismul de expresie ADN-PKcs indus de TGF 1-. În primul rând, am găsit mai multe site-uri posibile de legare ale SMAD2 în regiunea promotoare a ADN-PKcs prin analiza profilurilor de legare a factorului de transcripție JASPAR 38. În al doilea rând, rezultatele testului luciferazei au arătat că supraexprimarea SMAD2 a crescut activarea transcripțională a ADN-PKcs (Figura 5e suplimentară) . În plus, a fost analizat și efectul DNA-PKcs asupra activării semnalizării SMAD. Rezultatele au arătat că knockout-ul ADN-PKcs a inhibat activarea SMAD2/SMAD3 în modelul de șoarece UUO (Figura suplimentară 5f). Aceste rezultate au sugerat că SMAD2/SMAD3 a reglat expresia ADN-ului PKcs, în timp ce ADN-PKcs a activat SMAD2/SMAD3 (Figura suplimentară 5g), formând o buclă pozitivă.

Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

CLICK AICI PENTRU A OBȚINE EXTRACT NATURAL ORGANIC DE CISTANCĂ CU 25% ECHINACOSIDE ȘI 9% ACTEOSIDE PENTRU RINICHI