Imunitatea de protecție indusă de vaccinul ADN împotriva infecției SARS CoV-2 la hamsteri

Fig 2. Răspunsul anticorpilor la șoareci după imunizarea cu vaccinuri ADN SARS-CoV și SARS-CoV-2 S.

(A) Șoarecii BALB/c (n=4 per grup) au fost imunizați intramuscular de două ori la un interval de 3-săptămână cu 100 ug de plasmidă indicată, urmată de electroporare. Probele de ser au fost colectate la punctele de timp indicate după prima imunizare. (BD, F, G) Anticorpii împotriva proteinei spike de lungime completă SARS-CoV-2, regiunea S2 și RBD au fost evaluați prin ELISA. (E, H) Anticorpul de neutralizare indus de vaccin împotriva SARS-CoV-2 a fost evaluat prin test de neutralizare. Titrurile de anticorpi sunt prezentate ca medie ± SEM, iar titrurile de neutralizare sunt exprimate ca medie geometrică cu un interval de încredere de 95%. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Pentru a investiga în continuare dacă înlocuirea secvenței lider poate crește secreția de proteine, am folosit o secvență lider dintr-un activator de plasminogen tisular pentru a fuziona diferite variante ale proteinei S SARS-CoV-2. Toate variantele conțin regiunea RBD a proteinei S SARS-CoV-2. După două doze de imunizare ADN, serurile colectate în săptămâna 4 și săptămâna 6 au fost analizate pentru anticorpi IgG și titruri de anticorpi neutralizanți. Imunizarea cu ptSARS2-S a indus titruri de anticorpi mai mari împotriva proteinei S de lungime completă în săptămâna 4 decât imunizarea ptRBD, ptRBDTM și ptSdTM (S1A Fig). Titrurile de anticorpi anti-RBD ale imunizării ptRBD au fost mai mari decât cele ale imunizării ptSARS2-S (1496,2 vs. 530,9, p=0,057) în săptămâna 4 (S1B Fig). Cu toate acestea, imunizarea ptRBD și ptSARS2-S a indus niveluri similare de anticorpi neutralizanți în săptămâna 4 (S1C Fig). Aceleași rezultate au fost observate în analiza serurilor din săptămâna 6; Imunizarea ptRBD a indus niveluri mai mari de anticorpi anti-RBD comparativ cu imunizarea ptSARS2-S (12589,3 vs. 1000,0, p=0,028), dar aceleași niveluri de anticorpi neutralizanți (9,3 vs. 9,6 (log2)) (Fig 2F, 2G și 2H). Deoarece variantele fuzionate cu secvența lider de tPA nu au indus titruri de anticorpi neutralizanți mai mari decât imunizarea pSARS2-S, am folosit pSARS2-S pentru investigații suplimentare.

Legarea competitivă a anticorpilor serici și a ACE2 de SARS-CoV-2 RBD

Pentru a examina capacitatea anticorpilor serici de a interfera cu interacțiunea ACE2-RBD, am efectuat un test serologic competitiv SARS-CoV-2. În acest test, anticorpii serici au fost adăugați pe plăcile ELISA preacoperite cu proteina SARS-CoV-2 RBD, urmată de adăugarea proteinei umane ACE2. Un anticorp neutralizant specific împotriva SARS-CoV-2 RBD a fost folosit ca referință. Așa cum se arată înFig 3, anticorpii serici de la șoarecii imunizați cu pSARS2-S s-au legat de RBD și au blocat legarea ACE2, ceea ce a fost echivalent cu aproximativ 353 ug/mL de anticorp de referință, în timp ce serul pSARS-S a fost echivalent cu 56 ug/mL de anticorp de referință. Prin urmare, datele noastre au sugerat că imunizarea pSARS2-S ar putea induce anticorpi competitivi care blochează eficient legarea SARS-CoV-2 RBD de receptorul ACE2. Acest rezultat a fost în concordanță cu titrul ELISA împotriva SARS-CoV2 RBD (Fig 2D), și susținut de studiul privind diferența dintre secvențele RBD dintre SARS-CoV și SARS-CoV-2 [24].

Fig 3. Activitatea competitivă a serurilor de șoarece imunizate împotriva interacțiunii RBD/ACE2.

Șoarecii BALB/c (n=4 per grup) au fost imunizați intramuscular de două ori la un interval de 3-săptămână cu 100 ug de vector, pSARS-S sau pSARS2-S, urmat de electroporare. Probele de ser au fost colectate în săptămâna 8 după prima imunizare. Anticorpii serici care concurează cu ACE2 pentru legarea RBD au fost evaluați prin test serologic competitiv SARS-CoV-2. Activitatea competitivă a serurilor de șoarece este exprimată ca nivel echivalent de anticorpi anti-RBD (proteina spike SARS-CoV-2) (anticorp de referință). Titrurile de anticorpi sunt prezentate ca medie ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Imunitatea umorală pe termen lung indusă de vaccinul SARS-CoV-2 S ADN și a oferit protecție încrucișată împotriva SARS-CoV-2 cu mutația D614G

În special, menținerea pe termen lung a titrurilor de anticorpi IgG împotriva S de lungime completă a fost observată la 20 de săptămâni după prima imunizare (Fig. 4A). Titrurile medii geometrice (log2) pentru anticorpii de neutralizare SARS-CoV-2 au atins 10,8 în săptămâna 8 după imunizările pSARS2-S, scăzând ușor la 9,1 în săptămâna 12 și la 8,8 în săptămâna 20 (Fig 4B). Aceste rezultate au sugerat că imunizarea pSARS2-S conferă un răspuns umoral de lungă durată împotriva SARS-CoV-2. În plus, vaccinul ADN pSARS2-S cu genotipul D614 a indus un răspuns de anticorpi neutralizanți împotriva virusului care conține mutația D614G (Fig 4C), care este similar cu titrurile de neutralizare față de genotipul D614. Prin urmare, pSARS2-S este capabil să confere protecție încrucișată împotriva celei mai răspândite și dominante variante D614G a SARS-CoV-2.

Fig. 4. Vaccinul ADN SARS-CoV-2 S a indus imunitate umorală pe termen lung și protecție încrucișată împotriva SARS-CoV-2 cu mutația D614G.

Șoarecii BALB/c (n=4 per grup) au fost imunizați intramuscular de trei ori la un interval de 3-săptămână cu 100 ug de vector, pSARS-S sau pSARS2-S, urmat de electroporare. Probele de ser au fost colectate la punctele de timp indicate după prima imunizare. (A) Anticorpii împotriva proteinei spike de lungime completă SARS-CoV-2 au fost evaluați prin ELISA. (B, C) Activitatea de neutralizare indusă de vaccin împotriva SARS-CoV-2 cu genotipurile D614 sau G614 a fost evaluată prin test de neutralizare. Titrurile de anticorpi sunt prezentate ca medie ± SEM, iar titrurile de neutralizare sunt exprimate ca medie geometrică cu un interval de încredere de 95%. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Inducerea Th1- sau Th2-răspunsurile părtinitoare

Celulele T CD4+ efectoare pot fi subdivizate în două subseturi funcționale principale, Th1 și Th2, pe baza citokinelor secretate la activare. Celulele Th1 produc citokine inflamatorii (IFN-) și participă la răspunsurile imune mediate de celule față de bacterii și viruși intracelulari, în timp ce celulele Th2 secretă în principal ajută celulele B să producă anticorpi, dar și să promoveze imunitatea mediată de eozinofile (IL-5 și IL{{ {9}}), ducând la răspunsuri umorale sau alergice [25, 26]. Mai mult decât atât, mecanismele dependente de celulele Th2 pot contribui la boala respiratorie îmbunătățită asociată vaccinului (VAERD), așa cum arată studiile candidaților la vaccinul SARS-CoV.27, 28], care evidențiază că un răspuns echilibrat al celulelor T este esențial pentru dezvoltarea sigură a vaccinului COVID-19 [29]. Pentru a rezolva această problemă, șoarecii BALB/c și C57BL/6 au fost imunizați cu vector, pSARS-S și pSARS2-S de două ori la un interval de 3-săptămână. Șoarecii au fost sacrificați la 7 zile după a doua imunizare și splenocitele au fost stimulate cu proteina S SARS-CoV-2 (5 ug/ml) timp de 3 zile. La șoarecii BALB/c (Fig. 5A–5D), secreția citokinelor de tip Th1 IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) și IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) a fost ridicată după stimularea cu proteina S în pSARS2-S grupul de imunizare, dar au fost detectate niveluri foarte scăzute ale citokinelor de tip Th2 IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) și IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2). Rezultate similare au fost observate la șoarecii C57BL/6, grupul de imunizare pSARS2-S a indus o cantitate mai mare de IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) și IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) decât aceea de IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) și IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Fig. 5E–5H). Aceste date au sugerat că pSARS2-S ar putea induce răspunsuri imune părtinitoare Th{1-.

Fig. 5. Răspunsul celulelor T la șoareci după imunizare cu vaccinuri ADN pSARS-S și SARS2-S.

Șoarecii BALB/c (AD) și C57BL/6 (EH) (n=4 per grup) au fost imunizați intramuscular de două ori la un interval de 3-săptămână cu 100 ug de vector, pSARS-S sau pSARS{{ 8}}S, urmată de electroporare. Splenocitele au fost colectate în săptămâna 4 după prima imunizare, iar nivelurile secretate de IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) și IL -13 (D, H) au fost evaluate după restimulare cu proteina S SARS-CoV-2 recombinantă. Titrurile de anticorpi sunt prezentate ca medie ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Provocarea privind eficacitatea profilactică a vaccinurilor ADN împotriva SARS-CoV-2

Pentru a explora eficacitatea protectoare a vaccinării pSARS2-S, hamsterii sirieni au fost imunizați de două ori cu 100 ug ADN la un interval de 3-săptămâni și provocați intranazal cu virusul SARS-CoV-2 în săptămâna 7 (Fig 6A). După imunizare, serurile din săptămâna 4 și săptămâna 6 au fost colectate pentru titrul de anticorpi anti-spike (IgG) și titrul de anticorpi neutralizanți. Imunizarea cu pSARS2-S a determinat niveluri mai mari de titruri de anticorpi anti-Spike decât imunizarea ptRBD în săptămâna 4 (1584,9 vs. 50,1) și săptămâna 6 (1995,3 vs. 63,1) la hamsteri (Fig 6B). În concordanță cu titrurile de anticorpi anti-Spike, serurile de hamsteri imunizați cu pSARS2-S au crescut titruri de anticorpi neutralizanți foarte mari (6,5 în săptămâna 4 și 6,4 în săptămâna 6 (log2)), dar serurile de vector sau Hamsterii imunizați cu ptRBD nu au (Fig 6C). După provocarea cu SARS-CoV-2, greutatea corporală a hamsterului a fost monitorizată în fiecare zi. Studiile anterioare au arătat că titrul viral din plămânii de hamster a atins un nivel ridicat la 3 zile după provocare [30]. Prin urmare, jumătate din hamsterii din fiecare grup au fost sacrificați în ziua 3 și a fost analizată încărcătura virală din plămân. Greutatea corporală a hamsterilor vaccinați cu vectori a scăzut treptat, iar procentul de greutate corporală pierdut a fost de 11,1% la 6 zile după provocare. În schimb, imunizarea pSARS2-S a protejat hamsterii de pierderea în greutate (Fig 6D). În plus, titrurile virusului infecțios și numărul de copii de ARN viral în grupul pSARS2-S au prezentat reduceri de 2,29 și 1,37 log10 în comparație cu grupul de control al vectorului (Figurile 6E și 6F). Aceste rezultate au sugerat că imunizarea pSARS2-S conferă protecție împotriva infecției cu SARS-CoV-2 la hamsterii sirieni.

Fig. 6. Eficacitatea profilactică a vaccinului ADN SARS-CoV-2S la hamsterii infectați cu SARS-CoV-2-.

(A) Cursul de timp al vaccinării ADN și provocării SARS-CoV-2. Hamsterii sirieni au fost imunizați intramuscular de două ori la un interval de 3-săptămână cu 100 ug de control, pSARS-S sau pSARS2-S, urmat de electroporare. Probele de ser au fost colectate prin prelevare retroorbitală de sânge în săptămânile 4 și 6 după prima imunizare. La 4 săptămâni după a doua imunizare, hamsterii sirieni au fost provocați intranazal cu 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Anticorpii împotriva proteinei spike de lungime completă SARS-CoV-2 au fost evaluați prin ELISA. (C) Activitatea de neutralizare indusă de vaccin împotriva SARS-CoV-2 a fost evaluată prin test de neutralizare. (D) Modificarea greutății corporale (%) a hamsterilor a fost înregistrată în fiecare zi după provocarea SARS-CoV-2. Titrurile de virus (E) și copiile de ARN viral (F) în plămânii hamsterilor infectați cu SARS-CoV-2-la 3 zile după provocare au fost determinate prin testul TCID50 și, respectiv, qRT-PCR. Titrurile de anticorpi sunt prezentate ca medie ± SEM, iar titrurile de neutralizare sunt exprimate ca medie geometrică cu un interval de încredere de 95%. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Discuţie

Au fost lansate peste 80 de studii clinice de vaccin COVID-19, iar studiile de imunogenitate și provocarea virală la animale sunt pași esențiali în procesele de dezvoltare a vaccinului. Vaccinurile ADN pentru infecția cu SARS-CoV-2 au fost dezvoltate intens pentru diferite abordări de livrare. Electroporarea este o abordare promițătoare care poate îmbunătăți livrarea ADN-ului și antigenitatea imunogenilor in vivo. Au fost raportate două studii de vaccin ADN, de către Yu et al. [13] şi Smith şi colab. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3,1 reduceri log10 ale încărcăturii virale în lavajul bronhoalveolar după provocare în comparație cu martori. Smith şi colab. a constatat că imunizarea șoarecilor și a cobaiilor cu INO-4800 (codând proteina S de lungime completă) cu electroporare ar putea genera anticorpi neutralizanți împotriva infecției cu SARS-CoV-2 și ar putea bloca legarea proteinei S de receptorul ACE2, dar a făcut nu furnizează date de provocare a animalelor. În acest raport, am evaluat diferite variante pentru vaccinul ADN candidați și am constatat că proteina S de lungime completă (pSARS2-S) este cea mai potrivită pentru studii imunologice ulterioare. Deși SARS-CoV și SARS-CoV-2 au o omologie de 76% în proteinele lor S [31, 32], imunizarea pSARS-S nu poate induce anticorpi împotriva RBD al proteinei SARS-CoV-2 S sau titruri de anticorpi neutralizanți împotriva infecției cu SARS-CoV-2 (Fig 2). Într-adevăr, anticorpii anti-RBD joacă un rol important în blocarea infecției virale. Cu toate acestea, imunizarea cu RBD singur (ptRBD) a generat titruri mari de anticorpi neutralizanți la șoareci, dar nu și la hamsteri (Fig.2Hși6C). Am speculat că acest rezultat se poate datora faptului că peptida semnal (activator tisular-plasminogen) nu facilitează secreția proteinei RBD la hamsteri. Mecanismul detaliat necesită studii suplimentare în viitor. Am observat, de asemenea, că imunizarea cu ptRBDTM (codifică un fragment din RBD în domeniul transmembranar al S) a indus titruri de anticorpi neutralizanți mai mici decât imunizarea cu ptRBD (Fig.2HșiS1C). Rezultatele pot reflecta structura instabilă a proteinei RBD-TM. Pentru a investiga în continuare răspunsurile imune Th1/Th2, splenocitele de la șoareci imunizați au fost stimulate cu proteina S SARS-CoV-2. Am constatat că imunizarea pSARS2-S a indus răspunsuri imune puternice cu Th{1-prejudecate cu niveluri mai mari de secreție de IFN{- -după stimulare (Fig 5), dar imunizarea pSARS-S a indus doar niveluri scăzute de secreție de IFN- -. Aceste date au indicat că reactivitatea încrucișată a răspunsurilor celulelor T între proteina de vârf a SARS-CoV și SARS-CoV-2 nu este mare (Fig 5). Mai mult, testul IFN-ELISPOT a arătat că au fost detectate mai puține răspunsuri ale celulelor T împotriva regiunii S1 la șoarecii C57BL/6 și BALB/c imunizați cu pSARS-S (S2 Fig), care este susținut și de studiul lui Smith [12]. Aceste date au indicat că este posibil ca vaccinul SARS să nu ofere un efect de protecție complet împotriva infecției cu SARS-CoV-2. Dezvoltarea vaccinurilor ADN este importantă pentru un răspuns rapid la infecția pandemică cu coronavirus. Prin urmare, succesul vaccinului ADN împotriva SARS-CoV-2 ar putea fi aplicat altor boli infecțioase emergente.

Diferitele constructe utilizate în vaccinurile ADN SARS-SoV-2 au indus niveluri diferite de titruri de anticorpi neutralizanți. Secvența lider tPA a fost folosită pentru a crește expresia și secreția antigenului în vaccinurile ADN [21, 33–35]. Cu toate acestea, secvența lider tPA nu a crescut semnificativ titrurile de anticorpi din acest raport. Pentru a crește și mai mult eficacitatea vaccinului, diferite secvențe lider ar putea fi utilizate pentru a înlocui secvența lider nativă a proteinei spike. Secvența lider IgE a fost utilizată în vaccinul ADN INO-4800 și vaccinul MERS-CoV [5, 12]. În plus, secvența modificată a proteinei spike poate crește, de asemenea, imunogenitatea vaccinului. O proteină spike stabilizată a fost proiectată prin mutarea locului furin și a altor regiuni pentru a genera o structură de prefuzie (S-2P) care poate crește expresia proteinei spike de ~10-ori [36]. Un vaccin ADN ideal ar trebui să optimizeze construcția ADN-ului plasmidic și sistemul de livrare pentru a crește nivelul de expresie a proteinei.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Modelele animale sunt esențiale pentru dezvoltarea vaccinului COVID-19. Au fost folosite mai multe modele animale pentru a evalua eficacitatea vaccinurilor COVID-19, inclusiv primatele non-umane [13, 37], șoareci transgenici umani ACE2 [38] și hamsterii sirieni [39]. Hamsterul sirian ACE2 are o asemănare mare cu ACE2 uman, iar afinitatea sa de legare la proteina S a SARS-CoV-2 a fost prezisă mai mare decât ACE2 la șoarece.40]. Acesta este motivul pentru care șoarecii transgenici umani ACE2 au fost utilizați ca modele de provocare SARS-CoV-2, dar nu și șoarecii de tip sălbatic. Studiile privind transmiterea SARS-CoV-2 au arătat că virusul poate infecta eficient hamsterii naivi prin contact direct sau prin aerosoli [41]. Infecția intranazală cu SARS-CoV-2 se poate replica și induce patogeneza în plămânii hamsterilor sirieni [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>reducere de 5% față de valoarea inițială), care a fost asociată cu durata mai lungă a bolii [42]. Aceste descoperiri indică faptul că hamsterul sirian este, de asemenea, un model animal potrivit pentru evaluarea vaccinurilor COVID-19. Pe baza disponibilității modelelor animale, am ales hamsterii ca model de provocare SARS-CoV-2 pentru a evalua eficacitatea vaccinului. Datele noastre au arătat că imunizarea cu pSARS2-S, dar nu cu ptRBD, poate induce titruri mari de anticorpi IgG anti-Spike și titruri de anticorpi neutralizanți (Figurile 6B și 6C). În consecință, hamsterii imunizați cu pSARS2-S, dar nu și hamsterii imunizați cu ptRBD, au generat răspunsuri imune împotriva provocării SARS-CoV-2. Am observat că imunizarea cu ptRBD ar putea induce niveluri ridicate de titruri de anticorpi neutralizanți la șoareci, dar nu și la hamsteri. Rezultatele contradictorii se pot datora faptului că RBD singur nu este exprimat stabil la hamsteri. Modelul de hamster a fost folosit și pentru a evalua vaccinul COVID-19 bazat pe vectori adenovirus serotip 26 (Ad26). O singură imunizare cu vaccinul pe bază de vector Ad26 care exprimă o proteină spike stabilizată SARS-CoV-2 care a provocat răspunsuri de anticorpi neutralizanți și protejată împotriva infecției cu SARS-CoV-2 a indus pierderea în greutate, mortalitatea parțială și replicarea virală în plămâni [39]. Aceste rezultate au indicat că modelul de hamster este potrivit pentru evaluarea eficacității vaccinurilor COVID-19.

Multe eforturi de dezvoltare a vaccinurilor SARS-CoV-2 se bazează pe experiența de cercetare a MERS-CoV și SARS-CoV. La nivel global, mai multe vaccinuri COVID-19 au fost aprobate pentru utilizare emergentă în decembrie 2020, inclusiv vaccinuri pe bază de vectori ARN și adenovirus COVID-19. Avantajele și dezavantajele diferitelor platforme de vaccin au fost discutate [43]. Vaccinurile cu vectori de adenovirus pot provoca răspunsuri imune mai puternice decât vaccinurile cu ADN și ARNm, dar eficacitatea vaccinului lor ar putea fi redusă prin imunitatea preexistentă împotriva vectorilor de publicitate.44]. În comparație cu vaccinul ADN, vaccinul ARNm are nevoie de temperatură ultra-scăzută pentru depozitare și transport.45]. Prin urmare, vaccinul ADN ar putea fi o potențială platformă de vaccin, mai ales în timpul utilizării în situații de urgență.

Studiul nostru sugerează posibilitatea unui vaccin ADN pentru uz uman. Studii ulterioare ar putea investiga eficacitatea acestui vaccin ADN administrat prin injectare intradermică (ID), ceea ce este mai convenabil pentru aplicarea clinică, deoarece acul pentru injectarea IM are aproximativ 18 mm adâncime la om și afectează mai multe țesuturi decât injectarea ID prin EP. Mai mult, eficacitatea vaccinului ar trebui testată la șoareci în vârstă ca model pentru oamenii în vârstă, deoarece această populație este afectată în mod deosebit de grav atunci când este infectată cu SARS-CoV-2. Studiile anterioare au arătat că răspunsul celulelor Th2 a fost asociat cu boala respiratorie amplificată (VAERD) în urma vaccinării vaccinurilor cu virus inactivat împotriva RSV.46], virusul rujeolei [47] și SARS-CoV [27, 48]. În schimb, există cazuri mai puțin severe de SARS-CoV care rezultă din inducerea răspunsului celulelor Th1 raportate.49]. Prin urmare, răspunsurile imune puternice părtinitoare Th1-induse de vaccinul ADN sugerează că este puțin probabil ca efectele secundare să fie o problemă majoră [50]. Pe lângă aceasta, au fost ridicate preocupări cu privire la vaccinurile pe bază de proteine ​​din cauza utilizării sării de aluminiu sau a adjuvanților de tip emulsie ulei-în-apă, care duc la răspunsuri imune părtinitoare Th2-și cresc potențialele efecte secundare [51, 52]. Pe scurt, vaccinul ADN COVID-19 poate juca un rol major în controlul pandemiei COVID-19 în viitorul apropiat.

Referințe

1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Consecințele economice ale epidemiei de COVID-19: nevoia de pregătire pentru epidemii. Frontul Sănătăţii Publice. 2020;8:241. pmid:325743072. Centrul de Știință și Inginerie a Sistemelor (CSSE) [Internet]. Tabloul de bord COVID-19. Universitatea Johns Hopkins. [citat 11 februarie 2021]. Disponibil de la:
2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K și colab. Contribuții ale proteinelor structurale ale coronavirusului sindromului respirator acut sever la imunitatea protectoare. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid:15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K și colab. Un vaccin ADN induce neutralizarea coronavirusului SARS și imunitate protectoare la șoareci. Natură. 2004;428(6982):561–4. pmid:15024391
4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Un vaccin sintetic ADN anti-spice proteic consens induce imunitate protectoare impotriva coronavirusului sindromului respirator din Orientul Mijlociu la primatele non-umane. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid:26290414
5. 6. Vaccinuri Krammer F. SARS-CoV-2 în dezvoltare. Natură. 2020;586(7830):516–27. pmid:32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. Imunitatea de protecție împotriva candidaților la vaccinul subunității SARS pe baza proteinei Spike: Lecții pentru dezvoltarea vaccinului împotriva coronavirusului. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid:32695833
7. 8.Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z și colab. Răspunsuri imune umorale și celulare induse de vaccinurile ADN 3a împotriva sindromului respirator acut sever (SARS) sau a coronavirusului asemănător SARS la șoareci. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(1):73–7. pmid:18987164
8. 9.Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Obținerea anticorpilor neutralizanți cu vaccinuri ADN care exprimă trimeri de glicoproteină a anvelopei virusului imunodeficienței umane stabilizați solubili de tip 1 conjugați cu C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid:15078953
9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Optimizarea unui vaccin ADN împotriva SARS. ADN Celulă Biol. 2007;26(10):721–6. pmid:17665998
10. 11.Gary EN, Weiner DB. Vaccinuri ADN: ora de vârf este acum. Curr Opin Immunol. 2020;65:21–7. pmid:32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J și colab. Imunogenitatea unui vaccin ADN candidat pentru COVID-19. Nat Commun. 2020;11(1):2601. pmid:32433465
12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH și colab. Protecția vaccinului ADN împotriva SARS-CoV-2 la macacii rhesus. Ştiinţă. 2020;369(6505):806–11. pmid:32434945
13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Metode de livrare pentru a crește absorbția celulară și imunogenitatea vaccinurilor ADN. Vaccin. 2016;34(46):5488–94. pmid:27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M și colab. Răspuns rapid la o boală infecțioasă în curs de dezvoltare — Lecții învățate din dezvoltarea unui vaccin ADN sintetic care vizează virusul Zika. Microbii infectează. 2018;20(11–12):676–84. pmid:2955534516.Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C și colab. Semnătura moleculară și celulară înnăscută în piele precedând răspunsurile de lungă durată a celulelor T după vaccinarea cu ADN electroporat. J Immunol. 2020;204(12):3375–88. pmid:32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et al. Un nou dispozitiv prototip pentru livrarea simultană a vaccinului ADN cu electroporație, atât pe piele, cât și pe mușchi. Vaccin. 2011;29(39):6771–80. pmid:21199706
16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS și colab. Imunogenitatea sporită și eficacitatea protectoare a unui vaccin tetravalent dengue ADN folosind electroporarea și livrarea intradermică. Vaccin. 2019;37(32):4444–53. pmid:31279565
17. 19. Ramakrishnan MA. Determinarea titrului final de 50% folosind o formulă simplă. Lumea J Virol. 2016;5(2):85–6. pmid:27175354
18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK și colab. Detectarea noului coronavirus din 2019 (2019-nCoV) prin RT-PCR în timp real. Supravegherea euro. 2020. pmid:31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q și colab. Secvența semnalului activatorului de plasminogen tisular (tPA) sporește imunogenitatea vaccinului pe bază de MVA împotriva tuberculozei. Immunol Lett. 2017;190:51–7. pmid:28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y și colab. Mecanismul de fuziune a 2019-nCoV și inhibitorii de fuziune care vizează domeniul HR1 în proteina spike. Cell Mol Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid:32047258