Echinacozidul întârzie senescența celulară a celulelor fibroblastice umane MRC-5
Mar 10, 2022
Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Ingredientul activ al Cistanche: Cum face echinacozidul anti-îmbătrânire?
Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1
În acest studiu, au fost investigate efectele echinacozidei, unul dintre feniletanoizii izolați din tulpinile de salsa Cistanches, un medicament pe bază de plante tradiționale chinezești, asupra celulelor fibroblastice MRC-5 ale embrionului uman pulmonar. Activitatea proliferării celulare a fost evaluată cu Alamar Blue, arătând că tratamentul cu echinacozidă ar putea întârzia senescența. Rezultatele citometriei în flux arată că echinacozidul ar putea declanșa celulele din faza G1 să intre în faza S și faza G2 și ar putea îmbunătăți degradarea ROS. Rezultatele testului cu comete indică faptul că echinacozidul ar putea proteja celulele de deteriorarea ADN-ului, elucidând parțial mecanismul efectelor sale. Toate rezultatele de mai sus sugerează că echinacozidul are o activitate potențială anti-senescență.
Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe
1. Introducere
Celulele normale cultivate in vitro proliferează pentru un număr limitat de dublari ale populației („limita Hayflflick”) și intră într-o etapă de senescență replicativă. Celulele senescente suferă oprirea creșterii celulare în faza G1 și o schimbare a morfologiei și metabolismului, inclusiv mărirea celulară, creșterea biogenezei lizozomului și expresia unei activități mai mari a galactozidazei la pH 6 (galactozidază asociată senescenței, SA- - -Gal). ) (Hayflflick și Moorhead 1961; Dimri 1995). Acumularea de celule senescente prognozează declinul legat de vârstătesut/organfuncții. Pentru a accesa calea de întârziere sau inversare a îmbătrânirii, eforturile de a descoperi substanțe active anti-îmbătrânire nu au încetat niciodată.Echinacoziduleste unul dintre feniletanoizii izolați din tulpini alesalsa de cistanche, un medicament din plante tradiționale chinezești, care are activități biologice potențiale, atât ca antiser, cât șianti obosealaagent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). De asemenea, sa raportat că se comportă in vitro ca un puternicgratuitradicalgunoier(Facino et al. 1995) și exponateneuroprotectorActivitățiin vitro și in vivo (Koo și colab. 2005; Geng și colab. 2007). Echinacozidul poate fi un candidat pentru o substanță anti-îmbătrânire, iar o activitate anti-îmbătrânire ar putea fi una dintre proprietățile sale biologice. Astfel, am tratat o linie celulară fibroblastică pulmonară a embrionului uman senescent MRC-5 cu echinacozidă, așteptându-ne să întârzie sau să inverseze senescența.
2. Investigații și rezultate
În primul rând, am adăugat echinacozidă în mediul de cultură pentru a verifica influența acestuia asupra creșterii și ciclurilor celulare. S-a observat că viabilitatea celulelor cu expunere de 48 de ore la echinacozidă a crescut în mod evident în raport cu controlul, pe măsură ce concentrația a crescut (Fig. 1A), indicând faptul că echinacozidul a ajutat celulele senescente să prolifereze. Rezultatul colorării cu SA-Gal a arătat că nivelul de SA--Gal a scăzut în mod evident după tratamentul cu echinacozide (datele nu sunt prezentate), sugerând că o parte din celulele senescente au fost inversate de senescență. Pentru a confirma dacă celulele senescente au fost într-adevăr propulsate să prolifereze de către echinacozidă, a fost introdusă citometrie pentru a verifica alterarea fazei ciclului celular a celulelor senescente MRC-5 după tratamentul cu echinacozidă. În studiul nostru, am observat că, odată cu creșterea concentrației de Echinacoside, raportul de celule în perioada G1 a fost redus treptat. Dimpotrivă, mai multe celule au fost conduse să intre în faza S și faza G2 (Fig. 1B). Acumularea de focare heterocromatine asociate senescenței (SAHF) este un alt biomarker specific al celulelor senescente (Shay și Wright 2001). Celulele senescente au prezentat focare ADN punctate care au fost vizualizate prin colorare Hoechst (Fig. 1C). În schimb, celulele MRC-5 tratate cu echinacozidă par să aibă mai puțin SAHF.
Nivelul speciilor reactive de oxigen (ROS) crește pe măsură ce celulele se apropie de limita Hayflflick (Hutter et al. 2002). Tratamentul continuu al celulelor cu niveluri subletale de ROS nu numai că mărește nivelul produselor de deteriorare oxidativă, cum ar fi lipofuscina (Sitte et al. 2001), dar provoacă și oprirea permanentă a creșterii însoțită de activarea inhibitorului p53-creșterii. cale (Toussaint et al. 2000). Prin urmare, la nivel celular, ROS joacă un rol cheie în inducerea senescenței. Colorantul fluorescent FL DCFH-DA a fost utilizat pentru a măsura conținutul de ROS cu citometrie colegială. S-a arătat că, în comparație cu controlul, conținutul de ROS a scăzut în mod evident în celulele incubate cu echinacozidă (Fig. 2A). Aceste rezultate indică faptul căechinacozidar putea acționa ca un antioxidant, scăzând producția de ROS sau accelerând eliminarea ROS.
Speciile reactive de oxigen acumulate (ROS) cauzează afectarea remarcabilă a macromoleculelor din celule, inclusiv proteine, ADN și telomeri (Kovtun și colab. 2007). Leziunile oxidative ale ADN-ului declanșează oprirea creșterii G1 dependentă de p53-, ca urmare a exprimării p21Waf-1/SDI{-1/Cip1 (Chen și colab. 1998) și senescența celulară la fibroblastele oamenilor normali. Am folosit un test de cometă pentru a măsura deteriorarea ADN-ului și repararea acestuia. Mărimea fragmentelor de ADN și numărul de pauze determină migrația și modelul cometei văzute. Conținutul de ADN al cozii (produsul lungimii cozii și al conținutului de ADN al cozii) crește odată cu deteriorarea. Rezultatele noastre arată că pretratarea cu echinacozidă poate promova parțial repararea daunelor ADN, cel puțin proteja celulele de leziunile ADN cauzate de H2O2 (Fig. 2B). Pe baza acestor fapte, concluzionăm că echinacozidul are activitate antisenescență cel puțin în celulele MRC-5. Rezultatele studiului nostru arată că echinacozidul poate reduce acumularea de ROS, poate proteja celulele de deteriorarea ADN-ului, poate promova celulele MRC-5 din faza G1 în fazele S și G2 și, astfel, poate îmbunătăți proliferarea celulelor. În general, efectele echinacozidei asupra celulelor MRC-5 ar putea fi împărțite în două aspecte: pentru a promova proliferarea celulară și pentru a reduce acumularea de ROS. Deși mecanismul precis al senescenței celulare este încă necunoscut și rețeaua de reglare a ciclului celular rămâne controversată, am demonstrat că echinacozidul poate proteja celulele de deteriorarea oxidativă. Prin urmare, speculăm căechinacozidar putea fi un bun candidat pentru reglarea senescenței, chiar dacă mecanismul subiacent precis rămâne o întrebare deschisă și studii suplimentare sunt în desfășurare.
3. Experimental
3.1. Cultură și tratament celular
Linia de celule fibroblastice pulmonare embrionare umane MRC{{0}} (Institutul de Biochimie și Biologie Celulară, SIBS, CAS) a fost menținută în mediu minim esențial modificat (Gibco/BRL) și suplimentată cu 10% ser fetal bovin. Celulele MRC-5 suferă senescență replicativă după mai multe treceri celulare, evaluată prin încetinirea metabolismului și încetarea diviziunii în 7 zile. Toate culturile au fost însămânțate la o densitate celulară de 104/cm2 dacă nu s-a menționat altfel și au fost lăsate să prolifereze, netulburate, timp de 7 zile. S-au adăugat diferite concentrații de echinacozidă cu 48 de ore înainte de examinare cu solvent ca martor, dacă nu se specifică altfel. Concentrația de DMSO în culturi a fost mai mică de 0,3 procente (v/v). Pentru tratamentul cu H2O2, celulele au fost induse cu H2O2 250 M timp de 12 ore.
3.2. Testul ratei de supraviețuire
Celulele au fost cultivate și tratate cu echinacozidă pe plăci cu 96 de godeuri. Înainte de detectare, 10% Alamar BlueTM a fost adăugat la mediu și incubat timp de 4 ore. Absorbanța a fost măsurată cu un spectrofotometru.
3.3. Analiza citometriei în flux
Citometria în flux a fost introdusă pentru a măsura conținutul de ADN și nivelurile intracelulare de ROS folosind iodură de propidiu și, respectiv, DCFH-DA. Celulele au fost placate la o densitate de 105 celule/10 ml soluție celulară în vase cu diametrul de 100 mm și suplimentate cu echinacozidă timp de 48 de ore după însămânțarea celulelor. După 48 de ore de tratament, celulele au fost recoltate și spălate în PBS după centrifugare, apoi resuspendate în soluție de PBS cu 0,1% RNază și 50 g/ml iodură de propidiu sau mediu de cultură care conține 10 M DCFH-DA timp de 30 de minute. Conținutul de ADN sau ROS a fost apoi determinat prin sortarea celulelor activate cu fluorescență FL pe un sistem de citometrie în flux Beckman Coulter. Datele au fost analizate cu software-ul MultiCycle.
3.4. Colorarea Hoechst
Celulele au fost cultivate și tratate cu echinacozidă timp de 48 de ore pe o placă cu 96 de godeuri. Mediul a fost îndepărtat, Celulele au fost spălate cu PBS, apoi fixate cu formaldehidă 4% în PBS timp de 20 de minute, urmate de spălare cu PBS o dată și colorate cu colorant Hoechst timp de 10 minute. Imaginile au fost surprinse.
3.5. Electroforeză pe gel cu o singură celulă (testul cometei)
Analiza cometei a fost efectuată așa cum sa raportat (Olive și Banath 2006). Imaginile individuale ale cometelor au fost analizate cu software-ul CometScore. Recunoaștere: Această lucrare a fost susținută financiar de Programul național de cercetare de bază (Proiectul 973) al Chinei (nr. 2007CB507406), Fundația Națională de Științe Naturale din China (nr. 30572341) și Fondul de Științe Medicale Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008). ).
