Efectul vaccinării cu pulpei asupra dezvoltării și longevității imunității Partea 1

Abstract:

Boala respiratorie aviară provoacă pierderi economice semnificative la păsările comerciale. Datorită necesității de a proteja păsările cu viață lungă împotriva agenților patogeni ai tractului respirator de la o vârstă fragedă, programele de vaccinare pentru puii implică de obicei administrarea în serie a unei varietăți de vaccinuri, inclusiv virusul bronșitei infecțioase (IBV), virusul bolii Newcastle (NDV) și virusul infecțios. virusul laringotraheitei (ILTV). Adesea, intervalul dintre vaccinări este doar o chestiune de câteva săptămâni, dar nu se știe dacă dezvoltarea imunității și protecției împotriva provocării atunci când vaccinurile sunt administrate în succesiune scurtă are loc la aceste păsări, ceva cunoscut sub numele de interferență virală. Obiectivul nostru a fost de a determina dacă vaccinurile vii atenuate administrate în serie împotriva IBV, NDV și ILTV influențează dezvoltarea și longevitatea imunității și protecția împotriva provocărilor la păsările cu viață lungă.

Pe baza unui program obișnuit de vaccinare a puilor, liveronilor albi fără agenți patogeni li s-au administrat mai multe vaccinuri vii atenuate împotriva IBV, NDV și ILTV până la vârsta de 16 săptămâni (WOA), după care anumite grupuri au fost provocate cu IBV, NDV sau ILTV. la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA. La cinci zile după provocare, încărcătura virală, semnele clinice, criostaza, histopatologia traheală și titrurile de anticorpi în ser și lacrimi au fost evaluate. Demonstrăm că puii care au administrat în serie vaccinuri vii atenuate împotriva IBV, NDV și ILTV au fost protejați împotriva provocării omoloage cu IBV, NDV sau ILTV timp de cel puțin 36 de săptămâni și concluzionăm că intervalul dintre vaccinări utilizat în acest studiu (cel puțin 2 săptămâni ) nu a interferat cu protecția. Aceste informații sunt importante deoarece arată că un program tipic de vaccinare a puilor, constând din vaccinuri vii atenuate administrate în serie împotriva agenților patogeni respiratori multipli, poate duce la dezvoltarea imunității protectoare împotriva fiecărui agent de boală.

Apropo de imunitate, corpul uman are și multe lucruri care pot îmbunătăți imunitatea, precum Cistanche, care este, de asemenea, bogat în substanțe biologic active, precum peptide, terpene, acizi fenolici etc., care pot stimula activarea celulelor imune și îmbunătățirea celulelor imunitare. functioneaza si sporesc imunitatea organismului. Aceste substanțe biologic active pot, de asemenea, regla și activa funcția autoimună a organismului, îmbunătățind și mai mult imunitatea umană.

Faceți clic când să luați cistanche

Cuvinte cheie:

Virusul bronșitei infecțioase; virusul bolii de Newcastle; virusul laringotraheitei infecțioase; program de vaccinare; imunitate; boala respiratorie; criostază; răspunsul anticorpilor.

1. Introducere

Vaccinarea împotriva bolilor virale respiratorii este o practică standard în operațiunile comerciale de păsări. Atât vaccinurile vii, cât și cele ucise sunt administrate păsărilor de curte, iar vaccinurile vii sunt utilizate în mod obișnuit pentru o varietate de agenți patogeni, deoarece sunt eficiente atunci când sunt aplicate în masă și sunt relativ economice [1]. În general, vaccinurile vii induc imunitatea locală și mediată celular și oferă un răspuns protector mai larg decât vaccinurile ucise, în timp ce vaccinurile ucise induc în primul rând imunitatea umorală și tind să fie specifice antigenului. Durata imunității obținute în urma administrării vaccinului viu depinde de vârsta și tipul de pasăre, de nivelul imunității materne, de boala vizată de vaccin, de imunogenitatea vaccinului, de metoda de aplicare a vaccinului, de numărul și de intervalul dintre rapeluri, de virulență și de similitudine. a virusului provocării de câmp, intervalul dintre vaccinare și provocare și imunocompetența gazdei [1–3].

Virusul bronșitei infecțioase cu coronavirus aviar (IBV) este un agent patogen viral al tractului respirator superior al păsărilor de curte și duce la o creștere în greutate și eficiență alimentară reduse, scăderi ale producției de ouă și ale calității ouălor, încetinire a creșterii și infecție bacteriană secundară care are ca rezultat airsacculita [4]. Virusul se replic inițial în tractul respirator superior, urmat de replicare sistemică în tractul reproducător, iar unele tulpini pot provoca leziuni la rinichi [4]. Păsările infectate pot prezenta scurgeri nazale, tuse, strănut și râs traheal [4]. Boala este prevenită prin vaccinare, iar vaccinurile vii sunt utilizate în mod obișnuit pentru a induce imunitatea și protecția locală. Vaccinurile vii sunt, în general, administrate păsărilor tinere pentru a obține o protecție timpurie, iar ouatoarele și reproducătorii sunt, de asemenea, stimulați cu vaccinuri vii sau inactivate, care variază în funcție de similitudinea lor cu virusurile de câmp circulante [2].

Boala Newcastle (ND) este cauzată de tulpini virulente de paramixovirus aviar de tip 1, care a fost recent reclasificat ca avulavirus aviar 1 (AAvV-1) [5]. În funcție de tulpina virusului, semnele clinice ale infecției cu ND pot fi absente sau pot implica depresie, inapetență, semne respiratorii (secreții nazale, strănut, tuse), producție redusă de ouă și calitatea ouălor și semne neurologice (torticolis, rotire, paralizie). ) [3]. Tulpinile virusului bolii de Newcastle (NDV) sunt caracterizate ca lentogenice, mezogenice și velogenice, în funcție de timpul mediu al morții lor în embrioni [6]. Tulpinile lentogenice au o patogenitate scăzută provocând infecții respiratorii sau enterice ușoare, urmate de tulpini mezogene, în timp ce izolatele velogenice sunt foarte patogenice provocând adesea semne neurologice și mortalitate [3]. Regimurile de vaccinare împotriva NDV variază și pot utiliza o combinație de vaccinuri vii, inactivate și vectorizate de virus [7]. În Statele Unite, cele mai utilizate tulpini de vaccin tradiționale cuprind tulpinile lentogenice B1 (sau clonele virale ale tulpinii B1) și tulpinile LaSota [3].

Laringotraheita infecțioasă (ILT) este o boală respiratorie a păsărilor de curte cauzată de alfaherpesvirusul galled I și este importantă din punct de vedere economic la nivel mondial [8]. Manifestările clinice ale ILT includ mortalitate crescută, scăderea producției de ouă, scăderea creșterii în greutate corporală, conjunctivită, traheită cu expectorație de mucus cu sânge în cazuri severe, depresie, dispnee severă și susceptibilitate la alți agenți patogeni respiratori. Vaccinurile vii împotriva virusului ILT (ILTV) pot fi de origine a embrionului de pui (CEO) sau de origine a culturii de țesuturi (TCO), în care sunt trecute de mai multe ori în ouă sau, respectiv, în cultura de țesut. Deși vaccinurile recombinate pentru ILT sunt disponibile comercial, vaccinul CEO este cel mai utilizat vaccin împotriva ILTV la nivel mondial.

Datorită necesității de a proteja puii împotriva diferiților agenți patogeni virali de la o vârstă fragedă, programele de vaccinare includ de obicei mai multe vaccinuri împotriva unei varietăți de agenți patogeni. Exemple de regimuri de vaccinare în diferite sectoare de păsări sunt revizuite în Manualul veterinar Merck, în care intervalul dintre vaccinări este adesea doar o chestiune de câteva săptămâni.

Cu toate acestea, există puține informații care să arate că intervalele dintre vaccinări sunt suficiente pentru ca păsările să dezvolte o protecție imunitară adecvată împotriva provocărilor fiecărui virus. Literatura de specialitate arată că infecțiile virale secvențiale pot avea ca rezultat interferență virală, în care un virus blochează infecția ulterioară și/sau replicarea altui virus în gazdă [9,10], dar până acum nu se știe dacă acest fenomen are ca rezultat o protecție redusă. de la vaccinuri vii atenuate administrate în serie la pui. În mod interesant, s-a raportat că administrarea simultană de viruși la găini sau curcani nu are ca rezultat interferență virală [11]. În acest studiu, investigăm modul în care un program de vaccinare comercial tipic, constând dintr-o combinație de vaccinuri vii atenuate împotriva bolilor respiratorii virale, administrate în serie, afectează dezvoltarea și longevitatea imunității și protecția împotriva provocărilor omoloage.

2. Materiale și metode

2.1. Viruși

În acest studiu a fost utilizat un vaccin comercial IBV MILDVAC-GA-98® (Merck Animal Health, Summit, NJ, SUA). Vaccinul a fost diluat conform recomandărilor producătorului. Virusul de provocare utilizat a fost IBV GA98/CWL0474/98 și a fost preparat la o doză infecțioasă embrionară medie (EID50) de 103,19. Titrurile de virus au fost calculate prin metoda Reed și Muench [12]. Un vaccin comercial NDV B1 (NEWHATCH-C2, Merck Animal Health, Summit, NJ, SUA) a fost utilizat atât pentru vaccinare, cât și pentru provocare și a fost reconstituit urmând instrucțiunile producătorului.

Deoarece tulpinile mezogene și velogenice de NDV necesită un nivel de biosecuritate peste BSL2, care nu este disponibil în laboratorul nostru, modelul nostru experimental de protecție împotriva NDV implică titruri de virus reduse semnificativ sau imunitate sterilă împotriva unei a doua expuneri (provocare) cu virusul vaccin. Un vaccin comercial ILTV CEO (Trachivax® Merck Animal Health, Summit, NJ, SUA) și tulpina patogenă ILTV Georgia broiler 63140 [13] au fost utilizate pentru vaccinare și, respectiv, provocare. Tulpina 63140 a fost propagată în celule de rinichi de pui obținute de la pui 3- la 4-pui de găină fără patogen specific (SPF) vechi de 3- [14]. Vaccinul CEO a fost preparat urmând recomandările producătorului. După inoculare, doza medie infecțioasă a culturii de țesut (TCID50) a fost confirmată prin titrarea ambelor viruși în celulele rinichilor de pui, așa cum a fost descris anterior [14].

2.2. Design experimental

Ouăle fără agenți patogeni specifici au fost obținute la 18 zile de incubație și au fost clocite la Centrul de Diagnostic și Cercetare a Păsărilor de curte, Atena, GA. Puii au fost așezați pe așchii de pin proaspăt în case de colonie și țarcuri. Puii au fost vaccinați cu doza recomandată de producător în 100 µL pe cale oculonazală conform următorului program; IBV la 1 DOA, NDV la 2 săptămâni (WOA), IBV la 4 WOA, ILTV la 8 WOA, NDV la 12 WOA și ILTV la 16 WOA.

În plus, un grup de control nu a fost vaccinat. Provocări omoloage au fost efectuate la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA, iar necropsiile au fost efectuate la cinci zile după provocare (dpc). La provocare, păsările au primit unul dintre cele patru tratamente: IBV GA98, NDV B1, ILTV 63140 sau nicio provocare. Grupurile de tratament pentru fiecare virus provocat pe moment au fost următoarele: nevaccinat, neprovocat (n=9-10); vaccinat, neprovocat (n=9–10); vaccinat, provocat (n=17–19); nevaccinat, provocat (n=9–10). Toate păsările provocate de IBV au primit un EID50 de 1 × 103,2 per pasăre în 100 µL intranazal. Toate păsările provocate de NDV au primit vaccinul NDV B1 în 100 µL intranazal, reconstituit conform protocolului producătorului. Toate păsările provocate de ILTV au primit tulpina patogenă 63140 la o doză de 1 × 103,5 TCID50 per pasăre în 100 µL împărțit în mod egal între picături pentru ochi și căile intranazale. Pentru provocările IBV și NDV, păsările au fost observate la 5 dpc pentru semnele respiratorii, așa cum s-a descris anterior [15]: 0=absent; 1=uşoară; 2=moderat; 3=severă. Pentru provocările ILTV, păsările au fost observate la 3 și 5 dpc pentru dispnee, conjunctivită, depresie și mortalitate, așa cum a fost descris anterior [16].

Despicătura coaală (păsări provocate de IBV și NDV și de control la 5 dpc) sau traheea (păsări provocate de ILTV și de control la 3 și 5 dpc) au fost tamponate pentru detectarea virusului, iar tampoanele au fost depozitate în PBS la -80 ◦C. La 28, 32 și 36 WOA, s-au colectat 50 pl de lacrimi prin adăugarea de NaCI granulat în ochi. Sângele a fost colectat prin puncție aripioară sau cardiacă și adăugat într-un tub de microcentrifugă pentru a colecta ser pentru detectarea anticorpilor. Păsările au fost eutanasiate în mod uman, iar pleoapa, glanda Harderian (HG), timusul, ficatul, splina, amigdalele cecale și bursa lui Fabricius au fost colectate și depozitate la -80 ◦ C pentru detectarea virusului și în formol tamponat neutru 10%. Traheea a fost îndepărtată, o secțiune a fost plasată în formol tamponat neutru 10%, iar porțiunea rămasă a traheei a fost scufundată în medii de cultură de țesuturi pentru testul iconostas descris mai jos. Procedurile au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Universitatea din Georgia (AUP #: A2015 05-001-R2).

2.3. Testul Ciliostaza

Testul iconostasului a fost efectuat pe trahee recoltate colectate în medii de cultură celulară (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) la 37 ◦C. Pentru fiecare trahee, au fost tăiate cinci inele traheale cu o grosime de aproximativ 1 mm și au reprezentat porțiunile proximală, mijlocie și distală [17,18]. Activitatea cililor a fost observată folosind un microscop inversat (Olympus, Center Valley, PA, SUA). Sistemul de notare urmărește 0=bataia tuturor cililor; 1=75 procente din bataie de cili; 2=50 procente din bataie de cili; 3=25 procente din bataie de cili; 4=nicio bătaie de cili așa cum a fost descris anterior [17]. Scorul maxim posibil pentru fiecare trahee este 20. Fiecare inel traheal a fost punctat de trei persoane și a fost calculat scorul total mediu pentru fiecare trahee. Scorul de protecție a iconostasului pentru fiecare grup a fost determinat prin următoarea formulă: 100 − [(totalul scorurilor individuale pentru grup)/(numărul de indivizi din grup × 20) × 100] și un scor mai mare sau egal la 50 a fost considerat protejat.

2.4. Histopatologie traheală

O secțiune din fiecare trahee a fost fixată în formalină tamponată neutră 10 procente, procesată și înglobată în parafină, iar secțiuni de 5-µm au fost tăiate pentru colorarea cu hematoxilină și eozină. Pentru leziunile IBV, hiperplazia epitelială, infiltrarea limfocitelor și decilierea epitelială au fost notate pentru fiecare trahee. Scorurile au fost determinate după cum urmează: 1=normal, 2=focal, 3=multifocal și 4=difuz, așa cum s-a descris anterior [19]. Pentru leziunile NDV a fost efectuată o analiză descriptivă. Pentru leziunile ILTV, leziunile microscopice au fost notate pe o scară de la 0-5 (normală până la foarte severă), așa cum a fost descris anterior [20].

2.5. Extracția ARN și reacția cantitativă în lanț a polimerazei cu revers transcriptază (qRT-PCR)

Pentru detectarea IBV și NDV, extracția ARN viral din 50 µL de PBS din fiecare tampon a fost efectuată folosind un kit de izolare virală 5× MagMAX-96 (Thermo Fisher, Waltham, MA, SUA) pe un MagMAX™ Express{{ 3}} Procesor de particule magnetice Deep Well (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA), conform instrucțiunilor producătorului. Reacția cantitativă în lanț a polimerazei de transcripție inversă (qRT-PCR) a fost efectuată cu kitul AgPath-IDTM One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Waltham, MA, SUA), urmând protocolul producătorului. Fiecare amestec de reacție 25-µL conținea 12,5 µL de tampon 2× RT-PCR, 10 µM din fiecare primer, 4 µM de sondă, 1 µL de amestec de enzime 25× RT-PCR și 5 µL de ARN viral. Reacțiile qRT-PCR au fost efectuate pe sistemul Applied Biosystems® 7500 Fast Realtime PCR (Life Technologies Ltd., Carlsbad, CA, SUA) în următoarele condiții: un ciclu de 50 ◦ C timp de 30 de minute și 95 ◦ C timp de 15 min. , urmat de 40 de cicluri de 94 ◦C timp de 1 s și 60 ◦C timp de 60 s. Primerii și sonda pentru qRT-PCR IBV au fost publicate anterior [21] și sunt compuse dintr-un primer direct IBV50GU391 (50 -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-30), un primer invers IBV50GL533 ({ {38}}GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT G-30) și o sondă Taqman® cu dublă etichetă IBV50G (50 -FAM-CAC CAC CAG AAC CTG TCA CCT C-BHQ{{45 }} ). Primerii și sonda pentru qRT-PCR NDV au fost descriși anterior [22] și sunt formați dintr-un primer NDV M plus 4100 (5'-AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3'), un primer invers NDV M -4220 (5'-CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3') și o sondă Taqman® cu etichetă dublă NDV M plus 4169 (5'-FAM-TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC -BHQ1-3').

Primerii au fost obținuți de la Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, SUA), iar sonda Taqman a fost sintetizată de BioSearch Technologies (Novato, CA, SUA). Componentele RT-PCR în timp real și parametrii termociclorului au fost descriși anterior [21]. Datele sunt exprimate ca valoare medie a pragului ciclului (CT) pentru toate probele din fiecare grup, cu valori CT pozitive bazate pe limita de detecție pentru acest test asociată cu detectarea virusului în ouă [23].

Fiecare placă de reacție qRT-PCR a inclus o curbă standard ca control al extracției ARN și ca control pozitiv. GA98 IBV izolat din fluidul alantoic a fost folosit ca șablon pentru curba standard. În fiecare placă au fost incluse și controale negative și au constat din reactivi PCR fără ARN.

2.6. Extragerea ADN-ului

Pentru ILTV, ADN-ul total a fost extras din tampoanele traheale folosind kitul de miniprep 96-de extracție a ADN MegaZorb® (Promega, Madison, WI, SUA), așa cum a fost descris anterior [24].

2.7. qPCR

A fost efectuat un test PCR duplex în timp real care amplifică un fragment al genei virale UL44 în ILTV și un fragment al genei de colagen alfa 2-de pui, așa cum a fost descris anterior [25].

2.8. Titruri de anticorpi IgG specifici virusului bronșitei infecțioase serice (IBV).

Titrurile IgG specifice IBV au fost detectate utilizând un kit comercial de testare a anticorpilor IBV pentru testul imunosorbent legat de enzime IgG (ELISA) (IDEXX, Westbrook, ME, SUA). Pe scurt, probele de ser (depozitate la -20 ◦ C) au fost diluate 1:500, iar procedura a fost efectuată conform protocolului producătorului.

2.9. Titruri de anticorpi IgA specifici IBV cu secretie lacrimală

IgA specifică IBV lacrimală a fost detectată utilizând un kit comercial de testare a anticorpilor IgG ELISA IBV (IDEXX, Westbrook, ME, SUA). Pe scurt, lacrimile au fost diluate în serie de două ori în PBS și incubate în godeuri duplicat peste noapte la 4 ◦ C. Toate etapele de spălare au fost efectuate utilizând PBS-Tween 20 (0,05 procente Tween 20). Plăcile au fost incubate la 23 °C timp de 2 ore în IgA-BIOT monoclonal de șoarece anti-pui (1:1000, clona A-1, Southern Biotech, Birmingham, AL, SUA), urmată de 1 oră în Streptavidin-HRP ( 1:4000, Southern Biotech, Birmingham, AL, SUA). Etapele finale de detectare a anticorpilor au fost finalizate conform instrucțiunilor producătorului. Titrurile punctului final au fost determinate prin raportarea celei mai scăzute diluții la care densitatea optică (OD), înregistrată la o lungime de undă de 650 nm, a fost cu cel puțin trei abateri standard peste media a 12 godeuri de control incubate fără mostre lacrimale. Datele din godeuri cu o schimbare punctuală a culorii datorită substratului rezidual sau bulelor de aer au fost excluse din analiză, iar rezultatele au fost raportate ca log2 al titrului final.

2.10. Analize statistice

Datele au fost analizate folosind software-ul Prism v.6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, SUA). Pentru datele de încărcare virală, a fost utilizată o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) cu posttestul Dunnet pentru a compara grupurile de tratament în fiecare perioadă de colectare. Toate celelalte date au fost analizate folosind un test Kruskal-Wallis cu posttestul lui Dunn pentru a compara grupurile de tratament în fiecare perioadă de colectare. S-au determinat diferențe semnificative la p < 0.05.

3. Rezultate

3.1. Virusul bronșitei infecțioase

La 5 zile de la provocarea cu IBV GA98, păsările vaccinate/provocate au avut încărcături semnificativ mai mici de ARN în comparație cu martorii pozitivi la toate momentele de colectare și în toate probele de țesut, cu excepția amigdalei cecale la 24 WOA (Tabelul 1). La martorii vaccinați, nu a fost detectat niciun ARN IBV la toate momentele de colectare, cu excepția amigdalelor cecale la 20 și 24 WOA și a despicăturii coanale la 20 WOA. Încărcările IBV în controalele negative din toate țesuturile au fost sub limita de detectare utilizând valoarea CT mai mare sau egală cu 36,17, așa cum a fost raportat anterior [23], la toate momentele de colectare, cu excepția celor 24 de martori negativi WOA HG.

Semnele clinice ale infecției cu IBV măsurate la 5 zile după provocare au fost reduse semnificativ la păsările vaccinate/provocate în comparație cu martorii pozitivi în toate săptămânile, cu excepția 28 WOA, dar tendințele scorurilor semnelor clinice au fost numeric mai mici în rândul păsărilor vaccinate/provocate (Tabelul 2) . Semnele clinice au fost absente la păsările martor neprovocate negative și vaccinate, iar semnele la păsările vaccinate/provocate nu au fost semnificativ diferite de semnele la martorii neprovocate.

Tabelul 1. Valorile medii cantitative cantitative ale pragului ciclului (CT) ale reacției în lanț a polimerazei de transcripție inversă (qRT-PCR) pentru ARN-ul virusului bronșitei infecțioase (IBV) colectat din despicatură coaanală, glanda Harderian, conjunctivă și amigdală cecală la 5 zile după provocarea cu IBV GA98 la 20, 24, 28, 32 și 36 de săptămâni. Literele (a–d) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05).

Tabelul 2. Semnele clinice și leziunile microscopice au fost măsurate la 5 zile după provocarea IBV GA98. Literele (a–b) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0.05).

Examenul histopatologic al traheei din toate grupurile a variat de la limitele normale la traheita limfocitară focală la multifocală minimă până la moderată; cu toate acestea, infiltrarea limfocitară moderată a fost observată mai frecvent la martorii pozitivi. În toate săptămânile, proporția de păsări vaccinate/provocate cu deciliare sau necroză traheală acută a fost redusă semnificativ în comparație cu martorii pozitivi și nu a fost diferită de martorii negativi și vaccinați (Tabelul 2).

Ciliostasis, defined as the cessation of tracheal ciliary movement, was measured at 5 DPC, and the number of birds positive for cryostasis and cryostasis protection scores was calculated for each group (Figure 1). At all collection times, vaccinated/challenged birds were protected from cryostasis (scores were >50), iar controalele pozitive nu au fost protejate (scorurile au fost<50). The non-challenged negative controls and vaccinated controls were protected (scores were >50) la toate orele de colectare.

Figure 1. Ciliostasis protection scores among tracheas were collected 5 days post-challenge with IBV GA98 for different groups of birds challenged at 20, 24, 28, 32, and 36 weeks of age (WOA). Groups with a protection score >50 (linie orizontală) sunt protejate, iar grupurile cu un scor de protecție<50 are not protected. Fractions above each bar represent the proportion of birds positive for cryostasis for the respective group. −/− = non-vaccinated/non-challenged, +/− = vaccinated/non-challenged, +/+ = vaccinated/challenged, −/+ = non-vaccinated/challenged.

Titrurile IgG specifice IBV au fost măsurate în serul colectat la 5 DPC. În orice moment, cu excepția 32 WOA, păsările vaccinate din ambele grupuri neprovocate și provocate au prezentat titruri semnificativ mai mari în comparație cu păsările nevaccinate din ambele grupuri neprovocate și provocate (Figura 2). La 32 WOA, titrurile la păsările vaccinate, indiferent de starea provocării, au fost semnificativ mai mari în comparație cu martorii pozitivi. Titrurile la păsările vaccinate/provocate nu au diferit semnificativ de titrurile la martorii vaccinați până la 36 WOA, când păsările vaccinate/provocate au avut titruri semnificativ mai mari. Comparativ cu martorii negativi, păsările vaccinate/provocate au avut titruri semnificativ mai mari în orice moment.

Titrurile de IgA specifice IBV au fost măsurate în lacrimi colectate la 5 DPC la 28, 32 și 36 WOA. La 28 WOA, titrurile la păsările vaccinate/provocate au fost semnificativ mai mari în comparație cu titrurile la martorii negativi neprovocați (Figura 3). La 32 WOA, păsările vaccinate/provocate au prezentat titruri semnificativ mai mici în comparație cu martorii pozitivi. În plus, păsările vaccinate/provocate au avut titruri semnificativ mai mari decât grupul vaccinat/neprovocat la 28 WOA. Nu au fost detectate alte diferențe semnificative. Viruși 2019.

Figura 2. Titrurile de IgG specifice IBV în ser au fost colectate la 5 zile după provocare cu IBV GA98 pentru diferite grupuri de păsări provocate la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA. Literele (a–c) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05). −/−=nevaccinat/neprovocat, plus /−=vaccinat/neprovocat, plus / plus=vaccinat/provocat, −/ plus=nevaccinat/provocat.

Figura 3. Titrul de IgA specific IBV lacrimal în lacrimi colectat la 5 zile după provocarea cu IBV GA98 pentru diferite grupuri de păsări provocate la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA. Literele (a–c) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05). −/−=nevaccinat/neprovocat, plus /−=vaccinat/neprovocat, plus / plus=vaccinat/provocat, −/ plus=nevaccinat/provocat.

3.2. Virusul bolii de Newcastle (NDV)

La 5 dpc cu NDV B1, păsările vaccinate/provocate fie au avut încărcături de ARN nedetectabile, fie încărcări semnificativ mai mici în comparație cu titrurile de control pozitiv la toate momentele de colectare și în toate țesuturile prelevate (Tabelul 3). Martorii negativi necontestați și controalele vaccinate au fost negative pentru virusul ARN folosind valoarea CT de Mai mare sau egală cu 35.0 așa cum a fost raportat anterior [22].

Tabelul 3. Valorile medii qRT-PCR CT pentru ARN-ul NDV colectat din despicatură coaanală, glanda Harderiană și conjunctivă la 5 zile după provocarea cu vaccinul NDV B1. Literele (a–c) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0.05).

Semnele clinice măsurate la 5 dpc au fost semnificative la 20 WOA la martorii pozitivi, după care semnele clinice la martorii pozitivi nu au fost diferite de niciunul dintre celelalte grupuri de tratament (Tabelul 4). Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește semnele clinice între păsările vaccinate/provocate și martorii neprovocați în niciun moment. În toate săptămânile, examenul histopatologic al traheei a fost în limite normale sau a evidențiat traheită limfocitară de la focală la multifocală minimă până la ușoară și nu au existat diferențe legate de grup.

Traheele au fost, de asemenea, evaluate pentru criostază și niciun grup nu a prezentat criostază.

Titrurile de IgG serice specifice NDV la păsările vaccinate/provocate și martorii vaccinați au fost semnificativ mai mari decât titrurile atât la martorii pozitivi, cât și la cei negativi la toate momentele de colectare (Figura 4). Nu a existat nicio diferență semnificativă în titruri între păsările vaccinate/provocate și martorii vaccinați în orice moment. În mod similar, nu a fost detectată nicio diferență semnificativă în titruri între controalele nevaccinate/provocate și negative, cu excepția la 28 WOA în care titrurile de la controalele nevaccinate/provocate au fost semnificativ mai mari.

Tabelul 4. Semnele clinice au fost măsurate la 5 zile după provocarea NDV B1. Literele (a–b) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0.05).

Figura 4. Titrurile de IgG specifice NDV în ser au fost colectate la 5 zile după provocare cu vaccinul NDV B1 pentru diferite grupuri de păsări provocate la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA. Literele (a–c) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05). −/−=nevaccinat/neprovocat, plus /−=vaccinat/neprovocat, plus / plus=vaccinat/provocat, −/ plus=nevaccinat/provocat.

3.3. Virusul laringotraheitei infecțioase (ILTV)

La 5 dpc cu tulpina ILTV 63140, păsările vaccinate/provocate au avut încărcături de ADN viral semnificativ mai mici decât martorii pozitivi la toate momentele de colectare și în toate țesuturile (Tabelul 5). Încărcările de ADN din trahee și HG au fost nedetectabile sau scăzute și nu au diferit semnificativ de încărcăturile de ADN la controalele negative și vaccinate neprovocate, care au fost negative folosind valoarea CT mai mare sau egală cu 38,0 așa cum a fost raportat anterior [26]. În conjunctivă, încărcările de ADN la păsările vaccinate/provocate au fost semnificativ mai mari decât încărcările de ADN atât de la martorii negativi necontestați, cât și de la martorii vaccinați, cu excepția 28 WOA în care nu a fost detectată nicio diferență semnificativă între păsările vaccinate/provocate și martorii vaccinați.

Tabelul 5. Valorile medii qPCR CT pentru ADN-ul ILTV colectat din trahee, glanda Harderian și conjunctivă la 5 zile după provocarea cu tulpina ILTV patogenă 63140. Literele (a–c) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05).

Semne clinice și ADN viral au fost detectate la păsările provocate la 3 DPC, dar semnele la martorii pozitivi au devenit mai severe cu 5 dpc pe măsură ce încărcătura virală traheală a crescut (Tabelul 6). Scorurile semnelor clinice măsurate la 5 dpc au fost reduse semnificativ la păsările vaccinate/provocate în comparație cu martorii pozitivi, la toate punctele de colectare, cu excepția 36 WOA, când scorurile semnelor clinice au fost reduse numeric. Toate martorii negativi și controalele vaccinate nu au avut semne clinice, iar semnele clinice la păsările vaccinate/provocate nu au fost semnificativ diferite în comparație cu acești martori, cu excepția la 36 WOA când scorurile semnelor clinice au fost semnificativ mai mari.

Tabelul 6. Semnele clinice au fost măsurate la 5 zile după provocarea ILTV 63140. Literele (a–b) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05).

Examenul histologic traheal a fost în limite normale sau a evidențiat traheită limfocitară focală până la difuză minimă până la ușoară în trahee din toate grupurile. Pentru controalele pozitive, 3/9 și 1/10 în săptămânile 20 și, respectiv, 28, au avut traheită acută necrozantă focală cu sinciție și incluziuni intranucleare (Figura 5).

Figura 5. Leziunile microscopice traheale sunt în concordanță cu infecția cu laringotraheită infecțioasă la vârsta de 20 de săptămâni. (A) Numeroase sinciții cu incluziuni intranucleare (săgeată). (B) O altă trahee din același grup a demonstrat sincitia cu incluziuni intranucleare (săgeată).

Nu s-a observat iconostas în traheea păsărilor din niciuna dintre grupuri.

Titrurile de IgG specifice ILTV în serul colectat la 5 zile după provocare au fost semnificativ mai mari la păsările vaccinate din grupurile provocate și neprovocate, comparativ cu martorii pozitivi și negativi (Figura 6).

Figura 6. Titrurile de IgG specifice ILTV în ser au fost colectate la 5 zile după provocare cu tulpina ILTV 63140 pentru diferite grupuri de păsări provocate la 20, 24, 28, 32 și 36 WOA. Literele (a–b) indică diferențe semnificative între grupurile de vaccin și de provocare pentru fiecare săptămână (p < 0,05). −/−=nevaccinat/neprovocat, plus /−=vaccinat/neprovocat, plus / plus=vaccinat/provocat, −/ plus=nevaccinat/provocat.

For more information:1950477648nn@gmail.com