Efectele presiunilor de perfuzie asupra pierderii podocitelor în rinichiul izolat de șoarece perfuzat

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract

Context/Obiective: Podocitele se pierd în majoritatea bolilor glomerulare, ducând la glomeruloscleroză și progresie.boală de rinichi. În general, se presupune că podocitele sunt expuse la fluxul de filtrare și, prin urmare, la forțe de forfecare semnificative care conduc desprinderea lor de membrana bazală glomerulară (GBM). În acest context, ștergerea procesului piciorului a fost propusă ca un potențial răspuns adaptativ pentru a crește aderența podocitelor la GBM. Metode: Am testat aceste ipoteze utilizând clarificare optică și analiză morfometrică 3-dimensională de înaltă rezoluție în murinele perfuzate izolate.rinichi.Am investigat dinamica detașării podocitelor la diferite presiuni de perfuzie (50, 300 și mai mult de 450 mmHg) la șoareci tineri sau bătrâni sănătoși (20 față de 71 de săptămâni) sau șoareci injectați cu un ser anti-GBM pentru a induce piciorul global. ștergerea procesului. Rezultate: Rezultatele arată că podocitele sănătoase la șoarecii tineri sunt strâns atașate de GBM și chiar presiunile supramaximale nu au cauzat detașări semnificative. În comparație cu șoarecii tineri, la șoarecii în vârstă și șoarecii cu nefrită anti-GBM și ștergerea procesului piciorului, pierderea progresivă treptată a podocitelor a avut loc deja înainte de perfuzie. Presiunile mari de perfuzie au dus la o pierdere suplimentară relativ minoră de podocite la șoarecii în vârstă. La șoarecii cu nefrită anti-GBM, a avut loc o pierdere suplimentară semnificativă de podocite în acest moment timpuriu, când presiunile de perfuzie au crescut la 300 mmHg sau mai mult. Concluzie: Această lucrare oferă prima dovadă experimentală că podocitele sunt extraordinar de rezistente la presiuni acute de perfuzie crescute într-un izolat ex vivo.rinichimodel de perfuzie. Numai în boala glomerulară, un număr semnificativ de podocite lezate s-au detașat în urma creșterilor acute ale presiunii de perfuzie.

Cuvinte cheie:hipertensiune glomerulară; Hiperfiltrarea glomerulară; stres mecanic; Progresie; Boala cronică de rinichi

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

Introducere

Hipertensiunea glomerulară și hiperfiltrarea afectează glomerulul ducând la boală glomerulară progresivă. Se crede pe scară largă că presiunea crescută de perfuzie expune smocul la stres mecanic crescut care provoacă aderența podocitelor la membrana bazală glomerulară (GBM), contribuind la detașarea lor [1, 2]. Podocitele sunt celule post-mitotice foarte diferențiate, esențiale pentru o barieră de filtrare glomerulară intactă. Pierderea podocitelor este cel mai probabil rezultatul detașării celulelor viabile din GBM, mai degrabă decât apoptoza sau necroza [3-6], deoarece a fost posibilă cultivarea podocitelor recuperate din urina pacienților [4]. Detașarea podocitelor viabile din GBM poate rezulta din mecanismele de atașare deteriorate sau forțe altemecanice. Atașarea afectată de GBM se poate datora leziunii celulare sau expresiei reduse a moleculelor de adeziune și este asociată în principal cu boli glomerulare inflamatorii. În ceea ce privește forțele mecanice relevante pentru podocit, există doi determinanți cheie, și anume presiunea de filtrare și debitul de filtrat [7-9]. Presiunea de filtrare generează tensiuni circumferențiale pe perete și acționează ca o forță de dilatare asupra GBM. Variațiile presiunii hidrostatice transmurale sunt compensate eficient de capacitatea GBM de a acționa ca o membrană elastică și de a se extinde sau de a se micșora în suprafața [8, 10]. Pe de altă parte, fluxul de filtrat prin GBM exercită forțe tangențiale pe suprafața podocitelor, adică stresul de forfecare. Știm din studiile in vitro că podocitele sunt foarte susceptibile la stresul de forfecare care se detașează de substratul lor atunci când sunt expuse la solicitări de forfecare mai mari de 0,025 Pa [11] și adoptă un fenotip intermediar care le poate ajuta să contracareze forțele derivate din flux [12]. Dacă hipertensiunea glomerulară afectează podocitele printr-o presiune de filtrare crescută și/sau filtrare crescută rămâne încă neclar. În acest studiu, oferim prima analiză a capacității podocitelor de a rezista forțelor mecanice crescute într-un model ex vivo. Pierderea podocitelor a fost cuantificată cu rezoluție înaltă folosind curățarea țesuturilor și analiza morfometrică 3-dimensională la șoareci tineri și sănătoși

Materiale și metode

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale legii germane pentru bunăstarea animalelor și au fost aprobate de Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04.2015.A469). Șoarecii au fost găzduiți într-o unitate specifică fără patogeni, cu acces gratuit la mâncare și apă și un ciclu de 12-oră zi/noapte. Înmulțirea și genotipizarea s-au făcut conform procedurilor standard. Șoarecii Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP pe un fundal genetic FVB/N au fost descriși înainte [13]. Pentru a activa expresia transgenică a Pod-rtTA-eGFP, șoarecii au primit doxiciclină prin apa de băut ad libitum timp de 7 zile (2 g/l, 5% zaharoză, protejat de lumină), urmată de o perioadă de eliminare de 1 săptămână conform rapoartelor anterioare. Nefrita anti-GBM a fost indusă printr-o singură injecție intraperitoneală de 5 mg/g ser nefrotoxic cu greutate corporală, așa cum a fost descris anterior [14].

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Perfuzie renală

Cel izolatrinichimodelul de perfuzie a fost utilizat așa cum este descris în altă parte [15]. Pe scurt, șoarecii au fost narcozați cu o injecție intraperitoneală de xilazină/ketamină (0, 1 ml/10 g greutate corporală ip), iar apoi rinichii au fost perfuzați cu o soluție complexă de Krebs-Henseleit (Tabelul 1) suplimentată cu 5 procent albumină serică bovină (BSA) la 37 de grade pentru a imita mediul fiziologic în timpul experimentului. Vasodilatația maximă arinichivascularizația a fost indusă prin 1. injectarea subcutanată cu verapamil (50 µl) imediat după inducerea anesteziei și 2. adăugarea de papaverină la soluția de perfuzie. După perfuzia inițială timp de 5 minute la 50 mmHg, a fost injectată o lectină marcată fluorescent (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 ul în 986 ul de soluție salină) pentru a marca celulele endoteliale.Rinichiau fost perfuzați timp de încă 5 minute cu soluția modificată Krebs-Henseleit cu 5% BSA. După aceea, stângarinichicare a servit drept control pereche în fiecare experiment a fost îndepărtat după legarea atentă a stângirenalvase, tăiate în felii și direct scufundate în paraformaldehidă (PFA) 3% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Dreaptarinichi was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 mmHg, presiunile de filtrare au fost estimate a fi mult peste 400 mmHg), aplicate manual, volum total de 50 ml soluție de perfuzie. Therinichiau fost perfuzați cu o presiune constantă de 50 mmHg sau 300 mmHg folosind o pompă controlată cu presiune (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Germania). Apoi dreaptarinichia fost îndepărtat, tăiat în felii de 2 mm și scufundat în 3% paraformaldehidă (PFA) în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).

Imagini 3D și analiză computațională imersată în PFArinichifeliile au fost incubate pe un agitator mecanic timp de 5 zile la temperatura camerei. După aceea, probele fixate au fost spălate în 1x PBS și plasate într-un agitator mecanic peste noapte la temperatura camerei.Rinichifeliile au fost apoi plasate în etanol de calitate superioară 100% (Merck; 100983) timp de 1 oră la temperatura camerei cu agitare ușoară (cel puțin o schimbare la etanol proaspăt), urmată de imersarea directă în cinamat de etil (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) și au fost lăsate peste noapte într-un agitator ușor, la temperatura camerei, sub protecție ușoară. Transluciditatea țesuturilor a fost atinsă în mai puțin de 1 oră. Pentru microscoapele verticale, am folosit camere de unică folosință, construite în casă, așa cum s-a descris anterior [16]. Cele mai multe experimente au fost efectuate folosind un 2-microscop fotonic (LaVision BioTec TriMScope, „Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Software-ul de imagistică Fiji a fost folosit pentru a se deplasa prin axa Z a fiecărui stivă de secțiuni optice seriale. și pentru a izola glomeruli individuali prin decupare 3D [16].40 glomeruli perrinichi(20 subcorticale și 20 juxtamedulare) au fost selectate pentru analiză. Astfel, în total 1200 de glomeruli au fost analizați în acest studiu pentru a obține rezultate cu suficientă precizie. Podocitele au fost identificate ca eGFP plus celule. Cuantificarea volumului capilar, a volumului glomerular, precum și a numărului de nuclee (puncte) și a volumului a fost efectuată folosind un software de randare și analiză 3D (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zurich, Elveția). Distanța podocitelor de la polul vascular a fost calculată folosind Bitplane XTension „Loc cel mai apropiat. Distanță”. Cuantificarea automată a podocitelor a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [17]. Analiza imaginii a fost efectuată folosind Imaris (Biplane AG Zurich, Elveția). Fiecare glomerulus a fost definit de arteriola sa aferentă marcată cu lectină. 20 subcorticale și 20 juxtamedulare (definite prin distanța lor față de suprafața corticală).

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Microscopie ușoară și imunofluorescență

Pentru microscopia cu lumină, formalină tamponată cu 4 la sută a fost fixatărinichifragmentele au fost deshidratate, încorporate în parafină și colorate cu acid periodic-Schiff (PAS). Procentul de glomeruli anormali/lezați a fost calculat pe baza identificării a 50 de secțiuni transversale glomerulare reprezentative per șoarece selectat în timpul unei plimbări sistematice prinrenalcortexul. Protocolul nostru standard de imunofluorescență [18] a fost efectuat pe secțiuni de 2 μm încorporate în parafină. Au fost utilizați următorii anticorpi: pui policlonal anti-GFP (ab13970; Abcam), șoarece monoclonal anti-sinaptopodin (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), policlonal iepure anti-șoarece p57 (sc{-8298; Santa Cruz -Cruz Biotechnology), iepure policlonal anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 măgar anti-pui ({703-225-155; Dianova, Hamburg, Germania), Alexa Fluor546 capră anti-șoarece IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), măgar policlonal anti-iepure AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Microscopia electronică

Bucăți mici ale cortexului au fost fixate în soluția Karnovsky și încorporate în Epon (Serva, Heidelberg, Germania). Secțiunile ultrasubțiri au fost examinate cu un microscop electronic cu transmisie ZEISS Leo 906 la 60 kV cu o mărire de 3597-6000x. Probele au fost spălate în fosfat Soerensen 0,1 M (Merck, Darmstadt, Germania), post-fixate în 1% OsO4 (Roth, Karlsruhe, Germania) în tampon zaharoză 17% (Merck, Darmstadt, Germania) și deshidratate prin serie de etanol ascendent ( 30, 50, 70, 90 și 100 la sută) timp de 10 minute fiecare. Ultimul pas a fost repetat de 3 ori. Probele deshidratate au fost incubate în propilen oxid (Serva, Heidelberg, Germania) timp de 30 min, într-un amestec de rășină Epon (Serva, Heidelberg, Germania) și propilenoxid (1:1) timp de 1 oră și în final în Epon pur timp de 1 oră. Polimerizarea epon a fost efectuată la 90 de grade timp de 2 ore. Secțiunile ultrasubțiri (70-100 nm) au fost tăiate cu ultramicrotom (Reichert Ultracut S, Leica cu un cuțit de diamant (Leica) și preluate pe grile Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germania). Contrastul a fost îmbunătățit de colorare cu 0,5% acetat de uranil și 1% citrat de plumb (ambele EMS, Munchen, Germania) Probele au fost vizualizate la o tensiune de accelerație de 60 kV folosind un microscop electronic cu transmisie Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania).

analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism v8. Toate valorile sunt exprimate ca medii ± SD. Pentru o comparație a 2 grupuri, a fost utilizat un test t. Compararea mai multor grupuri a fost efectuată utilizând analiza varianței; corecția post-hoc Tukey a fost utilizată pentru comparații multiple. Toate testele au fost 2-codate și semnificația statistică a fost definită ca P <>

Rezultate

Metoda semi-automată de determinare a numărului de podocite per glomerul Au fost studiate trei loturi, adică șoareci tineri și bătrâni sănătoși și șoareci cu glomerulonefrită anti-GBM (♂:♀ 1:1). Șoarecii tineri și sănătoși aveau 15-21 săptămâni, în timp ce bătrânii (în vârstă) aveau 74 de săptămâni. Stergerea procesului global al piciorului a fost indusă la șoareci de 14-20 săptămâni printr-o singură injecție de ser anti-GBM cu 3 zile înainte de instalarea perfuziei izolate.rinichimodel (Fig. 1A), așa cum a fost descris anterior [19].

Pentru a determina influența presiunii perfuziei intrarenale asupra podocitelor,rinichiau fost supuse la diferite presiuni de perfuzie în izolatrinichimodel de perfuzie. În primul rând, ambelerinichiau fost întotdeauna perfuzați la 50 mmHg timp de 5 minute. Pentru a testa dacă soluția noastră de perfuzie a păstrat integritatea glomerulului în viabilul nefixatrinichi, 2 șoareci au fost perfuzați la o presiune constantă de 100 mmHg timp de 90 min. Perfuzia, debitul urinar (25 µl/min/g greutate corporală), precum și clearance-ul inulinei (22 µl/min) au rămas stabile pe tot parcursul timpului (Figura suplimentară 1 – pentru toate materialele suplimentare veziwww.cellphysiolbiochem.com).La șoarecii experimentali, după perfuzia inițială la 50 mmHg, stângarinichi was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; presiune de filtrare supramaximală de aproximativ 450 – 500 mmHg) au fost aplicate la dreapta rămasărinichitimp de 5 min. (Fig. 1B). În izolat perfuzatrinichi, podocitele au fost identificate folosind etichetarea nucleară cu eGFP-histone la șoarecii noștri transgenici care exprimă eGFP sub promotorul podocinei (eGFP: șoareci Pod-rtTA). Numerele podocitelor au fost cuantificate folosind o combinație a acestei etichete metabolice in vivo și morfometrie 3D (Fig. 1C).

Pierderea podocitelor la șoarecii sănătoși și în vârstă

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg, respectiv, comparativ cu valoarea inițială sugerează că această creștere minoră a pierderii podocitelor cu o presiune mai mare nu este o constatare coincidență. Pe secțiunile PAS, modificări glomerulare ușoare au fost observate la șoarecii în vârstă la momentul inițial (expansiune mezangială și scleroză ocazională, Fig. 2F). A

Pierderea podocitelor după o leziune acută

Ser anti-GBM a fost aplicat la șoareci tineri sănătoși pentru a induce leziuni semnificative și specifice podocitelor. La momentul foarte timpuriu (adică 3 zile) după inducerea glomerulonefritei anti-GBM, s-a observat ștergerea generalizată a procesului piciorului în toți glomerulii prin microscopia electronică cu transmisie (Fig. 3A-D). In perfuzat izolatrinichiobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 mmHg a provocat pierderi de podocite de peste 80% într-o minoritate de glomeruli (Fig. 3E). Acest lucru este în conformitate cu natura focală a modelului de boală anti-GBM. În glomeruli juxtamedulari, pierderea podocitelor a fost mai pronunțată în comparație cu glomerulii subcorticali (56,66 ± 16,9 și, respectiv, 47,35 ± 17,07) (Fig. 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); endoteliul nu a prezentat modificări semnificative. Colorația PAS a identificat dilatarea tubulară. La trei zile după injectarea serului anti-GBM, nu s-au dezvoltat încă leziuni în semilună (Fig. 3G-I). Masculii au prezentat un grad mai mare de pierdere a podocitelor comparativ cu femelele (63,71 ± 2,11 vs 75,81 ± 3,83 podocite per glomerul), ceea ce este în concordanță cu observația că șoarecii mal sunt mai sensibili la antiser anti-GBM și formează mai multe semilune celulare în cursul boala (Fig. 3J). Cu toate acestea, pierderea suplimentară de podocite după presiuni mari de perfuzie a fost similară la bărbați și femele (Fig. 3J).

Fig. 3. Pierderea podocitelor după leziune acută. (AB) Microscopia electronică cu transmisie de la un controlrinichi per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 mmHg). Pentru comparații multiple ANOVA. ****P<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Urmărirea podocitelor pierdute în tubuli

eGFP plus podocite au fost observate în mod regulat în lumenul tubilor proximali, unde păreau să adere la marginea perie a celulelor tubulare proximale (Fig. 4A). Aceste podocite nu au fost spălate în hiperperfuzierinichis, în schimb au aderat destul de strâns de marginea periei pentru a rezista fluxului extraordinar al urinei primare la presiuni de perfuzie foarte mari. Pentru a confirma identitatea lor, podocitele au fost co-colorate cu markeri specifici podocitelor (adică p57, sinaptopodină și WT-1) în plus față de markerul de urmărire a liniei genetice nucleare eGFP (Fig. 4B). Numărul de podocite a fost semnificativ mai mic la acei glomeruli cu podocite aderente în tubul proximal asociat, iar prezența podocitelor în tubuli a corelat invers cu numărul de podocite per glomerul (Fig. 4C).

Pierderea preferenţială a podocitelor în localizarea perihilară

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, nu au fost observate modificări semnificative în distribuția spațială a podocitelor la șoarecii tineri și sănătoși. La șoarecii în vârstă, distanțele podocitelor față de polul vascular au fost în general crescute, cel mai probabil reflectând hipertrofia glomerulară, în timp ce hiperperfuzia a dus la o detașare preferențială a podocitelor aproape de polul vascular (primul quartil redus de la 11,5 la 4,9 la sută la șoarecii în vârstă, Fig. 4E). ). În mod similar, s-a observat o detașare preferențială a podocitelor în apropierea polului vascular în podocitele șterse (anti-GBM, primul quartil redus de la 25 la 5 la sută).

Discuţie

În acest studiu, am examinat efectele acute ale presiunii de filtrare crescute și ale fluxului de filtrare asupra pierderii podocitelor în rinichiul murin perfuzat izolat, folosind metoda cea mai precisă în prezent pentru a determina numărul de podocite. Prima constatare majoră a studiului nostru a fost că podocitele sănătoase nu sunt susceptibile la stresul de forfecare acut in vivo, așa cum a sugerat anterior studiile de cultură celulară [11]. Spre surprinderea noastră, nici măcar presiunile suprafiziologice extreme (mai mult de 450 mmHg) nu au indus o detașare semnificativă a podocitelor. Mai degrabă, microscopia electronică cu transmisie a arătat că toate cele trei straturi ale barierei de filtrare au rămas relativ bine conservate. Șoarecii mai în vârstă au prezentat un număr redus de podocite (așa cum a fost raportat anterior) și acest lucru a fost asociat cu o susceptibilitate crescută foarte limitată la presiuni mari de perfuzie. A doua constatare majoră a fost că leziunea anterioară a podocitelor a făcut podocitele susceptibile la detașare la presiuni de perfuzie ridicate. Șoarecii anti-GBM au arătat ștergerea proceselor globale ale piciorului la trei zile după injectarea antiserului anti-GBM și un număr semnificativ s-a detașat la presiuni mari de perfuzie. La șoarecii în vârstă, emitem ipoteza că fiziologia podocitelor este relativ bine conservată, făcându-i mai puțin susceptibili la detașare. Prin aplicarea unei abordări de numărare semi-automatizată, fiecare glomerul a fost analizat separat (în total 1200 de glomeruli analizați). Am confirmat că glomerulii juxtamedulari au un volum mai mare decât glomerulii subcorticali. În mod interesant, numărul de podocite a fost același, arătând că densitatea podocitelor este redusă în glomeruli juxtamedulari. În plus, glomerulii juxtamedulari au fost, de asemenea, mai vulnerabili la presiuni de filtrare crescute în comparație cu glomerulii subcorticali. Aceste constatări ar putea explica în parte de ce leziunile FSGS pot fi observate cu o frecvență mai mare în glomeruli atât de mari [22, 23].

Fig. 4. Detectarea podocitelor în prox. tubul. (A) Imagine reprezentativă care arată eGFP plus podocite (verzi) în tubuli. (B) Colorarea prin imunofluorescență a podocitelor co-etichetate de histona transgenică eGFP (verde) și markerii podocitelor endogeni p57 (roșu), wt-1 (roșu) și sinaptopodin (violet). (C) Asocierea numărului de podocite per glomerul cu numărul de podocite identificate în tub (n=81 glomeruli de la șoarecii martor, n= 41 glomeruli de la șoarecii în vârstă și n= 81 glomeruli de la șoareci anti GBM). Pentru comparații multiple, a fost utilizat ANOVA. ****P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

O limitare a acestui studiu este perioada scurtă de observație, deoarece nu se pot face concluzii cu privire la adaptarea pe termen lung a podocitelor la presiuni crescute de filtrare. S-a propus ca primul răspuns al podocitelor expuse la forfecare este să sufere modificări structurale protectoare [8, 24]. Aceste modificări includ pierderea fantelor de filtrare (adică FPE) și înlocuirea diafragmelor cu fante prin joncțiuni de ocluzie sau strânse. Joncțiunile de ocluzie au fost descrise anterior în mai multe modele de boală glomerulară [25-28]. Cu toate acestea, în studiul nostru, am observat că podocitele cu FPE au fost mai susceptibile la presiuni mai mari de perfuzie=. Prin urmare, rezultatele noastre au arătat că aceste modificări adaptive nu au fost suficiente pentru a proteja împotriva detașării sau, potențial, chiar opusul, că fac podocitele mai susceptibile la detașare. În continuare, se poate argumenta că izolat perfuzatrinichinu este un sistem fiziologic și că presiunile aplicate au fost mult mai mari decât în ​​condiții in vivo. Din câte știm, niciun alt model nu folosește un viabil intactrinichiexistă care ar permite investigarea directă a efectelor presiunilor crescute de perfuzie. Prin aplicarea vasodilatatoarelor înainte și în timpul perfuziei, dilatarea maximă a vaselor pre-glomerulare este indusă pentru a permite fluxul nerestricționat (hiperfiltrare) și transmiterea maximă a presiunilor de perfuzie crescute în glomerul. În studiul de față au fost studiate efectele acute ale presiunilor de perfuzie mai mari. Efectele pe termen lung ale hiperperfuziei patologice ar putea fi mai dăunătoare, ducând la și mai multe pierderi de podocite. Cu toate acestea, studiul nostru sugerează că această pierdere cronică de podocite nu este determinată de forța totală a fluxului de filtrare în sine, ci mai degrabă de modificările (mal-)adaptative ale podocitelor care le scad aderența la GBM. Pacienții cu boli glomerulare beneficiază de tratament antihipertensiv prin prevenirea modificărilor structurale (mal-)adaptative ale podocitelor.

Concluzie

Această lucrare oferă primele dovezi in vivo că podocitele sănătoase sunt extraordinar de ferm atașate de GBM în rinichii sănătoși de șoarece și pot rezista chiar și la presiuni de perfuzie foarte mari. Îmbătrânirea sau leziunea acută mai pronunțată a podocitelor cu ștergere globală, face podocitele susceptibile la detașare la presiuni de perfuzie crescute.