Efectele glieozidelor de Cistanche asupra învățării cogniției și plasticității sinaptice la șobolanii cu model de privare de somn

ABSTRACT

Obiectiv:Pentru a explora dacă glicozidele cistanche pot îmbunătăți funcția de învățare și cognitivă a șobolanilor model de privare de somn prin reglarea plasticității sinaptice.

Metode: Cincizeci de șobolani Wistar masculi au fost împărțiți aleatoriu într-un grup martor (control), grup de control al platformei (PC), grup model (model),glicozide ale grupului cistanche (GC)și grupul estazolam (Est). Modelul de privare de somn al șobolanilor a fost pregătit printr-o metodă modificată a mediului de apă cu mai multe platforme. Labirintul de apă Morris și testul în câmp deschis au fost folosite pentru a detecta funcția cognitivă spațială și modificările emoționale ale șobolanilor. Colorația Nissl a fost utilizată pentru a observa modificările morfologiei și cantității de celule nervoase dinzona CAl hipocampală a șobolanilor. Western blot și R'T - PCR au fost utilizate pentru a detecta nivelurile de expresie ale sinaptofizinei (SY'N), substanței 95 cu densă membranară postsinaptică (PSD -95) șifactor neurotrofic derivat din creier (BDNF). 

Rezultate;Rezultatele labirintului de apă Morris au arătat că, în comparație cu grupul de control, celînvățare și capacitatea cognitivă a șobolanilorîn grupul Model a fost semnificativ scăzută (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wastratament îmbunătățit cu GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the nivelurile de exprimare a proteinelor și genelor ale BDNF, SYN și PSD -95în grupul Mlodel au fost semnificativ scăzute ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

SUPLIMENTE DE FORMULARE CISTANCHEI PENTRUÎMBUNĂTĂȚIREA ÎNVĂȚĂRII ȘI A FUNCȚIEI COGNITIVE

CUVINTE CHEIEGlicozide de cistanche; Hipocampus; Privarea de somn; Învățare și memorie; Anxietate; Plasticitatea sinaptică

Tulburări de somn (SD)este otulburare funcțională a somnului anormalcauzate de o serie de factori complexi precuminsomnie, stare de visare, șitrezire usoara. În ultimii ani,incidența SDa crescut treptat. Studii înrudite au raportat că SD poate provocaboli cardiovasculare,disfuncție metabolică,boli ale sistemului imunitar, șisistemul nervos centralboli degenerative precum boala Alzheimer [1]. SD poate provoca leziuni oxidative neuronilor hipocampali, poate provoca disfuncții cognitive și poate produce modificări ale dispoziției, cum ar fi anxietatea și depresia [2]. Cistanche deserticola este un material medicinal prețios care poate fi folosit atât ca medicament, cât și ca aliment în China. Are efecte de tonifiere a rinichilor și de completare a qi-ului, umezirea intestinelor, promovând mișcările intestinale și întărirea yang-ului. Principalul extract de Cistanche deserticola, glicozide de Cistanche (GC), are efecte antioxidante, anti-apoptotice, de protecție hepatică și neuroprotectoare [3]. Cercetările noastre anterioare au descoperit că GC-urile pot îmbunătăți funcția de învățare și cognitivă a șoarecilor SAMP8 jucând un rol antioxidant și anti-apoptotic [4].

Studii înrudite au arătat că disfuncția cognitivă cauzată de SD este strâns legată de plasticitatea sinaptică [5]. Cu toate acestea, există puține rapoarte despre mecanismul prin care GC-urile reglează plasticitatea sinaptică și îmbunătățesc tulburările de învățare și memorie și declinul cognitiv la șobolani indus de privarea de somn. Prin urmare, acest studiu își propune să exploreze dacă GC afectează plasticitatea sinaptică prin reglarea expresiei markerilor legați de sinaptică, îmbunătățind astfel funcția de învățare și cognitivă a șobolanilor cu modele de privare de somn și să ofere noi idei de tratament și planuri pentru GC pentru a trata învățarea și cognitive. afectarea cauzată de tulburări de somn.

1 Materiale și metode

1.1 Animale experimentale

Șobolani masculi Wistar cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni, cu o greutate de 280 până la 300 g, au fost achiziționați de la Beijing Sibeifu, cu o licență de producție animală [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Toate animalele au fost ținute în Centrul de experimente cu animale al Colegiului Medical Baotou în următoarele condiții: temperatură (24 ± 1) grade, umiditate 50% până la 55%, 12 ore de lumină și 12 ore de întuneric și fără restricții privind hrana și apă. Acest experiment a fost aprobat de comitetul de etică a școlii [Baoyi Lunshen 2022 Nr. (63)].

1. 2 Reactivi și instrumente principale

Glicozidele totale de Cistanche deserticola au fost achiziționate de la Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (număr de lot: KSM20220609011); Tabletele de estazolam au fost achiziționate de la CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (număr de lot: 044220343); tampon de încărcare a proteinelor (P1015), tampon de liză RIPA (R0010), soluție chemiluminiscentă (PE0010), etc. au fost toate achiziționate de la Beijing Solebao; substanța cu densitate postsinaptică în anticorpul 95 (PSD-95) (AB192757) și anticorpul sinaptofizină (SYN) (ab32127) au fost achiziționate de la Abcam, USA Company; factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF) (48503-2) și -actina (52901) au fost achiziționate de la SAB Company, SUA; anticorpul secundar IgG anti-iepure de capră (SA00001-20) a fost achiziționat de la Proteintech Company, SUA; melatonina de șobolan (MT) și kitul de cercetare științifică ELISA (MM-0657R1) au fost achiziționate de la Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Dispozitiv de tăiat parafină (Leica, Germania); microscop optic (Leica, Germania);

Labirint de apă Morris, cutie de testare în câmp deschis (Shanghai Xinruan); aparat de electroforeză verticală (Beijing Liuyi Company); agitator de decolorare (Beijing Liuyi Company); sistem de analiză a imaginilor cu proteine ​​(Shanghai Tanon Technology); instrument PCR cantitativ cu fluorescență (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Metode experimentale

1.3.1 Gruparea animalelor și administrarea medicamentelor

5 0 șobolani masculi Wistar au fost împărțiți aleatoriu în grup martor (grup de control), grup de control pe platformă (control pe platformă, grup PC), grup model (grup model), glicozide totale din grupul Cistanche deserticola (grup GC). , 50 mg/kg) și grupa estazolină (grupa Est, 0,54 mg/kg), cu 10 șobolani în fiecare grup. Grupului martor și grupului PC au primit soluție salină 0,9% prin gavaj. Toate grupurile au fost gavage la ora 7 dimineața în fiecare zi după ce a început modelarea, iar gavajul a durat 21 de zile.

1.3. 2. Pregătirea modelului animal de privare de somn

Modelul de privare a somnului a fost stabilit utilizând metoda modificată a mediului acvatic multiplatform [6]. Echipamentul experimental a fost un rezervor de apă dreptunghiular din rășină de polietilenă de 130 cm × 50 cm × 45 cm. În rezervorul de apă a fost plasată o platformă mică cu diametrul de 5 cm și înălțimea de 20 cm. Platforma grupului PC avea un diametru de 10 cm și o înălțime de 20 cm. Rezervorul de apă a fost umplut cu apă până la o adâncime de aproximativ 18 cm și temperatura apei a fost menținută la (20 ± 1) grade. Cu o săptămână înainte de începerea experimentului, șobolanii au fost plasați în cutia de privare de somn în fiecare zi timp de 60 de minute pentru a se familiariza cu mediul. După ce modelul a fost stabilit, cu excepția grupului de control, șobolanii fiecărui grup au fost plasați pe platforma mică la timp de la 8:00 până la 20:00 în fiecare zi pentru privarea de somn timp de 21 de zile consecutive.

Toți șobolanii aveau acces liber la hrană și apă și se mișcau liber pe platformă. Ciclul de lumină și întuneric a fost de 12 ore în fiecare zi.

1. 3. 3 Experimentul labirintului cu apă Morris

Labirintul de apă Morris a fost împărțit în 4 zone, umplute cu apă, iar platforma a fost plasată în cadranul 4. Suprafața apei era la aproximativ 2 cm deasupra platformei. Melanina comestibilă de calitate alimentară a fost adăugată în apă, iar temperatura apei a fost menținută la (25 ± 1) grade. (1) Experiment de navigare de poziționare: Centrul fiecărei zone a fost selectat și șobolanii au fost plasați ușor în apă. Li s-a permis să exploreze liber. A fost înregistrat timpul necesar șobolanilor pentru a găsi platforma țintă în 60 de secunde. Șobolanii care nu au găsit platforma au fost ghidați către platformă și au stat timp de 20 de secunde. Antrenamentul a fost continuat timp de 5 zile. (2) Test de explorare spațială: În a 6-a zi, platforma a fost îndepărtată și șobolanii au fost plasați în apă din centrul celui de-al 2-lea cadran pe perete. S-au înregistrat numărul de ori când șobolanii au trecut de platformă în decurs de 120 de secunde și timpul în care au stat în al patrulea cadran.

1. 3. 4 Experiment în câmp deschis

A fost folosită o cutie experimentală de 100 cm × 100 cm × 50 cm, iar partea de jos a cutiei a fost împărțită în 9 grile. Fiecare grup de șobolani a fost plasat în camera experimentală în câmp deschis în prealabil pentru a se adapta la mediul interior timp de 60 de minute. La începutul experimentului, șobolanii de testare au fost plasați pe rând în colțurile fixe ale cutiei experimentale în câmp deschis, iar numărul de timpi de stat, distanța de mișcare și timpul static al șobolanilor în 5 minute au fost înregistrate folosind software-ul de analiză comportamentală. Mediul a fost necesar să fie liniștit în timpul experimentului, iar dispozitivul experimental a fost șters cu apă și respectiv alcool între două experimente pentru a preveni ca mirosul primului șobolan să afecteze judecata comportamentală a următorului șobolan.

1. 3. 5 Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)

Detectarea nivelurilor serice de MT la șobolani Sobolanii au fost anesteziați prin injecție intraperitoneală și s-au colectat 5 ml de sânge din aorta abdominală. După așteptarea timp de 30 de minute la temperatura camerei, sângele a fost centrifugat pentru a obține ser. S-au adăugat 40 μL de diluant de probă în fiecare godeu, apoi s-au adăugat 10 μL de probă de testat. După etanșarea cu un film de etanșare, placa a fost incubată la 37 de grade timp de 30 de minute. S-a spălat de 5 ori, s-au adăugat 50 μL de soluție de etichetare enzimatică, iar placa a fost sigilată cu un film de etanșare și incubată la 37 de grade timp de 30 de minute. S-a spălat de 5 ori, apoi s-au adăugat pe rând soluția de dezvoltare a culorii și soluția de terminare a reacției. Valoarea DO a fiecărui godeu a fost măsurată de un etichetator enzimatic la o lungime de undă de 450 nm.

1. 3. 6 Colorare Nissl

Trei șobolani au fost selectați din fiecare grup și țesutul cerebral a fost îndepărtat prin decapitare și fixat cu o soluție de polioxietilenă 4%. Țesutul a fost deshidratat, scufundat în soluție de ceară, încorporat și tăiat prin metode convenționale. Feliile au fost păstrate cu grosimea de 5 μm, clătite cu PBS, colorate cu albastru de toluidină 0,1% timp de 0,5 ore, diferențiate cu alcool 95%, deshidratate cu alcool 100%, transparentizate cu xilen și etanșat cu gumă neutră. Modificările morfologiei și ale numărului de neuroni din regiunea CA1 a hipocampului de șobolan au fost observate la microscop și au fost colectate imagini.

1. 3. 7 Experiment Western blot

Patru șobolani au fost selectați din fiecare grup și hipocampul a fost izolat prin decapitare. Țesutul hipocampus a fost amestecat cu tampon de liză RIP A într-un mediu de baie de gheață și țesutul a fost centrifugat pentru a obține supernatantul. Concentrația de proteine ​​a fost detectată prin metoda BCA. S-au adăugat 20 ug de proteină cu tampon de încărcare cu proteine ​​pentru electroforeză. După ce s-a finalizat electroforeza proteinelor, membrana a fost transferată la un flux constant de 300 mA, blocată cu lapte praf degresat 5%, anticorpul primar a fost incubat la 4 grade peste noapte, iar anticorpul secundar a fost incubat la temperatura camerei timp de 2 ore. După ce a fost utilizată soluția de dezvoltare a culorii, benzile de proteine ​​au fost analizate statistic folosind un sistem de analiză a imaginii prin chemiluminiscență.

1. 3. 8 Experiment RT-PCR

Trei șobolani au fost selectați din fiecare grup pentru a prepara omogenatul de țesut hipocampal. ARN total din fluidul tisular a fost extras prin metoda Trizol și concentrația a fost măsurată. Un kit de sinteză a ADNc fastking a fost utilizat pentru transcrierea inversă și a fost efectuată o reacție de amplificare cantitativă cu fluorescență utilizând un kit cantitativ de fluorescență pentru a detecta nivelul de expresie relativ al ARNm al proteinei legate de sinaptic. Rezultatele au fost analizate folosind 2-ΔΔCt. Secvențele de primer sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1 Secvențe de primer RT-PCR

1.4 Metode statistice

Rezultatele datelor care s-au conformat cu distribuția normală au fost exprimate ca medie ± abatere standard (x ± s), iar analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul GraphPad Prism 9.5. Analiza unidirecțională a varianței a fost utilizată pentru compararea între mai multe eșantioane, iar P < 0.05 a indicat că diferența a fost semnificativă statistic.