Epigallocatechin-3-gallate promovează maturarea in vitro și dezvoltarea embrionului în urma FIV de ovocite porcine partea 2

Vă rugăm să contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informații

Rezultatele

Efectele EGCG asupra indicelui de expansiune Cumulus

Morfologia ovocitelor mature și a ovocitelor cu prima extrudare a corpului polar este prezentată în figurile suplimentare S1A și, respectiv, S1B. În primul rând, Curtea a examinat indicele de expansiune cumulus în ovocite după ce a fost tratat cu diferite concentrații de EGCG și, după cum se arată în tabelul 1, EGCG la 5 și 10 uM a crescut semnificativ indicele de expansiune cumulus în comparație cu grupul de control (grupul 5uM față de grupul 0uM: 2.989 ±0.068 față de 2.438±0.081;10 μM grup față de grupul 0 uM: 3.079±0.110 față de 2.438±0.081). Cu toate acestea, EGCG la 20 uM nu a avut niciun efect asupra indicelui de expansiune cumulus în comparație cu grupul de control (20 uM group versus 0μM group∶2.879±0.076 față de 2.438±0.081).

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Efectele EGCG asupra ratei IVM a ovocitelor

Efectele EGCG asupra ratei de maturare in vitro a ovocitelor au fost determinate în continuare. După cum se arată în tabelul 2, rata de maturare a ovocitului a fost mai mare în grupele de 5 și 20 μM în comparație cu grupul de control EGCG de 0 μM; deși diferența nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic (tabelul 2). Pe de altă parte, tratamentul EGCG de 10 μM a crescut semnificativ rata de maturare a ovocitului în comparație cu grupul de control EGCG de 0 μM (10 μM grup față de 0 μM grupuri∶58,63±2,79% față de 46,27±3,25%; P<>

Efectele EGCG asupra stresului oxidativ al ovocitelor

Producția de SRO a ovocitelor tratate cu EGCG a fost determinată de testul de producție a SRO. Imaginile reprezentative ale semnalelor fluorescente ROS în ovocite după tratamentul cu concentrații diferite de EGCG au fost prezentate în figura 1A. Cuantificarea colorării imuno-fluorescente a arătat că EGCG la 5μM nu a afectat producția de SRO în ovocite în comparație cu grupul de control 0 μM (figura 1B).EGCG la 10 și 20 μM a redus semnificativ nivelurile de SRO ale ovocitelor în comparație cu grupul de control EGCG de 0μM (Figura 1B).

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

Deoarece EGCG la 10 μM ar putea crește indicele de expansiune cumulus și rata de maturare a ovocitului și, de asemenea, ar putea reduce nivelul ROS în ovocite, EGCG la 10 μM a fost ales pentru studiile ulterioare. După cum se arată în figura 1C, EGCG la 10 uM a crescut semnificativAntioxidantcapacitateaOociteîn comparație cu grupul de control 0 uM (Figura 1C). În plus, nivelul de glutation a fost crescut, în timp ce nivelul de MDA a fost scăzut în ovocitele tratate cu 10 μM EGCG (figura 1D și E). În plus, qRT-PCR a fost efectuat pentru a determina nivelurile de expresie ARNm aleOxidativgene legate de stres, inclusiv catalază (CAT), glutationPeroxidază(GPx), și superoxid dismutaza (SOD). EGCG la 10 μM a crescut semnificativ nivelurile de expresie ARNm ale CAT, GPx și SOD în comparație cu grupul de control 0 uM (Figura 2A-C).

Efectele EGCG asupra nivelurilor de expresie ARNm aleApoptoza-Gene înrudite în ovocite

QRT-PCR a fost efectuat pentru a determina nivelurile de expresie ARNm ale genelor legate de apoptoză, inclusiv

Bax,Bcl-2 și caspase-3. EGCG la 10 uM a scăzut semnificativ nivelurile de expresie ARNm ale Bax și caspase-3 și a crescut nivelul de expresie ARNm al Bcl-2 în comparație cu grupul de control 0 μM (Figura 3A-C).

Efectele EGCG utilizate în timpul IVM și FIV asupra potențialului de dezvoltare a ovocitelor

Imaginile reprezentative pentru embrioni și blastocisturi au fost prezentate în figura suplimentară SIC-S1E.

tratamentul în timpul FIV a crescut semnificativ rata de clivaj și rata de blastocist în comparație cu grupul de control (tabelul 3). Tratamentul EGCG în timpul IVM a crescut semnificativ rata de blastocist, dar nu și rata de clivaj în comparație cu grupul de control (tabelul 3). În plus, tratamentul EGCG atât în timpul IVM, cât și în ivc a crescut semnificativ rata de clivaj și rata de blastocist în comparație cu celelalte trei grupuri (tabelul 3). Aceste rezultate au indicat că EGCG în timpul FIV și FIV ar putea promova potențialul de dezvoltare al ovocitelor.

Efectele EGCG utilizate în timpul IVM și VC asupra potențialului de dezvoltare a ovocitelor

Tratamentul EGCG în timpul IVC a redus semnificativ rata despicată și rata de blastocist a ovocitelor în comparație cu grupul fără tratament EGCG (tabelul 4). Pe de altă parte, tratamentul EGCG în timpul IVM a crescut semnificativ rata de clivaj și rata de blastocist a ovocitelor în comparație cu grupul fără tratament EGCG (tabelul 4). Tratamentul EGCG în timpul IVM și IVC a scăzut semnificativ rata de clivaj și rata de blastocist a ovocitelor în comparație cu grupul fără tratament EGCG și grupul cu tratament EGCG în timpul IVM (tabelul 4). Colectiv, aceste rezultate au indicat că tratamentul EGCG în timpul IVM a crescut potențialul de dezvoltare a ovocitului, în timp ce tratamentul EGCG în timpul IVC a atenuat potențialul de dezvoltare a ovocitului.

Discuție

Tehnica IVM pentru COC a fost dezvoltată și aplicată pentru a produce descendenți la mamifere, inclusiv porci, cu toate acestea, rata de formare a blastocitelor după FIV este încă scăzută folosind ovocite IVM în comparație cu cea a ovocitelor maturate in vivo, cum ar fi porcii. La porci, COC-urile sunt de obicei colectate din foliculi antrali de dimensiuni medii (>3 mm diametru) unde ovocitul are capacitatea de a induce maturarea ovocitului, în timp ce celulele somatice foliculare nu dobândesc capacitatea de a răspunde la stimulii ovulației. În plus, mediile in vitro cresc de obicei producția celulară de SRO, care a fost implicată ca principală cauză a deteriorării celulelor.16 Prin urmare, optimizarea condițiilor de cultură pentru a imita mediile in vivo este esențială pentru creșterea și maturarea normală a ovocitelor. În prezentul studiu, diferite concentrații de EGCG au fost adăugate la mediul de cultură al IVM, FIV și IVC pentru a observa calitatea maturării ovocitelor. EGCG la 10 uM îmbunătățește semnificativ IVM-ul ovocitelor porcine. În acest studiu, suplimentarea EGCG în timpul FIV și IVC produce două efecte diferite. Suplimentarea de 10 uM EGCG în timpul FIV poate promova rata de clivaj de ovocite, care a fost în concordanță cu constatările de la Spinaci et al, care arată că suplimentarea de 10 μM EGCG în timpul FIV, dar nu IVM a crescut semnificativ rata de fertilizare.17 Efectul adăugării de EGCG în timpul FIV ar putea fi datorită acțiunii sale asupra spermei nu pe OOcyte.

În procesul de cultură in vitro, ovocitele și embrionii sunt în mod inevitabil expuși la lumină și concentrații mai mari de oxigen decât in vivo, ceea ce poate duce la creșterea producției de SRO (anion superoxid, peroxid de hidrogen și hidroxil foarte reactiv). Un număr mare de studii au arătat că suplimentarea antioxidanților în mediul IVM poate îmbunătăți capacitatea de dezvoltare a embrionului. S-a constatat că EGCG acționează ca un antioxidant care moderează efectele vătămătoare ale hipertermiei materne asupra ovocitelor închise foliculilor la șoareci." Barberino et al a demonstrat că EGCG a atenuat apoptoza foliculilor preantrali prin calea de semnalizare fosfatidil-3-kinază/protein kinază B după cultura in vitro a țesutului ovarian oier." Huang et al a sugerat că 50 μM EGCG poate îmbunătăți maturarea ovocitului bovin, iar rolul protector al EGCG poate fi corelat cu proprietatea sa antioxidativă.°În combinație cu studiile anterioare, rezultatele noastre au indicat că efectele EGCG asupra IVM ale ovocitelor porcine pot fi legate de efectul antioxidant și anti-apoptoza, care a fost explorat în continuare în prezentul studiu.

Acumularea excesivă de SRO poate duce la stres oxidativ, iar rezultatele noastre au arătat că EGCG poate crește capacitatea totală de oxidare și poate reduce nivelul de ROS și MDA în ovocitele porcine. Acest lucru se poate datora faptului că EGCG poate elimina direct ROS și/sau EGCG poate acționa sinergic cu sistemul antioxidant. Sistemele non-enzimatice se bazează pe molecule pentru a stinge direct ROS, în timp ce sistemele enzimatice sunt compuse din enzime specifice care detoxifică ROS. În acesta din urmă, familia SOD este importantă în reglarea stresului oxidativ. SOD este singura enzimă cunoscută care curăță direct radicalii liberi prin catalizarea dismutării anionului superoxid la peroxidul de hidrogen. Enzima SOD reglează nivelurile de superoxid și peroxid de hidrogen produse de celule și apoi reglează transducția semnalului celular." Catalaza este un antioxidant important și o enzimă marker a peroxizomilor. Acesta reprezintă 40% din totalul enzimelor peroxisome. Este un oligomer antioxidant cu patru subunități identice aranjate în tetraedre și este o enzimă importantă care protejează celulele de deteriorarea oxidativă a SRO.2Glutathionul este o tripeptidă compusă din acid glutamic, cisteină și glicină care conține legături Y-amidă și grupuri sulfhidril. Poate menține funcția normală a sistemului imunitar și are un efect antioxidant. Glutation peroxidaza (GPXs) combină oxidarea GSH cu H, O, detoxifiere.2"Studiile au demonstrat că stresul termic ar putea produce stres oxidativ în ovocitele bubaline, ceea ce declanșează eliminarea SRO de către sistemul de apărare a enzimelor antioxidante.2 Studiile noastre au arătat în mod constant că EGCG a redus nivelul de ROS și conținutul de MDA al ovocitelor, crescând în același timp conținutul de GSH intracelular și capacitatea totală de antioxidant.

Procesul de apoptoza poate afecta calitatea si rata de supravietuire a ovocitelor si influenteaza astfel dezvoltarea embrionara. Proteinele familiei Bcl-2 joacă un rol cheie în reglarea morții celulare prin interacțiunea echilibrată dintre membrii pro-apoptotici și anti-apoptotici ai proteinei.24 Proteina pro-apoptotică Bax este nucleul apoptozei dependente de mitocondrială de mamifere. Caspaza-3 joacă, de asemenea, un rol de neînlocuit în apoptoza celulară. Caspaza-3 este cea mai importantă enzimă terminală de îmbinare în procesul de apoptoza celulară, iar caspaza activată-3 este executorul cheie al apoptozei celulare. Rezultatele noastre arată că EGCG a reglementat nivelul de expresie Bcl-2 mRNA, dar a scăzut nivelurile de expresie Bax și caspase-3 mRNA. Colectiv, aceste rezultate au sugerat că efectele antioxidante și anti-apoptotice ale EGCG în ovocitele porcine sunt în mare parte legate de reglementarea SOD1, CAT și GPX, precum și genele legate de apoptoză.

Pe scurt, rezultatele noastre sugerează că EGCG promovează maturarea in vitro și dezvoltarea embrionilor după FIV de ovocite porcine. Efectele protectoare ale EGCG asupra ovocitelor pot fi asociate cu proprietățile sale antioxidante și anti-apoptoza.

Finanţare

Acest studiu a fost susținut de granturi din partea Natural ScienceFoundation of Guangdong Province (2020Al515010976), a Proiectului echipelor locale inovatoare și de cercetare al Programului Guangdong Pearl River Talents (2019BTO2N630), a Strategiei de inovare în domeniul științei și tehnologiei Proiecte din provincia Guangdong (2018B020203002).

Acest articol este extras din Acest articol a fost publicat în următorul jurnal Dove Press: Design de droguri, Dezvoltare, și Terapie