Activitatea estrogenică a glicozidelor din Cistanche Deserticola ca adjuvant al receptorilor de estrogen in vitro

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

INTRODUCERE

Cistanche deserticola(„Rou Cong Rong” în chineză), o plantă medicinală tradițională chinezească care a fost înregistrată pentru prima dată în ShenNongBenCaoJing, a fost folosită pentru tratamentul deficienței renale, impotenței, constipației senile și deficienței de sânge de mii de ani.[1] Este distribuit în principal în regiunile deșertice din nord-vestul Chinei, cum ar fi Gansu și Xinjiang.[2] Cercetările farmacologice moderne au demonstrat că C. deserticola poate promova funcții medicinale largi, cum ar fi reglarea hormonală, activitatea imunomodulatorie, antioxidantă, neuroprotectoare, antiinflamatoare și estrogenică.[3,4] Glicozidele Cistanchelor (GC) au fost considerate ca fiind unul dintre componente active principale cu diferite efecte biologice.[5,6]

Receptorii de estrogen- (ER-) și ER sunt subtipurile de ER care ar putea regla funcțiile fiziologice.[7] Aceste proteine ​​ar putea regla transcrierea genelor țintă prin legarea la secvențele de reglare ADN asociate din nucleul celulei. Ambele subtipuri sunt exprimate în mod semnificativ în sistemul cardiovascular și nervos central.[8,9] ER există în principal în glanda mamară, uter, ovar, oase, organul reproducător masculin și prostată. RE este prezentă în principal în prostată, ovar și vezică urinară.[10,11] În plus, există câteva roluri fiziologice comune pentru cele două subtipuri, cum ar fi în dezvoltarea și funcționarea ovarelor și în protecția sistemului cardiovascular. [12,13] Cercetările anterioare din grupul nostru au dezvăluit mecanismul asemănător estrogenic al GC prin metoda analizei metabolomice.[14] Într-un studiu continuu, am analizat mecanismul activității estrogenice a GC-urilor pe liniile celulare MCF-7 legate de ER.

MATERIALE ȘI METODE

Instrumente

Incubatorul ECO‑170P‑230 era de la New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., cititorul de microplăci Bio‑Rad 680, iar aparatele de electroforeză erau de la Bio‑Rad Laboratories, Inc., microscopul CX21 era de la Olympus Co., Ltd. , sistemul de imagistică cu gel GIS-2019 a fost de la Tanon Science and Technology Co., Ltd., placa cu fund plat a fost de la Corning Inc., citometria în flux EPICS-XL a fost de la Beckman-Coulter Inc. și StepOnePlus Real-Time polimerază de reacție în lanț (PCR) a fost de la Thermo Fisher Scientific.

Produse chimice și reactivi

GC-urile au fost preparate în laboratorul nostru, așa cum a fost metoda raportată anterior,[14] și puritatea GC-urilor a fost determinată a fi de 52 la sută (acteozidul a fost folosit ca marker pentru a determina GC-urile) prin spectrofotometrie ultravioletă. Estradiolul (E2) a fost achiziționat de la Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Serul fetal bovin (FBS) și RPMI-1640 au fost de la Gibco Co., Ltd., placa cu fund plat cu 96 de godeuri a fost de la Corning Inc. și dimetil sulfoxid (DMSO) și 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil Bromura de ]-2,5-difeniltetrazoliu (MTT) a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich Corporation. Reactivul TRIzol, trusa de transcriere inversă (RT) și kitul TB Green™ RT-PCR au fost achiziționate de la TaKaRa Co., Ltd., Dalian, China. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb și anticorpi -actin au fost achiziționați de la Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Toate celelalte substanțe chimice comune au fost achiziționate de la furnizori comerciali standard.

pregătirea unei mostre

Prepararea glicozidelor soluției stoc de Cistanches

Extractul de GC a fost dizolvat în DMSO pentru a face o soluție stoc cu o concentrație de 0.1051 g/ml și depozitat la 4 grade. RPMI-1640 fără roșu de fenol a fost folosit pentru a dilua soluția stoc la diferite concentrații înainte de utilizare.

Prepararea soluției stoc de estradiol

Extractul de E2 a fost dizolvat în DMSO pentru a face o soluție stoc cu concentrația de 0.27 mg/ml și depozitat la 4 grade. RPMI-1640 fără roșu de fenol a fost folosit pentru a dilua soluția stoc la diferite concentrații înainte de utilizare.

Prepararea serului fetal de bovine tratat cu cărbune cu dextran

Sute de mililitri de FBS au fost amestecați cu 250 mg de pulbere de cărbune activat și 25 mg de dextran. După incubare timp de 45 de minute la 55 de grade, amestecul a fost centrifugat la 4 grade, 1000 rpm timp de 15 minute. Supernatantul a fost filtrat folosind membrana Millipore Express PES pentru a obține cărbunele tratat cu dextran (CDT)-FBS și stocat la -20 de grade.

Cultură de celule

Liniile celulare MCF-7 de cancer de sân uman au fost obținute din colecția de culturi de tip american (ATCC). Mai mult, celulele au fost cultivate cu mediu RPMI-1640 care conține 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină la 37 de grade sub o atmosferă umidificată de 5% CO2. Celulele au fost cultivate în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol, care conține 5% CDT-FBS, cu 4 zile înainte de testul MTT, astfel încât estrogenul din celule să fie curățat.

Analiza proliferării celulare a estradiolului pe liniile celulare MCF-7

Proliferarea celulară a fost măsurată folosind testul MTT pentru celule MCF-7.[15,16] E2 a fost dizolvat în medii de cultură RPMI-1640 care conțineau 0,1% DMSO la concentrații finale de {{27} }}.1, 1, 10, 100 și 1000 nM. Liniile de celule MCF-7 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol timp de 4 zile. După spălarea cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de trei ori, s-au adăugat 100 µL de mediu RPMI-1640 fără FBS în plăci cu 96 de godeuri la 1,5 × 104 per godeu și s-au incubat la 37 de grade timp de 24 de ore. Ulterior, celulele au fost tratate cu diferite concentrații ale soluției de E2 timp de 72 de ore. Apoi, s-au adăugat 100 uL de soluție MTT (0,5 mg/mL) în fiecare godeu. Celulele au fost incubate timp de 4 ore. În cele din urmă, s-au adăugat 150 ui de DMSO pentru a dizolva cristalele de formazan. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm cu un cititor de microplăci și a fost calculată rata de proliferare (PR).

Analiza proliferării celulare a glicozidelor de Cistanches pe liniile celulare MCF-7

Proliferarea celulară a fost măsurată utilizând testul MTT pentru celulele MCF-7. GC-urile au fost dizolvate în medii de cultură RPMI-1640 care conțineau 0,1% DMSO la concentrații finale de 0.{0175, 0,175, 1,75, 17,5 și 175 µg /ml. Liniile de celule MCF-7 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol care conține 5% CDT-FBS timp de 4 zile. După spălarea cu PBS de trei ori, 100 µL de mediu RPMI-1640 fără FBS s-au adăugat în plăci cu 96 de godeuri la 1,5 × 104 per godeu și s-au incubat la 37 de grade timp de 24 de ore. Ulterior, celulele au fost tratate cu diferite concentrații ale soluției de GC timp de 24, 48 și, respectiv, 72 de ore. Apoi, s-au adăugat 100 uL de soluție MTT (0,5 mg/mL) în fiecare godeu. Celulele au fost incubate timp de 4 ore. În cele din urmă, s-au adăugat 150 ui de DMSO pentru a dizolva cristalele de formazan. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm de un cititor de microplăci și a fost calculată PR. RPMI-1640 fără roșu fenol și mediul care conține E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) au fost grupurile negative și, respectiv, pozitive.

Analiza proliferării celulare a glicozidelor de Cistanches cu fulvestrant pe liniile celulare MCF-7

Proliferarea celulară a fost măsurată utilizând testul MTT pentru celulele MCF-7. GC-urile au fost dizolvate în medii de cultură RPMI-1640 care conțineau 0,1% DMSO la concentrații finale de 1,75, 17,5 și 175 ug/ml. Liniile de celule MCF-7 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol care conține 5% CDT-FBS timp de 4 zile. După spălarea cu PBS de trei ori, 100 µL de mediu RPMI-1640 fără FBS s-au adăugat în plăci cu 96 de godeuri la 1,5 × 104 per godeu și s-au incubat la 37 de grade timp de 24 de ore. Ulterior, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de soluție de GC și incubate cu fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) timp de 48 de ore. Apoi, s-au adăugat 100 uL de soluție MTT (0,5 mg/mL) în fiecare godeu. Celulele au fost incubate timp de 4 ore. În cele din urmă, s-au adăugat 150 ui de DMSO pentru a dizolva cristalele de formazan. Absorbanța a fost măsurată la 570 nm de un cititor de microplăci și a fost calculată PR. RPMI-1640 fără roșu fenol și mediul care conține E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) au fost grupurile negative și, respectiv, pozitive.

Analiza ciclului celular

GC-urile au fost dizolvate în medii de cultură RPMI-1640 care conțineau 0,1% DMSO la concentrații finale de 1,75, 17,5 și 175 ug/ml. Liniile celulare MCF-7 au fost cultivate în mediu RPMI-1640 fără roșu fenol care conține 5% CDT-FBS timp de 4 zile. După spălarea cu PBS de trei ori, 1 mL de mediu RPMI-1640 fără FBS a fost adăugat în plăci cu 6 godeuri la 2,5 × 105 per godeu și incubat la 37 de grade timp de 24 de ore. Ulterior, celulele au fost tratate cu diferite concentrații de soluție de GC și incubate cu fulvestrant (6,06 × 10-5 µg/ml) timp de 48 de ore. Ulterior, celulele au fost colectate și spălate cu PBS de trei ori, centrifugate la 4 grade, 1000 rpm timp de 10 minute și fixate cu 70% etanol la -20 grade, peste noapte. După spălare cu PBS de două ori, celulele au fost colorate cu soluție de PI (50 mg/mL) care conține 1 mg/mL de RNază A și 0,1% Triton X-100 timp de 30 de minute la întuneric la 4 grade. Ciclul celular a fost detectat utilizând citometria în flux, iar indicele de proliferare (PI) a fost calculat după cum urmează. RPMI-1640 fără roșu fenol și mediul care conține E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) au fost grupurile negative și, respectiv, pozitive. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 la sută

Izolarea ARN și analiza cantitativă în timp real a reacției în lanț a polimerazei

Pentru a măsura nivelul ARNm, a fost utilizat un test PCR cantitativ RT (qPCR). ARN-ul celular total a fost extras cu reactiv TRIzol. Pentru qPCR, ARN-ul a fost transcris invers la cADN din 4 pg de ARN total folosind un kit RT. Analizele RT-PCR au fost efectuate folosind kitul TB Green™ RT-PCR. Toate protocoalele au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Perechea de primeri utilizată pentru amplificarea ER a fost 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (înainte) și 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (invers); perechea de primeri folosită pentru amplificarea ER a fost 5'-AGTGCCGCTCTTGGGAGAGCTG-3' (înainte) și 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (invers). Condițiile PCR pentru ER și ER au fost de 94 de grade timp de 3 minute, urmate de 37 și, respectiv, 40 de cicluri de 94 de grade pentru 30 de secunde, 58 de grade pentru 2 minute și 72 de grade pentru 2 minute. Perechea de primeri utilizată pentru amplificarea GAPDH a fost 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (înainte) și 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (invers). Condițiile PCR pentru GAPDH au fost de 94 de grade timp de 3 minute, urmate de 30 de cicluri de 94 de grade timp de 30 s, 58 de grade timp de 2 minute și 72 de grade timp de 2 minute. De fiecare dată când experimentul RT-qPCR a fost repetat de mai mult de două ori. Pentru aceasta, GAPDH a fost folosit ca control intern. Expresia relativă a genei a ER/ER a transfectanților în raport cu celulele martor a fost calculată: 2-(∆∆Ct).

Western blot

Expresia proteinelor ER și ER a fost detectată prin analiza Western blot ca metodă raportată cu modificări minore. Pe scurt, celulele MCF-7 au fost crescute în plăci cu 6 godeuri la 2,5 × 105 celule per godeu și tratate cu GC-uri la concentrația finală de 1,75, 17,5 și, respectiv, 175 ug/ml timp de 48 de ore. După incubare, extractele de celule întregi au fost preparate folosind tampon RIPA care conține PMSF 1 mM. Proteinele din extractele de celule întregi au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 12% și apoi transferate pe membranele de difluorură de poliviniliden. Membrana a fost blocată cu lapte degresat 5% (g/v) dizolvat în tampon TBST și incubată cu anticorpi primari și secundari la rândul lor. S-au observat anticorpi legați.

analize statistice

Rezultatele au fost exprimate ca medii și abateri standard, iar semnificația statistică a fost realizată utilizând testul t Student cu software-ul SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTATE

După 24 de ore de tratament cu E2, proliferarea celulelor MCF-7 a fost evident îmbunătățită [Figura 1a]. 10 nM de soluție de E2 ar putea stimula în mod evident creșterea celulelor (123,89 la sută). Cu toate acestea, odată cu creșterea concentrației de E2, capacitatea de proliferare celulară a slăbit. Prin urmare, 10 nM a fost concentrația optimă de E2 în acest experiment.

Grupul GC la concentrații de 1,75, 17,5 și 175 µg/mg ar putea îmbunătăți proliferarea liniilor celulare MCF-7 într-un mod dependent de timp și doză și a prezentat o diferență semnificativă cu grupul negativ [Figura 1b]. În comparație cu un grup negativ, grupul E2 a prezentat o proliferare evidentă (120,06 la sută).

Grupul de medicamente combinate (CMG) (fulvestrant cu E2 sau GC) în mediul CDT-FBS a fost incubat cu celule MCF-4. După 72 de ore de incubație, CMG ar putea duce la înclinația PR în comparație cu grupul individual de medicamente (IMG) (P < 0.01)="" [figura="">

Analiza citometriei în flux a arătat că GC-urile ar putea crește ușor valoarea PI, ceea ce sugerează că GC-urile ar putea avansa celulele de fază G{{0}}/G1 la fazele S și G2/M [Figura 2 și Tabelul 1] și ar putea promova ADN-ul celular sinteză. Rezultatul indică faptul că mecanismul GC-urilor pe MCF-7 a fost similar cu cel al E2. În CMG (fulvestrant cu GC), valoarea PI a celulei PI a scăzut ușor la cea a IMG (P <>

Analiza RT-PCR a indicat că expresiile ARNm ER și ER au fost crescute în comparație cu grupul de control (P <{0}}.01) într-o manieră dependentă de doză după ce au fost tratate cu diferite concentrații de GC timp de 48 de ore [Figura 3a și b].

Rezultatul Western blot indică faptul că, după tratamentul cu diferite concentrații de GC timp de 48 de ore, conținutul de proteine ​​ER și ER din MCF-7 crește odată cu creșterea GC-urilor în funcție de doză [Figura 3c-e]

CONCLUZIE

În această cercetare, efectul GC asupra proliferării și ciclului celular al MCF-7 a fost testat prin metoda MTT și, respectiv, citometrie în flux. GC-urile ar putea crește proliferarea celulelor MCF-7 la concentrații de 1,75, 17,5 și 175 µg/ml după incubare timp de 72 de ore. Cu toate acestea, creșterea tinde să încetinească atunci când CC și fulvestrant au fost utilizate împreună. GC-urile ar putea crește valoarea PI a celulelor MCF-7, ar putea scădea celula fazei G1 și ar putea crește celula fazelor S și G2.

Fulvestrant este un antagonist specific ER, care blochează localizarea nucleară a ER prin afectarea dimerizării receptorului și a transportului nuclear dependent de energie.[17] În această cercetare, o concluzie a confirmat că fulvestrantul poate slăbi proliferarea GC pe celulele MCF-7 și ar putea afecta transformarea ciclului celular. Prin urmare, acest studiu a indicat activitatea estrogenică a GC și, de asemenea, ER este ținta GC. În experimentul RT-PCR și Western blot, expresiile de mRNA și proteine ​​ale ER și ER în celulele MCF-7 au crescut odată cu creșterea concentrației de GC. Prin urmare, GC-urile pot juca un rol în activitatea estrogenică în funcție de mARN-ul și proteinele ER și ER reglate în sus.