Evaluarea expunerii la azot de amoniac în apărările imune prezente pe splină și cap-rinichi de dorata Wuchang (Megalobrama Amblycephala) Ⅱ
Nov 14, 2023
3. Discuție
Modul în care sistemul imunitar al peștilor răspunde la diferite tipuri de poluanți ai mediului a devenit un subiect fierbinte [34–37]. Ca toxic omniprezent, amoniacul poate avea un impact neașteptat asupra sănătății animalelor acvatice, deoarece peștii suferă adesea de stres cronic de amoniac în situații realiste. Studiul nostru de față a clarificat influențele expunerii pe termen lung la amoniac asupra imunității peștilor și a mecanismului acestuia.
În experimentul nostru de față, cortizolul seric a crescut semnificativ odată cu creșterea concentrației expunerii la amoniac, indicând apariția stresului la plătica de Wuchang. Rezultate similare au fost observate la calcan (Scophthalmus ma. imus), la crap comun (Cyprinuscarpio) și la platica juvenilă contonată (Megalobrama). amblycephala) [32,38,39. Expunerea cronică la amoniac a dus, de asemenea, la scăderi semnificative ale lizozimei serice, complementului și C4 în acest studiu. Lizozima, ca indicator al funcției imune înnăscute, este enzima imună primară pentru combaterea infecțiilor (40). Sistemul complement, ca una dintre punțile dintre imunitatea înnăscută și imunitatea dobândită, joacă roluri esențiale în curățarea complexelor imune și uciderea bolilor cauzatoare. bacterii și viruși [41,42). Unele studii anterioare au raportat că stresul acut al amoniacului poate inhiba activitățile lizozimelor (17,43] și poate scădea nivelurile de proteine și ARNm de C3 și C4 la pești (44-46). Astfel, rezultatele noastre prezente au arătat că stresul cronic de amoniac a subminat imunitatea înnăscută a peștilor.În studiul de față, creșteri dependente de concentrație ale concentrațiilor de amoniac au fost găsite atât în splină, cât și în rinichiul capului, dar o diferență semnificativă a fost detectată doar în splină.S-au găsit creșteri similare în splină șiindici cap-rinichi, indicând faptul că stresul cu amoniac a cauzat leziuni severe la două organe imune principale. Descoperirile histologice au arătat în continuare că acumularea de amoniac ar putea fi cauza principală a leziunilor patologice la nivelul splinei șirinichiul capului, care s-au caracterizat prin creșterea centrilor melanom-macrofagi și vacuolizarea citoplasmei. Centrii melano-macrofagi sunt cunoscuți ca agregate de macrofage, iar funcțiile lor principale sunt în stocarea fosfolipidelor și a fierului derivate din celule în urma eritrofagocitozei, depunerea agenților patogeni rezistenți și procesarea antigenelor în răspunsurile imune [47-51]. Mărimea și frecvența crescută a centrilor melano-macrofagii indică adesea faptul că peștii se confruntă cu stres sau daune sau îmbătrânesc [36,48,52]. Cercetările lui Kwon și Chang au raportat că o expunere de 5-zi la amoniac (4.0~10,4 mg/L azot amoniac total) a indus depunere severă de hemosiderin și creșterea melanină-macrofage în splina de dorata neagră [ 53]. Asamblare similară melano-macrofag a fost observată în splina Pelteobagrus vachellii expusă la 1 și 5 mg/L de azot amoniac total [17]. În plus, evaluarea cantitativă a modificărilor histopatologice a arătat că gradul de leziune patologică cauzată de stresul amoniac persistent a fost mai mare în splină decât în rinichiul capului.
EXTRACT ORGANIC DE CISTANCHE CU 25% ECHINACOSIDE SI 9% ACTEOSIDE PENTRU INFECȚIE RENICALE
Leziunile organelor imune la pești sunt întotdeauna asociate cu modificări ale moleculelor imune [35]. Însistemul imunitar înnăscut, celcitokine inflamatorii IL-1și TNF- sunt regulatorii importanți ai inițierii și modulării răspunsului inflamator [54–57]. Nivelurile scăzute de molecule de citokine (TNF-, IL-1) reprezintă o reducere a funcției imunologice celulare, care în cele din urmă are ca rezultat o rată mare de infecție sub factorii de stres externi [58–60]. Studii limitate au documentat că expunerea acută la 40 mg/L de azot amoniac total poate crește nivelurile transcripționale ale citokinelor, cum ar fi IL-1 și TNF- în calcan (Scophthalmus maximus), în timp ce expunerea cronică la amoniac ridicat (50 mg/L). azotul amoniac total) a indus tendința opusă la carasul (Carassius auratus) [14,60]. Rezultatele noastre prezente au arătat că expunerea cronică la amoniac a cauzat scăderi marcate ale nivelurilor de proteine și transcripționale ale IL-1 splenice și TNF- , care au fost susținute în continuare de analiza corelației Spearman între concentrațiile de amoniac și nivelurile de IL{{15} splenice. } și TNF-. Rezultate similare au fost găsite și în rinichiul capului. Datele noastre actuale au indicat că expunerea cronică la amoniac a perturbat apărarea imună înnăscută prin inhibarea transcripției și sintezei proteice a moleculelor inflamatorii IL-1 și TNF- în două organe imunitare, splina și cap-rinichi.
Pe lângă sistemul imunitar înnăscut de apărare, imunitatea adaptivă joacă, de asemenea, un rol crucial în apărarea imunitară a peștilor. IgM este primul anticorp secretat de răspunsul imun adaptativ la o nouă infecție sau la un antigen străin, care sunt exprimate în principal în splina și rinichii capului peștilor [61,62]. Nivelurile mai scăzute de IgM pot fi asociate cu o imunitate adaptativă slabă [63]. În studiul de față, scăderi semnificative ale nivelurilor de proteine și transcripționale ale IgM au fost detectate în splină, dar nu și în rinichiul capului, indicând faptul că expunerea la amoniac are un efect inhibitor asupra producției de IgM splenice. Qin și colab. au raportat că expunerea la 1 mg/L de azot total de amoniac timp de 48 de ore și 96 de ore a scăzut semnificativ nivelurile transcripționale de igm în splina Pelteobagrus vachellii, dar nu și în rinichiul capului [17]. Niveluri scăzute de IgM au fost găsite și în branhiile, splina și creierul Rhynchocypris lagowski expus la 0,99 mg/L amoniac neionizat timp de 96 de ore [18]. Analiza noastră de corelație Spearman a arătat în continuare că concentrația de expunere la amoniac a fost corelată semnificativ negativ cu IgM splenic, dar nu a fost corelată semnificativ cu IgM cap-rinichi. Astfel, studiul nostru a sugerat că stresul cronic de amoniac a diminuat imunitatea adaptivă numai la nivelul splinei. Acest lucru ar putea sugera că splina este mai vulnerabilă la stresul ambiental de amoniac decât rinichiul capului. Un motiv pentru această ipoteză poate fi afectarea discrepantă a structurii splinei și a rinichiului capului indusă de stresul amoniacului în studiul nostru de față.
TLR-urile distribuite pe scară largă în celulele imune sunt senzori primari ai agenților patogeni invadatori. În studiul de față, au fost detectate niveluri transcripționale scăzute ale TLR-urilor în splină și în rinichi de cap de dorada Wuchang, ceea ce implică faptul că amoniacul ar putea provoca efecte negative prin calea de semnalizare a TLR. Într-adevăr, inhibarea TLR-urilor ar putea fi legată de creșterile cortizolului seric induse de expunerea la amoniac. Carrizo şi colab. a demonstrat că tratamentul cu cortizol a scăzut nivelurile de ARNm ale TLR (tlr1/5 m/9/22) în miotuburile Oncorhynchus mykiss [64]. Susarla et al. a constatat că cortizolul ar putea scădea nivelurile transcripționale ale citokinelor (VEGF, CCL5, IFN-, CXCL-10, IL-8 și GCSF) după stimularea fie una sau ambele TLR3 și TLR4 a fibroblastelor corneene umane primare [65]. În plus, inhibarea TLR ar putea implica un bloc al căilor de semnalizare TLR. Calea dependentă de MyD88-este reglementată de toate TLR-urile, iar calea independentă de MyD88-este specifică căilor de semnalizare TLR3 și TLR4 [66]. Semnalizarea TLR duce, de asemenea, la activarea căii PI3 K-AKT, care, la rândul său, activează celulele B pentru a produce anticorpi și a sintetiza molecule proinflamatorii precum IL-1 și TNF- prin calea de semnalizare NF-κB [67–69]. Este de remarcat faptul că nivelurile transcripționale ale traf6 au scăzut atât în splină, cât și în rinichiul capului după expunerea la amoniac, în timp ce nu au fost detectate modificări semnificative în expresia myd88 și pi3k. Astfel, rezultatele noastre au indicat că amoniacul a exercitat interferență cu calea independentă MyD88- -prin inhibarea TRAF6 atât în splină, cât și în rinichiul capului. În plus, activarea TRAF6 poate declanșa activarea semnalizării NF-κB în aval și a semnalizării MAPK (p38, JNK și ERK), care în cele din urmă induce producția de diferite citokine inflamatorii, inclusiv TNF- și interleukina-1 /6/12 (IL-1 /6/12) [70,71]. În plus, TRAF6 este, de asemenea, mediatorul crucial pentru semnalizarea CD40 care reglează secreția IL-6 și Ig [72]. În studiul nostru, reglarea semnificativă în jos a ARNm-urilor splenice erk1 și nf-κb2, precum și a ARNm-urilor erk1, jnk1 și nf-κb1 cap-rinichi a sugerat că expunerea la amoniac a suprimat moleculele de semnalizare NF-κB și MAPK din aval în splină și cap. -rinichi. În plus, expunerea la amoniac a reglat în jos semnalizarea NF-κB prin suprimarea genei nf-κb1 în splină, dar gena nf-κb2 în cap-rinichi, ceea ce reflectă răspunsul inflamator specific țesuturilor dintresplina si cap-rinichi. În ceea ce privește calea de semnalizare MAPK, expunerea la amoniac a inhibat semnificativ expresia erk1 splenic și erk1 și jnk1 cap-rinichi. După efectuarea analizei de corelație Spearman, am constatat că concentrația de expunere la amoniac a fost corelată negativ semnificativ cu nivelurile parametrilor imunitari (IL-1, TNF- și IgM), precum și cu expresia genelor legate de semnalizarea TLR în splină și cap-rinichi. Prin urmare, rezultatele noastre au sugerat că expunerea cronică la amoniac ar putea afecta imunitatea înnăscută și adaptativă prin calea de semnalizare independentă TLRs/MyD88-.
Valorile ridicate ale IBR au reflectat răspunsurile biologice îmbunătățite și starea proastă de sănătate a organismelor [73]. Rezultatele prezente pentru valorile IBR au crescut odată cu creșterile concentrației ambiante de amoniac atât în splină, cât și în rinichiul capului. Acest rezultat a fost în concordanță cu datele privind histopatologie și parametrii sero-imunitari. Mai mult, sub aceeași concentrație de stres amoniac, valoarea IBR a fost mai mare în splină decât în cap-rinichi, ceea ce a dovedit în continuare că influențele stresului amoniac asupra splinei au fost mai severe decât asupra capului-rinichi de dorada Wuchang.
4. Materiale și Metode
4.1. Întreținerea animalelor și protocolul experimental pentru minori
Dorada de Wuchang cu o greutate medie de 9,98 ± 0,48 g de la Tuanfeng Fishery (Hubei, China) au fost mutate în rezervoare din fibră de sticlă de 300 L, unde au fost furnizate cu declorură și aerare continuă. apă. Au fost aclimatizați timp de 14 zile prin hrănirea cu diete comerciale de două ori pe zi (9:{{10}} am și 15:00 pm). După un experiment preliminar, LC50 de 96 de ore și concentrațiile sigure ale azotului amoniac total pentru puieții de plătică s-au dovedit a fi de 46,013 mg/L și, respectiv, 4,601 mg/L. Prin urmare, intervalul de expunere la amoniac a fost stabilit ca 0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L și 30 mg/L azot amoniac total. Peștii au fost distribuiți aleatoriu în 5 grupuri de tratament cu rezervoare în trei exemplare, iar densitatea de aprovizionare a fost de 20 de puieți per rezervor. Concentrațiile experimentale de amoniac au fost obținute dintr-o soluție stoc de 10 g/L făcută cu clorură de amoniac de calitate reactiv (BASFR, 99,5%). Pentru a menține concentrațiile stabile de tratament cu amoniac, soluția de experiment 1/2 a fost reînnoită în fiecare zi cu o concentrație nouă și egală de soluție de azot amoniac. Între timp, grupul de control a suferit o manipulare similară cu apă de robinet aerată. Nivelurile reale de azot amoniac total pentru fiecare tratament au fost măsurate prin nesslerizare în fiecare zi. Pe toată perioada experimentală, datele de monitorizare zilnică de către HQ40 D Water Analyzer (Hach, Loveland, CO, SUA) au arătat că temperatura apei a fost de 25,0 ± 0,60 ◦C, concentrațiile de oxigen dizolvat au fost peste 5,0 mg/L și pH-ul a fost menținut la 7,55 ± 0,04, cu ajustări ușoare utilizând 10% H2SO4 și 10% NaOH. Peștii au fost hrăniți cu o dietă comercială de două ori pe zi, la fel ca și aclimatizarea.
4.2. Colectarea și pregătirea probelor
După o expunere experimentală de 30-zi, peștii au fost ținuți mai întâi timp de 48 de ore și apoi au fost anesteziați în soluție MS-222. Greutatea corporală a fiecărui pui a fost măsurată înainte de disecție, iar sângele a fost colectat imediat din venele caudale pentru a separa serul pentru determinarea ulterioară a parametrilor biochimici. Țesuturile (splină și cap-rinichi) au fost extrase și cântărite. Indicii splina și cap-rinichi au fost calculați folosind formula [greutatea țesutului (g)/greutatea corporală (g) * 100%]. Trei spline și rinichi individuale din fiecare grup au fost utilizate pentru analiza histopatologică, iar celelalte au fost congelate imediat la -80 ◦ C pentru analiza concentrațiilor de amoniac din țesut, parametrii de imunitate și nivelurile transcripționale ale genelor. Această activitate efectuată pe M. amblycephala a fost aprobată de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) al Universității Agricole Huazhong, Wuhan, China (HZAUFI-2019-018).
4.3. Detectarea amoniacului în splină și cap-rinichi
Pentru analiza nivelurilor de amoniac, pretratarea probelor de țesut și detectarea amoniacului a fost efectuată conform studiilor anterioare [74,75]. Pașii de testare detaliați pot fi găsiți în Informații justificative (Textul suplimentar S1).
4.4. Analiza parametrilor imunitari serici
Probele de sânge au fost centrifugate (845 g, 20 min, 4 °C) pentru prepararea probelor de ser. Fiecare grup experimental a avut șase replici și o replica a inclus serul de la 10 indivizi din același rezervor. Cortizolul seric a fost determinat prin radioimunotest (RIA) folosind kitul Beijing North Institute of Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China) (www.bnibt.com, accesat la 15 martie 2020) conform unui studiu anterior [76]. Conținutul complementului C3 și al complementului C4 și activitatea lizozimei au fost măsurate folosind kituri comerciale produse de Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) (www.njjcbio.com, accesat la 15 martie 2020).
4.5. Analiza parametrilor imunitari tisulare
Probele de țesut de la cinci pești din același grup au fost reunite ca un duplicat și omogenizate cu clorură de sodiu 0,85%, apoi centrifugate la 845 × g timp de 15 minute (4 ◦ C) pentru colectarea supernatantului. Fiecare grup experimental a avut șase replici. După cum s-a descris în studiile anterioare [77,78], supernatantul a fost utilizat pentru a testa concentrațiile de IgM, IL-1, TNF- și proteine totale folosind truse comerciale. Toate kiturile au fost achiziționate de la Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) (www.njjcbio.com, accesat pe 15 martie 2020).
4.6. Analiza expresiei genelor
Nivelurile Mrna ale genelor asociate imunității în splină și cap-rinichi au fost testate conform metodei într-un studiu anterior [79]. Informații detaliate despre procedura de testare sunt furnizate în Informații justificative (Textul suplimentar S2). Secvențele de primer sunt enumerate în Tabelul 3. Analiza curbei de topire a fost efectuată pentru fiecare primer la sfârșitul reacției pentru a demonstra specificitatea reacției. După verificarea faptului că eficiența de amplificare a tuturor genelor selectate variază între 90-110%, nivelurile relative de Mrna au fost calculate prin metoda 2−∆∆Ct cu -actina ca control intern [80].
4.7. Evaluare histopatologică
Probele de splină și cap-rinichi au fost fixate în formol tamponat neutru 10%, apoi deshidratate în etanol și încorporate în parafină. În cele din urmă, feliile de țesut au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). O analiză cantitativă ulterioară a modificărilor patologice a fost efectuată conform studiilor anterioare [82,83]. Protocolul de analiză detaliat este furnizat în Informații de sprijin (Textul suplimentar S3).
4.8. Analiza integrată a răspunsului biomarkerului
Analiza IBR este o metodă de integrare a tuturor răspunsurilor măsurate a biomarkerilor într-un index integrativ pentru a evalua nivelurile de stres [84–86]. În studiul actual, acesta a fost aplicat pentru a evalua efectele toxice ale diferitelor concentrații de amoniac asupra splinei și rinichiului capului de dorada Wuchang după o expunere de 30-zi. Informații detaliate despre procedura de calcul sunt furnizate în Informații justificative (Textul suplimentar S4).
4.9. Analize statistice
Toate valorile au fost supuse unei analize unidirecționale a varianței, urmată de testul post-hoc al lui Dunnett pentru a evalua diferențele dintre medii (SPSS 22.0, Chicago, IL, SUA). Analiza de corelație Spear Man a fost aleasă pentru a determina relația dintre concentrațiile totale de amoniac, parametrii imuni și nivelurile de expresie a genelor. Normalitatea și omogenitatea varianței au fost verificate anterior. Diferențele au fost măsurate și considerate a fi semnificative la valoarea p < 0.05.
5. Concluzii
Studiul nostru oferă dovezi că stresul cronic de amoniac a crescut COR seric, a redus lizozima seric și C3/C4 și a scăzut proteinele și nivelurile transcripționale ale IL-1, TNF- și IgM, precum și nivelurile de expresie ale genelor implicate cu TLR. /MyD88- cale de semnalizare independentă în splină și cap-rinichi ai M.amblycephala. În plus, indicii șileziuni patologicela cele două organe imunitare crescută odată cu acumularea tisulară de amoniac. Aceste constatări au indicat că acumularea de amoniac în splină și cap-rinichi a cauzat leziuni histopatologice și a indus supresia imună prin inhibarea semnalizării independente TLR/MyD88-. În plus, influențele adverse ale stresului cronic de amoniac asupra splinei s-au dovedit a fi mai severe decât cele asupra rinichiului capului de dorada Wuchang.
Finanțare: această activitate a fost susținută în comun de Programul național de cercetare și dezvoltare cheie din China (2019 YFD0900303), Sistemul de cercetare agricolă din China al MOF și MARA (CAS-45-24) și Fundația Națională de Științe Naturale din China (nr. 32071621) .
Declarația Comitetului de evaluare instituțională: Am aderat la toate reglementările și convențiile locale, naționale și internaționale și am respectat practicile etice științifice normale. Exemplarele utilizate în acest studiu provin dintr-o populație în principal de indivizi pescuiți comercial, destinate consumului uman. Protocolul pentru animale a fost aprobat de Comitetul de etică instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Agricolă Huazhong (Wuhan, China) (HZAUFI-2019-018).
Declarație de consimțământ informat: a fost obținut consimțământul informat de la toți subiecții implicați în studiu.
Declarație de disponibilitate a datelor: Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/Materiale suplimentare.
Conflicte de interese: Autorii declară conflictul de interese.
Referințe
1. Randall, DJ; Tsui, T. Toxicitatea amoniacului la pești. Mar. Pollut. Taur. 2002, 45, 17–23. [CrossRef]
2. David, AA; Debbie, C.; Allen, WK; John, EC Interacțiunea amoniacului ionizat și neionizat asupra supraviețuirii și creșterii pe termen scurt a larvelor de creveți, Macrobrachium rosenbergii. Biol. Taur. 1978, 154, 15–31. [CrossRef]
3. Thurston, RV; Russo, RC; Vinogradov, GA Toxicitatea amoniacului pentru pești. Efectul pH-ului asupra toxicității speciilor de amoniac unionizat. Mediul. Sci. Tehnol. 1981, 15, 837–840. [CrossRef]
4. Armstrong, BM; Lazorchak, JM; Murphy, CA; Haring, HJ; Jensen, KM; Smith, ME Determinarea efectelor amoniacului asupra reproducerii piscicolului (Pimephales promelas). Sci. Mediu total. 2012, 420, 127–133. [CrossRef] [PubMed]
5. Eddy, FB Amoniac în estuare și efecte asupra peștilor. J. Fish Biol. 2005, 67, 1495–1513. [CrossRef]
6. Miron, DS; Moraes, B.; Becker, AG; Crestani, M.; Spanevello, R.; Loro, VL; Baldisserotto, B. Efectele amoniacului și pH-ului asupra unor parametri metabolici și a histologiei branhiilor somnului de argint, Rhamdia quelen (Heptapteridae). Acvacultura 2008, 277, 192–196. [CrossRef]
7. Yu, C.; Huang, X.; Chen, H.; Godfray, ÎCJ; Wright, JS; Hall, JW; Gong, P.; Ni, S.; Qiao, S.; Huang, G.; et al. Gestionarea azotului pentru a restabili calitatea apei în China. Nature 2019, 567, 516. [CrossRef] 8. Organizația Mondială a Sănătății (OMS). O prezentare globală a reglementărilor și standardelor naționale pentru calitatea apei potabile, ed. a 2-a; Organizația Mondială a Sănătății: Geneva, Elveția, 2021; 66p.
9. Passell, HD; Dahm, CN; Bedrick, EJ Modelarea amoniacului pentru evaluarea toxicității potențiale pentru speciile de pești din RIO grande, 1989–2002. Ecol. Aplic. 2007, 17, 2087–2099. [CrossRef]
10. Ventilator, B.; Li, J.; Wang, X.; Chen, J.; Gao, X.; Li, W.; Ai, S.; Gui, L.; Gao, S.; Liu, Z. Distribuția spațio-temporală a amoniacului și evaluarea riscului pentru speciile de apă dulce din ecosistemul acvatic din China. Ecotox. Mediul. Saf. 2021, 207, 111541. [CrossRef]
11. Yue, F.; Pan, LQ; Xie, P.; Zheng, D.; Li, J. Răspunsurile imune și expresia genelor legate de imun la crabul de înot Portunus trituberculatus expus la stres ambiental crescut de amoniac-N. Comp. Biochim. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2010, 157, 246–251. [CrossRef]
12. Qin, CJ; Shao, T.; Zhao, DX; Duan, HG; Wen, ZY; Yuan, D.; Li, HT; Qi, ZM Efectul amoniacului-N și provocării patogenului asupra expresiei componentelor 8 și 8 a complementului la somnul Darkbarbel Pelteobagrus vachellii. Pește Crustacee Imunol. 2017, 62, 107–115. [CrossRef] [PubMed]
13. Cheng, CH; Yang, FF; Ling, RZ; Liao, SA; Miao, YT; Da, CX; Wang, AL Efectele expunerii la amoniac asupra apoptozei, stresului oxidativ și răspunsului imunitar la peștele puffer (Takifugu obscurus). Aquat. Toxicol. 2015, 164, 61–71. [CrossRef]
14. Liu, BL; Jia, R.; Huang, B.; Lei, JL Efectul interactiv al amoniacului și stresului de aglomerare asupra reglării ionilor și expresiei genelor legate de imunitate la puietul de calcan (Scophthalmus maximus). Mar. Freshw. Comportament. Physiol. 2017, 50, 179–194. [CrossRef]
15. Li, M.; Zhang, M.; Qian, Y.; Shi, G.; Wang, R. Toxicitatea amoniacului la somnul galben (Pelteobagrus fulvidraco): Perspectiva mecanică de la detoxifiere fiziologică la otrăvire. Pește Crustacee Imunol. 2020, 102, 195–202. [CrossRef] [PubMed]
Serviciul de asistență al Wecistanche-Cel mai mare exportator de cistanche din China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Cumpărați pentru mai multe detalii despre specificații:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
