Extracția glicozidelor feniletanoide din Cistanche Tubulosa prin extracție cu omogenizare prin forfecare de mare viteză

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei și Ruili Guo

Fundal:

Cistanche tubulosaeste o renumită medicină tradițională chineză, originară din Xinjiang. Este larg răspândit în nordul Africii, India etc. Obiectiv: Componenta bioactivă majoră aC. tubulosaeste glicozide feniletanoide (PhG). Echinacozidul și acteozidul sunt componentele indicative pentru determinarea PhG și sunt utilizate în principal pentru protecția ficatului, protecția imună etc. Prin urmare, este foarte importantă extragerea PhG din C. tubulosa. Metode: În acest studiu, au fost comparate metodele de extracție asistată cu ultrasunete (UAE), extracție asistată de microunde (MAE) și extracție cu omogenizare prin forfecare de mare viteză (HSHE). În plus, condițiile de extracție ale metodei HSHE au fost optimizate. Rezultate: rezultatele au arătat că metoda HSHE a fost mai bună decât metodele EAU și MAE, iar parametrii optimi de extracție ai HSHE au fost o concentrație de etanol de 50 procente, o temperatură de extracție de 70 de grade, o viteză de rotație de 16000 rpm, un timp de extracție de 2 min, un raport solid-lichid de 1:9 și un ciclu de extracție. Randamentele de echinacozidă și acteozidă au fost de 1,366 și, respectiv, 0,519 la sută, iar ratele de transfer ale echinacozidei și acteozidei au ajuns la 87 și, respectiv, 94 la sută. Concluzii: Se poate concluziona că metoda HSHE este o tehnică simplă, rapidă și eficientă pentru extragerea PhG din C. tubulosa. Repere: O metodă HSHE eficientă și ecologică a fost investigată pentru extracția PhG din C. tubulosa. Au fost obținute condițiile optime ale metodei HSHE pentru extracția PhG din C. tubulosa. Această cercetare oferă o nouă metodă de extracție industrială a PhG dinC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaeste o medicină tradițională chineză comună care își are originea în Xinjiang. Este distribuit pe scară largă în nordul Africii, Peninsula Arabică, Pakistan și India și a fost înregistrat oficial în Farmacopeea Chineză în 2010. Principala componentă bioactivă aC. tubulosaeste glicozide feniletanoide (PhGs), o clasă de produse naturale solubile în apă, inclusiv echinacozide, acteozide, izoacteozide și 2-acetilacteozide (1, 2). Structura PhGs constă din acid cinamic și fragmente hidroxifeniletil, ambele fiind atașate la o -glucopiranoză prin legături esterice și, respectiv, glicozidice (3). Studiile farmacologice au arătat că PhG ale C. tubulosa au multe funcții medicinale, cum ar fi efecte antioboselii (4), neuroprotectoare (5-7), protectoare hepatice (8-10) și imunoprotectoare (11). Prin urmare, extracția eficientă a PhG din C. tubulosa este de mare importanță pentru dezvoltarea și utilizarea produselor naturale.

Metodele tradiționale actuale de extracție a PhG sunt extracția la reflux cald, extracția asistată cu ultrasunete (UAE) și extracția asistată cu microunde (MAE; 12-16). Aceste metode au diferite dezavantaje, cum ar fi eficiență scăzută, timpi lungi de extracție și costuri ridicate. În comparație cu metodele tradiționale, metoda de extracție cu omogenizare prin forfecare de mare viteză (HSHE) este o metodă de extracție nouă, emergentă și are avantajele unor timpi de extracție mai rapizi, mai puține deșeuri de solvenți, randamente mai mari, dispozitiv mai simplu și operare mai ușoară (17). Principiul de lucru al metodei HSHE se bazează pe o freză interioară rotativă acționată de un motor de mare viteză. O forță puternică de forfecare este produsă de frezele interioare și exterioare pentru a perturba și amesteca probele. Între timp, freza cu rotație de mare viteză provoacă diferențe de presiune între cavitățile interioare și exterioare ale tăietorului, rezultând un transfer de masă între probe și solvenți. Cu combinația dintre forța de forfecare mare, forța de coliziune, presiunea și alte forțe, se poate obține rapid un echilibru solubil între probele solide și solvenți (18). Astfel, procesul de extracție a HSHE poate fi finalizat în câteva minute și chiar la fel de repede ca zeci de secunde (19-22).

Recent, HSHE a fost explorată în extracția componentelor bioactive din diferite produse naturale (23–25). Cheng şi colab. a folosit HSHE pentru a extrage cinci lignani din fructul de Schisandra Chinensis (26). Rezultatele au arătat că condițiile optime au fost o concentrație de etanol de 75 la sută, un timp de extracție de 1 min, un raport solid-lichid de 1:19, o tensiune de extracție de 180 V și o particule de probă. dimensiunea de 120 ochiuri. Randamentul total al celor cinci lignani a fost de 13,89 ± 0,014 mg/g în condiţiile optimizate. Tang şi colab. a folosit HSHE pentru a obține ulei bioactiv din semințe de perilla (27). Condițiile optime au fost un timp de extracție de 2 minute, un raport solid-lichid de 1:10, o tensiune de extracție de 150 V și două cicluri de extracție. Randamentul uleiului de semințe de perilla a ajuns la 59,3 la sută. Rezultatele de mai sus indică faptul că HSHE are avantajele unor timpi scurti de extracție, costuri scăzute și randamente ridicate. Cu toate acestea, există o lipsă de cercetare privind extracția PhG de către HSHE.

În studiul de față, HSHE a fost utilizat pentru a explora aplicația sa potențială în extracția PhG dinC. tubulosa. Randamentul PhGs a fost determinat prin HPLC. Cele trei metode de extracție, HSHE, UAE și MAE, au fost comparate în aceleași condiții. Au fost investigate efectele concentrației de etanol, temperatura de extracție, viteza de rotație, timpul de extracție, raportul solid-lichid și numărul de cicluri de extracție ale randamentului. Sunt comparate și discutate avantajele și dezavantajele acestei lucrări și referințele.

Materiale și metode

Material și reactivi chimici

C. tubulosaa fost achiziționat de la Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, China). Standardele de echinacozidă (purități mai mari sau egale cu 98 la sută) și acteozide (purități mai mari sau egale cu 98 la sută) au fost achiziționate de la Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, China). Acetonitrilul, metanolul și acidul acetic au fost de calitate HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanolul de calitate analitică a fost achiziționat de la Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China). Pe parcursul experimentelor a fost folosită apă deionizată.

Analiza HPLC

O analiză HPLC a fost efectuată pe o cromatografie lichidă Waters e2695 (Waters, Milford, MA) echipată cu un detector UV/vizibil 2489 și o coloană Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, dimensiunea particulei de 5 μm. Concentrațiile de echinacozidă și acteozidă au fost analizate prin metoda HPLC. Faza mobilă a constat din (1) acetonitril și (2) o soluție apoasă de acid acetic glacial 2%. Programul de eluare cu gradient este prezentat în Tabelul 1.

Lungimea de undă detectată a fost de 330 nm, debitul a fost de 1 ml/min, volumul de injecție a fost de 10 μL și temperatura cuptorului a fost setată la 30 de grade. Vârful cromatografic al analitului a fost confirmat prin compararea timpului său de retenție cu cel al standardelor. Cuantificarea a fost realizată prin integrarea vârfului folosind o metodă standard externă.

Testul de precizie a fost efectuat prin injectarea acelorași probe de extracție de cinci ori. Pentru testul de stabilitate, aceleași probe au fost analizate în trepte de 0, 1, 2, 4, 12, 24 și 48 de ore. Testele de recuperare a echinacozidei și acteozidei au fost efectuate prin adăugarea standardelor în probele de extracție. Au fost înregistrate toate zonele de vârf și timpii de retenție ai echinacozidei și acteozidei. Rezultatele curbelor de calibrare pentru echinacozidă și acteozidă sunt enumerate în tabelul 2.

Calculul randamentului

Echinacozidul și acteozidul au fost utilizate ca componente indicative pentru determinarea PhG. Randamentul de echinacozid sau acteozid a fost calculat folosind următoarea ecuație:

Y=CV/W×100 la sută (1)

unde Y=randament de echinacozidă sau acteozidă (procent); C=concentrații de echinacozidă sau acteozidă (mg/mL); V=volumul soluției de extracție (mL); și W=greutatea pulberii de C. tubulosa (mg).

Metode de extracție a PhGs

Tulpinile de C. tubulosa au fost mai întâi măcinate cu o râșniță electrică (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) și filtrate printr-o sită cu filtru (aproximativ 380 μm). Apoi, pulberea de C. tubulosa a fost uscată în cuptor la 70 de grade până când greutatea a fost constantă. Cinci grame de pulbere de C. tubulosa au fost amestecate cu solventul de extracție și plasate într-o sticlă de extracție. După aceea, amestecul lichid a fost preîncălzit (30-80 grade) timp de 5 minute într-o baie de apă la temperatură constantă (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China).

(a) Metoda HSHE.—HSHE a fost realizată de un sistem FA25 (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, China), care a constat din tăietor rotativ, motor de mare viteză și controler. Viteza de rotație a frezei interioare a fost reglată în intervalul 10000-28000 rpm, iar timpii de extracție au fost ajustați în intervalul 2-15 min.

(b) Metoda UAE. — Cinci grame de probă uscată și 300 ml de metanol au fost cântărite cu precizie și adăugate într-o sticlă de extracție. Sticla de extracție a fost scufundată într-o baie cu ultrasunete și efectuată la o putere ultrasonică de 300 W timp de 10 minute. Temperatura de extracție a fost setată la 30 de grade.

(c) Metoda MAE. — Cinci grame de probă uscată și 300 ml de metanol au fost cântărite cu precizie și adăugate într-o sticlă de extracție. Sticla de extracție a fost introdusă în reactorul cu microunde și efectuată la 180 W timp de 10 min. Temperatura de extracție a fost setată la 30 de grade.

Metoda HSHE a fost comparată cu metodele EAU și MAE cu același solvent de extracție, timp de extracție, temperatură de extracție, raport solid-lichid și număr ciclului de extracție. Soluția de extracție a fost filtrată de o membrană 0.22 μm și analizată prin HPLC pentru a determina concentrațiile de echinacozidă și actozidă. Toate procesele de extracție au fost repetate de trei ori

Determinarea ratelor de transfer

Pe baza metodei standard din Farmacopeea Chinei 2015, s-au determinat conținutul de echinacozidă și actozidă din pulberea de C. tubulosa (28). Un gram de pulbere de C. tubulosa și 50 ml 50% metanol au fost cântăriți cu precizie și adăugate într-un balon cotat maro de 50 ml. Amestecul lichid a fost cântărit și înmuiat timp de 30 de minute. Apoi, balonul cotat maro a fost scufundat într-o baie cu ultrasunete și efectuat la o putere ultrasonică de 250 W și o frecvență de 35 kHz timp de 40 de minute. Amestecul lichid a fost cântărit din nou și s-a adăugat 50% metanol pentru a furniza pierderi de solvent. Soluția de extracție a fost filtrată cu o membrană de 0,22 μm și a fost analizată folosind HPLC pentru a determina concentrațiile de echinacozidă și actozidă. Procesele de extracție au fost repetate de trei ori.

Ratele de transfer ale echinacozidei sau acteozidei au fost calculate folosind următoarea ecuație:

X= M1/M2 ×100 procente (2)

unde X=rata de transfer de echinacozidă sau acteozidă (procent); M1=calitatea echinacozidei sau actozidei din extract (mg); și M2=calitatea echinacozidei sau actozidei în pulbere de C. tubulosa (mg).

Rezultate si discutii

Validarea metodei HPLC

Profilurile HPLC ale echinacozidei și acteozidei din C. tubulosa folosind HSHE sunt prezentate în Figura 1. RSD-ul zonelor de vârf ale echinacozidei și acteozidei au fost de 1,89 și, respectiv, 1,40 procente. Rezultatele au arătat că metoda HPLC are o precizie bună în analiza cantitativă a echinacozidei și actozidei. La diferite momente (0–48 h), RSD-urile zonelor de vârf ale echinacozidei și acteozidei au fost de 1,71 și, respectiv, 1,70 procente, indicând faptul că proba a fost stabilă în 48 de ore. Recuperarea echinacozidei și actozidei a fost de 99,3 și, respectiv, 99,1 la sută, iar RSD-ul lor a fost de 0,70 și, respectiv, 0,67 la sută, ceea ce a confirmat fiabilitatea metodei HPLC.

Comparația diferitelor metode de extracție

S-a efectuat o comparație a metodei HSHE cu metodele MAE și Emiratele Arabe Unite în ceea ce privește randamentele de echinacozidă și acteozidă, ale cărei rezultate sunt prezentate în Figura 2. S-a observat că producțiile de echinacozidă și acteozidă obținute prin HSHE au fost mai mari decât cele obținute. atât de către MAE, cât și de EAU. În comparație cu MAE, randamentele de echinacozidă și acteozidă obținute de HSHE au fost mai mari cu 20,5 și, respectiv, 20,8%. Și, în comparație cu Emiratele Arabe Unite, producțiile de echinacozidă și acteozidă obținute de HSHE au fost mai mari cu 6,6 și, respectiv, 7,4%. Aceste rezultate indică faptul că HSHE poate crește semnificativ randamentele PhG.

Optimizarea Metodei HSHE

Parametrii de extracție ai PhG prin HSHE includ concentrația de etanol, temperatura de extracție, viteza de rotație, timpul de extracție, raportul solid-lichid și numărul de cicluri de extracție (26, 29).

Efectul concentrației de etanol asupra extracției PhG

Concentrația de etanol este un factor important care afectează randamentele de PhG. După cum se arată în Figura 3, au fost investigate randamentele de echinacozidă și acteozidă din C. tubulosa în diferite concentrații de etanol. Acesta a arătat că randamentul de echinacozid a crescut de la 0 la 30 procente și apoi a scăzut de la 30 la 90 la sută odată cu creșterea concentrațiilor de etanol. Randamentul de actozidă a crescut de la 0 la 70 la sută și apoi a scăzut de la 70 la 90 la sută odată cu creșterea concentrațiilor de etanol. Când concentrația de etanol a fost de 50 la sută, suma randamentelor de echinacozidă și actozidă a fost la maxim. Diferitele concentrații de etanol au polarități diferite, ceea ce duce la solubilități diferite ale echinacozidei și actozidei. Astfel, concentrația optimă de etanol a fost de 50%.

Efectul vitezei de rotație asupra extracției PhG

Figura 5 prezintă efectele diferitelor viteze de rotație asupra randamentelor de PhG. Randamentele de echinacozidă și acteozidă au crescut odată cu creșterea vitezei de rotație. Creșterea vitezei de rotație poate crește forța de forfecare a frezei interioare și exterioare, crescând astfel randamentele de PhG. Viteza optimă de rotație a fost de 16000 rpm.

Efectul timpului de extracție asupra extracției PhG

Randamentele de echinacozidă și acteozidă la diferiți timpi de extracție sunt prezentate în Figura 6. Randamentele de echinacozidă și acteozidă au fost stabile cu creșterea timpilor de extracție. Prin urmare, se poate concluziona că PhG-urile pot fi extrase complet din C. tubulosa în 2 min, iar timpul optim de extracție a fost de 2 min.

Efectul raportului solid-lichid asupra extracției PhG

După cum se arată în Figura 7, au fost discutate randamentele de echinacozidă și actozidă în diferitele rapoarte solid-lichid. Randamentele de echinacozidă și acteozidă au crescut de la 1:3 la 1:9 și au devenit stabile de la 1:9 la 1:24. Deoarece o cantitate mică de solvent de extracție nu poate dizolva complet echinacozidul și actozidul, ratele de transfer de masă au fost reduse. Extracția excesivă de solvenți a provocat deșeuri inutile. Prin urmare, raportul optim solid-lichid a fost de 1:9.

Efectul numărului de cicluri de extracție asupra extracției PhG

Figura 8 arată că efectele unui număr de cicluri de extracție asupra randamentelor de PhG. Randamentele de echinacozidă și actozidă au crescut odată cu creșterea numărului de cicluri de extracție. Cu toate acestea, timpii de extracție au crescut remarcabil odată cu creșterea ciclurilor de extracție și a fost consumată mai multă energie. Numărul optim de cicluri de extracție a fost unul.

Compararea metodei HSHE cu alte metode de extracție pentru extragerea PhG

Rezultatele metodei HSHE în comparație cu alte metode de extracție pentru extragerea PhG din C. tubulosa sunt enumerate în tabelul 3. HSHE este mai simplă și mai ușoară decât metodele de cuplare, cum ar fi extracția apoasă în două faze asistată cu ultrasunete și tehnologia de extracție cu ultrasunete cu microunde. metode. În plus, presiunea de extracție a HSHE este mai mică decât metoda de extracție a lichidului sub presiune, iar condițiile de funcționare ale primei sunt mai sigure. Mai important, se poate observa din Tabelul 3 că HSHE arată cel mai scurt timp de extracție și cel mai mic consum de solvenți dintre toate metodele de extracție. Se poate concluziona că metoda HSHE are multe avantaje precum eficiență ridicată, condiții blânde de funcționare, niveluri scăzute de consum, echipamente simple și operare ușoară pentru extracția produselor naturale.

Concluzii

În acest studiu, a fost investigată o metodă HSHE eficientă și ecologică pentru extracția PhG din C. tubulosa. În comparație cu metodele EAU și MAE, noua metodă HSHE produce un randament mai mare de PhG în aceleași condiții. În comparație cu metoda MAE, producțiile de echinacozidă și acteozidă au crescut cu 20,5 și, respectiv, 20,8%. Și, în comparație cu Emiratele Arabe Unite, producțiile de echinacozidă și actozidă au crescut cu 6,6 și, respectiv, 7,4 la sută. Parametrii de extracție ai HSHE de PhG din C. tubulosa au fost optimizați. Conform parametrilor optimizați, randamentele de echinacozidă și actozidă au ajuns la 1,366, respectiv 0,519 la sută, iar ratele de transfer ale echinacozidei și acteozide au ajuns la 87 și, respectiv, 94 la sută. Metoda HSHE are avantajele unei eficiențe ridicate, condiții blânde de funcționare, niveluri scăzute de consum, echipamente simple, operare ușoară și costuri reduse. Această cercetare oferă o nouă metodă pentru extracția industrială a PhG din C. tubulosa.