Fisetina atenuează răspunsurile inflamatorii induse de lipopolizaharide la macrofage

Pentru mai multe informații contacteazătina.xiang@wecistanche.com

Mai multe studii au raportat eficacitatea și siguranța polifenolilor în sănătatea umană; cu toate acestea, verificarea eficacității lor rămâne insuficientă. Scopul acestui studiu a fost de a examina dacă fisetina, unul dintre flavonoidele prezente predominant în fructe și legume, ar putea suprima lipopolizaharidele (LPS) induse.inflamatorrăspunsuri la macrofage. LPS a crescut abundența ARNm proinflamator (MCP 1, IL-1ß și iNOS), dar au fost suprimate de fisetină. Creșterea oxidului nitric de către LPS, un factor de stres oxidativ, a fost atenuată de fisetină. În plus, fosforilarea îmbunătățită cu LPS a protein kinazei activate de mitogen (ERK și JNK) a fost redusă. În cele din urmă, fisetina a atenuat expresia sau activitatea uPA, uP AR, MMP-2 și MMP{-9, care sunt cunoscuți ca factori asociați ai recrutării sau infiltrării macrofagelor. In concluzie,fisetineste un agent terapeutic promițător pentru bolile inflamatorii legate de macrofage, cum ar fi sepsisul și ateroscleroza.

Faceți clic aici pentru a afla mai multe informații.

1. Introducere

Utilizarea terapeutică a componentelor naturale a câștigat mai multă atenție în ultimele 2 decenii. Pe baza eficienței lor mari și a toxicității scăzute, 40% dintre agenții terapeutici aprobați de FDA sunt componente naturale sau derivați ai acestora [1]. Toxicitatea asociată cu alte medicamente a fost prevenită cu succes prin diferite produse naturale [2]. Astfel, este foarte important și semnificativ să explorezi în continuare compușii naturali derivați din plante.

Polifenolisunt metaboliții secundari ai plantei și sunt prezenți pe scară largă în alimente și băuturi de origine vegetală, fructe, legume, condimente, ceai și vin. Deși nu sunt considerați micronutrienți esențiali, mai multe tipuri de literatură evidențiază efectele lor benefice asupra sănătății umane, în special în dietele asociate cu un consum ridicat de fructe și legume [3-5]. Numeroase studii au fost efectuate de-a lungul deceniilor pentru investigarea efectelor farmacologice ale polifenolilor, sugerând beneficii pentru sănătate. Dovezile tot mai mari au arătat că câțiva polifenoli posedăantiinflamatorproprietăți

[6-8].În plus, studii recente au demonstrat că mai multe tipuri de polifenoli pot inhiba enzimele reglatoare sau factorii de transcripție care sunt implicați în inflamație [9].

Dieta influențează diferite stadii de inflamație și demonstrează un impact important asupra mai multor boli inflamatorii[10,11]. Inflamația joacă un rol cheie în dezvoltarea bolilor precum diabetul, astmul, bolile cardiovasculare și cancerul [12]. Prin urmare, controlul inflamației poate preveni aceste boli. Deoarece macrofagele sunt mediatori majori ai inflamației, ele au diverse funcții în homeostazia și inflamația țesuturilor. Astfel, agenții care își modulează eficient funcțiile sunt de mare valoare clinică, deoarece activarea aberantă a macrofagelor poate provoca răspunsuri imune dăunătoare. Tendința actuală de cercetare indică în mod clar că produsele naturale sunt una dintre cele mai importante surse de medicamente noi [13].

Un polifenol, isetina (3,3',4',7-tetrahidroxiflavonă), este conținut bogat în căpșuni, măr, roșii, ceapă, portocale, piersici, struguri, kiwi, curmal, ceai și vin [14] . Până acum, fisetina a raportat un puternic antiinflamator [15-17],

efecte antioxidante [18], antitumorigenice[19,20, antiangiogenice [21], antidiabetice [22], neuroprotectoare [23] și cardioprotectoare [24] atât în ​​cultura celulară, cât și în modelele animale relevante pentru bolile umane. Deși fisetina are multe efecte fiziologice, efectul său asupra macrofagelor nu este prea mult raportat.

În studiul de față, am investigat efectele benefice ale fisetinei asupra răspunsului inflamator al macrofagelor activate delipopolizaharidă(LPS).

2. Materiale și metode

2.1. Izolarea macrofagelor peritoneale rezidente.

Șoarecii BALB/c au fost obținuți de la Institutul de Științe Medicale al Universității din Tokyo și menținuți în Centrul de Resurse Animale al Universității Okayama. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile NIH (Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator). Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetele de evaluare etică pentru experimentarea animalelor de la Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Toți șoarecii au fost menținuți într-o unitate de barieră și au fost hrăniți cu o dietă normală de laborator. Șoarecii masculi și femele BALB/c, în vârstă de 16 ± 4 săptămâni au fost anesteziați cu izofluran și eutanasiați prin luxație cervicală. Macrofagele au fost recoltate prin lavaj peritoneal folosind soluție salină (5 ml). Soluția de lavaj peritoneal a fost centrifugată la 1500 rpm timp de 5 minute. Sedimentul a fost suspendat în puțin DMEM (SIGMA, Cat. Nr. D6046). Globulele roșii au fost lizate folosind o soluție de clorură de amoniu. Numărul de macrofage a fost calculat folosind un hemocitometru, apoi s-a resuspendat în DMEM care conținea FBS inactivat la căldură (10 procente vv), penicilină (10 U/mL) și streptomicina (10 mg/mL) și s-a placat în 6-godeu. plăci (Corning Incorporated, Cat. Nr.3516) [25,26].

2.2. Condiții de cultură celulară.

După înfometarea serului peste noapte, macrofagele au fost incubate cu concentrații selectate de fisetină (10, 30 și 100 μM); SIGMA, Cat. F4043) sau vehicul timp de 3 ore și incubat în prezența sau absența LPS (10ng/mL; SIGMA, Cat. Nr. L4391) pentru un timp adecvat. Apoi, mediul și celulele au fost colectate. Mediul a fost utilizat pentru analiza oxidului nitric (NO) și zimografia cu gelatină. Lizatele celulare au fost utilizate pentru reacția cantitativă în lanț a polimerazei (qPCR) și Western blotting.

2.3. Reacție în lanț a polimerazei în timp real.

ARNm-urile au fost extrase din macrofage folosind RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. Nr. 74104). Transcrierea inversă a fost efectuată utilizând un kit de sinteză iScript cADN (Bio-Rad, Cat. Nr. 1708891). qPCR a fost efectuată cu un sistem ABI Step One Real-Time PCR (Applied Biosystems, QuantStudio 3) utilizând un Fast SYBR Green Real-time PCRMixture (Applied Biosystems, Cat. Nr. 4385612)[27). Primeri pentru proteina chemotactică monocitară 1(MCP-1)(Takara Bio Inc, Cat. nr. MA066003), interleukina 1 beta(IL{-1) (Takara Bio Inc., Cat. nr. MA025939), oxid nitric sintază inductibilă (iNOS) (Takara Bio Inc, Nr. cat. MA083369), metaloproteinaza matricei-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., Nr. cat. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Cat. Nr. MA031311), şi ARN ribozomal 18S (18S) (Takara Bio Inc., Cat. Nr. MA050364) au fost disponibile comercial. Fiecare probă a fost normalizată la valori pentru expresia ARNm 18S (metoda AACT) [27].

2.4. Analiza oxidului nitric.

Supernatantele individuale ale culturii celulare au fost colectate și centrifugate 10 min la 14,000rpm la 4 grade. Apoi, supernatantul a fost utilizat pentru analiza oxidului nitric (NO). Analiza NO a fost efectuată așa cum este descris în kiturile disponibile comercial (BioAssay Systems, Cat. Nr. D2NO-100). Kitul de testare a oxidului de azot QuantiChrom de la BioAssay Systems este un test colorimetric pentru determinarea producției de NO după reducerea nitratului la nitriți, folosind metoda Griess îmbunătățită.

2.5. Western Blotting.

Proteinele cu celule întregi au fost extrase din macrofage utilizând un tampon de liză (Cell Signaling, Cat. Nr. 9803). Fiecare probă a fost aplicată în 10% SDS-PAGE și transferată pe o membrană de fluorură de poliviniliden, imunoblotată cu anticorpi primari (fosforilarea kinazei reglate de semnal extracelular (p-ERK); Cell Signaling, Cat. Nr. 9101, fosforilarea c-Jun kinaza N-terminală (p-JINK); Semnalizare celulară, Cat. Nr. 9251, activatorul plasminogenului urokinazei (uPA); Abcam, Cat. Nr.

ab20789, activatorul urokinazei plasminogenului și receptorul (uPAR); R&D, Cat.Nr.AF534 și -actină; Sigma Cat. Nr. A5441)[28]. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpi secundari corespunzători, iar complexele imune au fost vizualizate pe chemiluminiscență (Merck Millipore, Cat. nr. WBLUF0100, Cat.nr. WBLUC0100) și cuantificate folosind un General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Zimografie cu gelatină.

Supernatanții culturii celulare au fost dizolvați în condiții nereducătoare prin SDS-PAGE (10 procente în greutate/vol) polimerizat în prezența gelatinei (0,1 procente în greutate/greutate) pentru a evalua activitățile MMP{ {4}}. Gelurile au fost spălate cu Triton X-100(2,5 procente vol/vo) timp de 60 de minute și apă distilată timp de 15 minute de două ori. Gelurile au fost apoi incubate peste noapte la 37 de grade Cin 50 mM Tris tampon care conține clorură de calciu (5 mM) pH 8,0. După incubare, gelurile au fost colorate cu Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, Cat. nr.{ {18}}) timp de 30 de minute la temperatura camerei, apoi urmată de decolorare cu soluție de decolorare Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, Cat. nr.161-0438) până când au apărut benzi clare. Imaginile cu gel au fost cuantificate folosind un General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); regiunile necolorate, translucide digerate au reprezentat zone de activitate MMP [30].

2.7. Statistici.

Toate analizele statistice au fost efectuate folosind Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, California, SUA). Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei. Semnificația statistică între mai multe grupuri a fost evaluată prin analiză unidirecțională sau bidirecțională a varianței, urmată de testul post-hoc Holm-Sidak sau testul post-hoc Student-Newman-Keuls. pvaloare<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultate

3.1. Mediatori inflamatori atenuați de fisetina în macrofage stimulate cu LPS.

Deoarece macrofagele activate produc citokine proinflamatorii și mediatori inflamatori precum NO[8], am examinat efectele fisetinei asupra mediatorilor inflamatori din macrofagele stimulate cu LPS. În primul rând, pentru a studia dacă fisetina exercită efectul antiinflamator la nivel transcripțional, am determinat nivelurile de expresie a ARNm A ale genelor inflamatorii, cum ar fi MCP-1, IL-1 și iNOS (Figura 1(a) ). După cum era de așteptat, expresiile acestor gene inflamatorii au fost suprimate de fisetină într-o manieră dependentă de doză. Apoi, pentru a confirma dacă fisetina suprimă răspunsul inflamator la macrofage, am evaluat capacitatea sa de a suprima producția de NO în macrofagele tratate cu LPS (Figura 1 (b)). După cum era de așteptat, fisetina a scăzut producția de NO într-o manieră dependentă de doză.

3.2. Fisetin Reduced Mitogen-Activated Protein Kinaza în macrofage stimulate cu LPS.

Deoarece fisetina a fost raportată că inhibă căile proteinei kinazei (MAPK) activate de mitogen în diferite tipuri de celule [31, 32], am examinat efectele fisetinei asupra MAPK-urilor din macrofage. În primul rând, a fost observată activarea MAPK-urilor induse de LPS în macrofage (Figura 2 (a)). Creșterea p-ERK prin LPS a atins vârful la 15 minute după stimulare, în timp ce creșterea p-JNK prin LPS a atins un vârf la 30 de minute. Astfel, în experimentele ulterioare, macrofagele au fost stimulate cu LPS timp de 30 de minute. Cotratamentul cu fisetină a scăzut semnificativ îmbunătățirea p-ERK și p-JNK indusă de LPS (Figurile 2 (b) și 2 (c)).

3.3. Fisetin a redus uPA și uPAR în macrofage stimulate cu LPS.

Activarea macrofagelor este strâns corelată cu caracterul invaziv al celulelor. În plus, uPA și uPAR în macrofage contribuie la infiltrarea celulelor. Astfel, a fost investigat efectul fisetinei asupra expresiei uPA și uPAR. LPS a indus abundența proteinelor uPA (Figura 3 (a)) și uPAR (Figura 3 (b)). Cotratamentul cu fisetină a redus creșterea uPA (Figura 3 (a)) și uPAR prin LPS (Figura 3 (b)).

3.4. Fisetin MMP-2 și MMP-9 reduse în macrofage stimulate cu LPS.

Mai mult, pentru a elucida efectul fise-tinului asupra MMP-urilor, am examinat expresiile MMP-2 și MMP{-9, mediatorii din aval ai uPA/uPAR. În ceea ce privește nivelul ARNm, LPS a crescut semnificativ expresia ARNm MMP-2 și MMP{-9, în comparație cu tratamentul cu vehicul (Figura 4(a)). Fisetin a redus îmbunătățirea acestor expresii genice ale MMP-2 sau MMP9 induse de LPS într-o manieră dependentă de doză (Figura 4(a)). Mai mult, activitățile proteice ale MMP-9 au fost evaluate prin zimografie (Figura 4(b)). Activitățile proteice ale MMP-9(92kDa) au fost crescute prin stimularea LPS, care a fost redusă de fisetină (Figura 4(b)).

4. Discutie

Am găsit un efect important al fisetinei împotriva inflamației la macrofage. Prezentul studiu a demonstrat că fisetina a atenuat inducerea componentelor inflamatorii, cum ar fi MCP-1, IL{-1, iNOS și NO, induse de LPS în macrofage. În plus, fisetina a suprimat activarea MAPK și a atenuat creșterea indusă de LPS a expresiei uPA și uPAR. Mai mult, fisetina a atenuat creșterea abundenței ARNm a MMP-2 și MMP{-9 și activitatea MMP{-9.

În sepsisul cauzat de infecția cu gram-negativ, LPS este în mod obișnuit recunoscut ca agent cauzator al sepsisului. În multe studii, LPS a fost folosit ca model de sepsis, precum și de inflamație. Mai mult, inflamația cronică induce cancerul precoce prin activarea celulelor inflamatorii și producția necorespunzătoare a unui mediator proinflamator precum iNOS și a factorilor de transcripție precum factorul de transcripție nuclear kappa B (NF-xB) [33]. În plus, s-a raportat, de asemenea, că stresul oxidativ este redus prin atenuarea expresiei iNOS [34]. Studiul nostru a demonstrat că fisetina poate fi eficientă în prevenirea și tratamentul sepsisului și șocului septic, datorită efectului supresor asupra abundenței ARNm a genelor proinflamatorii și producerii de NO. În acest studiu, fisetina a suprimat producția de NO prin reducerea expresiei ARNm a genei proinflamatorii (iNOS); prin urmare, era probabil ca fisetina să atenueze stresul oxidativ. În consecință, aceste rezultate au susținut efectele antiinflamatorii, antitumorigenice și antioxidante ale fisetinei.

Mai multe studii au raportat că LPS a indus fosforilarea MAPK-urilor, inclusiv ERK și JNK [35]. În plus, sa raportat că fisetina inhibă migrarea și invazia celulelor cervicale umane prin reglarea în jos a expresiei uPA prin suprimarea MAPK [36].În macro -fagi, sunt disponibile puține rapoarte cu privire la efectul fisetinei asupra expresiei și activității uPA și uPAR. Studiul nostru a demonstrat pentru prima dată că fisetina a suprimat expresia uPA și uPAR indusă de LPS prin suprimarea semnalizării MAPK în macrofage, așa cum sa raportat anterior în celulele canceroase.

MMP-urile sunt o familie de proteaze a căror expresie este legată de anumite procese, cum ar fi dezvoltarea, fiziologia și patologia. În mod obișnuit, MMP-9 a fost recunoscut ca un marker al diferitelor boli inflamatorii, cum ar fi ateroscleroza, artrita și lupusul eritematos sistemic [37]. În plus, MMP-9 a fost strâns asociată cu migrarea celulelor [38,39]. Mai multe studii au raportat în special că MMP-2 și MMP{-9 sunt implicate în aterogeneză și joacă un rol important în stabilizarea plăcilor de ateroscleroză 40-42]. În acest punct, rezultatele noastre sugerează că inhibitorii de MMP-9 poate oferi promisiune ca abordare terapeutică pentru stabilizarea plăcilor vulnerabile. Mai mult, investigații recente au demonstrat că vindecarea rănilor la nivelul pielii este afectată de activarea excesivă a MMP-9 [43]. Prin urmare, s-a sugerat că fisetina are și potențial ca abordare terapeutică pentru vindecarea pielii. Vor fi necesare studii viitoare pentru a elucida detaliile sale asupra mecanismelor moleculare.

O tendință recentă în industria farmaceutică este descoperirea de strategii de dezvoltare a plantei naturale în sine ca noul medicament. Într-adevăr, două studii recente pe animale au demonstrat că inflamația pulmonară acută indusă de LPS și artrita indusă de colagen au fost îmbunătățite prin tratamentul cu fisetină |32,44. Un alt studiu ex vivo a demonstrat, de asemenea, că fisetina a fost capabilă să atenueze eliberarea de citokine indusă de LPS din leucocite la pacienții cu boală pulmonară obstructivă cronică sau diabet de tip 2[45]. Multe medicamente imunosupresoare au fost dezvoltate pentru a atenua bolile inflamatorii și autoimune[46-50]; cu toate acestea, majoritatea compușilor prezintă efecte secundare semnificative. Deoarece polifenolii sunt prezenți în mod obișnuit în fructele și legumele dietetice, se presupune că aceștia pot fi agenți imunosupresivi mai siguri [51, 52]. Fructele și legumele conțin o gamă largă de substanțe fitochimice, inclusiv lactone sesquiterpenice, terpenoide, polizaharide și compuși fenolici. Rezultatele noastre, care demonstrează efectele antiinflamatorii, antitumorigenice și antioxidante ale fisetinei, indică puternic că aceasta poate fi dezvoltată ca un nou medicament. Deși fisetina este un candidat promițător pentru imunoterapie, potențialul produselor naturale care conțin fisetina ca agent terapeutic pentru o anumită boală trebuie să fie verificat în continuare în cadrul clinic.

5. Concluzii

Studiul de față a demonstrat că fisetina a atenuat incrementele deinflamatorgenele (MCP-1, IL-1b și iNOS), producția de NO și fosforilarea MAPK, uPA, uPAR și MMP, induse de LPS în macrofage. Aceste rezultate au sugerat că fisetina poate fi un agent terapeutic pentru mai multe boli legate de macrofage.