Partea 1: Efectele antiinflamatorii, antioxidante, hidratante și antimelanogeneză ale quercetinei 3-O{- -D-glucuronidei în cheratinocitele umane și celulele melanomului prin activarea căilor NF-κB și AP-1

Pentru mai multe informații contacteazătina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Quercetină3-O- -D-glucuronida(Q-3-G), conjugatul glucuronid al quercetinei, a fost raportată ca avândantiinflamatorproprietăți în macrofagele stimulate de lipopolizaharide, precum și proprietăți anticancerigene și antioxidante. Spre deosebire de quercetina, care a fost descrisă pe larg ca având o gamă largă de activități farmacologice, inclusiv efecte de protecție a pielii, beneficiile și mecanismele farmacologice ale Q-3-G în piele au rămas de elucidat. Acest studiu s-a concentrat pe caracterizarea proprietăților de protecție a pielii, inclusiv proprietățile antiinflamatorii și antioxidante, ale Q-3-Împotriva stresului oxidativ indus de UVB sau H2O2-, efectele de hidratare șiantimelanogenezaactivități folosind celulele keratinocite umane (HaCaT) și melanom (B16F10). Q-3-G a reglat în jos expresia genei proinflamatorii și a citokinei, cum ar fi ciclooxigenaza-2 (COX{-2) și factorul de necroză tumorală (TNF) - în HO sau UVB - celule HaCaT iradiate. De asemenea, am arătat că O-3-Gexhibits au un efect antioxidant folosind teste de captare a radicalilor liberi, citometrie în flux și o expresie crescută a factorului 2 asociat factorului nuclear eritroid 2- (Nrf2). Q-3-G a redus producția de melanină în celulele B16F10 induse de hormonul de stimulare a melanocitelor (-MSH). Efectele de hidratare și mecanismele Q-3-G au fost examinate prin evaluarea genelor legate de factorul de hidratare, cum ar fi transglutaminaza-1(TGM{-1), filagrina (FLG) și sintaza acidului hialuronic (ARE)-1. În plus, Q-3-G a crescut fosforilarea c-Jun, Jun N-terminal kinazei (JNK), Mitogen-activated protein kinazei (MAPK) kinazei 4 (MKK4) și TAK1, implicate în MAPKs/AP calea -1 și fosforilarea IkB, IkB kinazei(IKK)-, Akt și Src, implicate în calea NF-kB. Luați împreună, am demonstrat că Q-3-G exercită proprietăți antiinflamatorii, antioxidante, hidratante și antimelanogeneză în keratinocitele umane și celulele melanomului prin căile NF-kB și AP-1.

Cuvinte cheie: quercetin 3-O- -D-glucuronid;protecție UV; hidratare; antimelanogeneza; AP-1; NF-kB

1. Introducere

Pielea, cel mai mare organ al corpului, oferă o barieră care joacă un rol major în protejarea organismului de mediul extern și de factorii dăunători, cum ar fi radiațiile ultraviolete, microbii infecțioși și substanțele chimice nocive. Această barieră reglează, de asemenea, echilibrul electrolitic și temperatura corpului și previne pierderea umidității [1,2]. Pielea umană este compusă din trei straturi: epiderma, dermul cu anexe și țesutul subcutanat [3]. Stratul epidermic joacă un rol important în menținerea temperaturii corpului.

Keratinocitele, componenta abundentă din epiderma pielii, interacționează strâns cu alta prin desmozomi și joncțiuni strânse care permit o barieră fizico-chimică eficientă[4]. Deși pielea funcționează ca o barieră de protecție, radiațiile ultraviolete (UV) au un efect semnificativ asupra majorității celulelor, inclusiv asupra keratinocitelor, stratul exterior al pielii. Radiațiile UV pot provoca îmbătrânirea pielii, deteriorarea pielii, riduri și hiperpigmentare, care este considerat a fi unul dintre cei mai cenzurați factori de risc [5]. Lumina UV constă din trei intervale de lungimi de undă: UVA(320-400 nm), UVB. (280-320 nm) și UVC (200-280 nm). Pe lângă peroxidul de hidrogen (H2O2), despre care se știe că contribuie la stresul oxidativ, UVB poate duce la producerea de specii reactive de oxigen (ROS) prin activarea enzimelor generatoare de ROS [6]. S-a descris că acumularea necontrolată de ROS în celule, inclusiv keratinocite, provoacă modificări oxidative ale lipidelor, proteinelor, acizilor nucleici și altor molecule intracelulare, care ulterior duc la diferite tipuri de leziuni ale pielii și procese legate de îmbătrânire, cum ar fi moartea celulară, stresul oxidativ, și inflamație [7,8]. În plus, se știe că răspunsul la stresul oxidativ influențează deteriorarea diferitelor componente celulare [9]. Celulele pielii deteriorate pot duce, de asemenea, la răspunsuri inflamatorii, ducând la deteriorarea cronică a pielii [10]. Un tip de afectare a pielii mediată de UVB sau H2O2- prin procese biologice este expresia genelor inflamatorii, cum ar fi ciclooxigenaza-2 (COX{-2) și citokinele proinflamatorii [11]. Prin urmare, dezvoltarea unor efecte de protecție a pielii mai sigure, mai robuste și eficiente este esențială pentru prevenirea și blocarea bolilor asociate cu leziunile cutanate mediate de UVB sau H2O2.

Hidratarea pielii joacă, de asemenea, un rol important în menținerea funcției normale. În special, stratul cornos (SC) are un efect protector împotriva pierderii de apă [12]. Conținutul de apă al stratului cornos participă la descuamarea pielii și la maturarea adecvată, în timp ce apa insuficientă în SC promovează acumularea și disfuncția corneocitelor [12,13]. În etapele finale ale diferențierii keratinocitelor, membrana plasmatică și organelele celulare dispar, iar apoi influxul de calciu induce transglutaminaza (TGM) pentru reticulare cu alte proteine. O deficiență sau o pierdere de TGM-1 duce la o reticulare defectuoasă a învelișului celular. Ihtioza lamelă este un exemplu de boală cauzată de o pierdere a TGM-1. În plus, filagrina (FLG), matricea de keratina formată, joacă un rol în formarea SC, deoarece acționează ca o schelă pentru a lega proteinele și lipidele din învelișul cornificat [14] prin catalizarea reacțiilor de reticulare a g-glutamil lizinei, a ATGM și a membranei. -enzime asociate, conferind integritate SC-urilor [15]. În plus, acidul hialuronic (HA) este un tip de factor natural de umiditate (NMF) implicat în reținerea umidității în piele și prezintă un profil distinct în îmbătrânirea intrinsecă a pielii, este un agent de administrare a medicamentelor și este o componentă importantă a matricei extracelulare. [16,17]. HA joacă un rol în creșterea umidității pielii prin reglarea genelor acidului hialuronic sintaza (HAS); în plus, acidul retinoic (vitamina A) poate regla eficient HA în epidermă [17]. TGM-1, FLG și HAS-12,3 sunt gene asociate cu producția de NMF [18]. Mai mult, activarea factorilor de transcripție precum proteina activatoare-1(AP{-1) și factorul nuclear (NF)-kB sunt implicate în producerea de substanțe proinflamatorii care optimizează bariera pielii și hidratarea pielii. prin căile AP-1 și NF-kB[19]. Enzimele de semnalizare din amonte din calea AP-1 includ protein kinazele activate de mitogen (MAPK), cum ar fi kinaza N-terminală c-Jun (JNK), kinaza reglată de semnal extracelular (ERK) și p38, în timp ce Src, Akt, IkB-kinaza (IKKo/) și KBO(IkBa) aparțin căii NF-KB [20. Pielea produce și melanină în stratul epidermic, în special în melanocite – sursa majoră de melanină – care contribuie la determinarea culorii pielii și a melanogenezei [21]. Iradierea UVB și hormonul de stimulare a melanocitelor (o-MSH) pot stimula secreția de melanină, declanșând astfel melanogeneza [22. În timpul melanogenezei, -MSH activează protein kinaza A (PKA), factorul de transcripție asociat microftalmiei proteice (MITF) și legarea elementului de răspuns cAMP (CREB) [23]. Una dintre funcțiile melaninei este considerată a fi prevenirea leziunilor pielii cauzate de UV, inclusiv în lumina soarelui. Cu toate acestea, producția în exces de melanină sau absența conținutului de melanină cauzată de îmbătrânire, hormonul de stimulare a melanocitelor și expunerea la UV favorizează pistruii, melasma, lentiginele senile și alte tulburări de hiper/hipopigmentare care ar putea avea un impact negativ asupra aspectului și pielii. sănătate [24]. Astfel, controlul melanogenezei este de asemenea dorit pentru a menține atât aspectul sănătății, cât și aspectul cosmetic al corpului uman.

Quercetinăeste un flavonoid de tip flavonol alocat predominant prezent în legume, fructe, băuturi și plante medicinale [25]. În consecință, quercetina a fost studiată pe larg pentru a avea beneficii farmacologice, inclusiv antiinflamatorii, anti-aterosclerotice,antioxidant, anticancer și proprietăți de protecție a pielii și este legată de melanogeneză [24,26-29]. Cu toate acestea, mai multe lucrări care utilizează metode sensibile și de încredere au demonstrat că quercetina nu a fost detectată în plasmă [30-33] și că este greu de găsit în creier [34,35]. Quercetina, care se prezintă în general sub formă de glicozidă, este bine absorbită și în mare parte hidrolizată și metabolizată în intestinul subțire, colon, ficat și rinichi în metaboliți conjugați [30,36-38]. Doar metaboliții conjugați, cum ar fi glucuronida sau sulfatul (metilați sau, respectiv, nemetilați), mai degrabă decât quercetina aglicona sau glicozidele sale, sunt detectați în sângele circulant. 3/-metil-quercetin-3-glucuronid, quercetin-3-glucuronid și quercetin-3'-sulfat au fost identificați ca metaboliți plasmatici majori după 1,5 ore de la consumul de ceapă prăjită[30, 32]. Acești metaboliți de quercetină sunt formați în intestinul subțire și ficat de către enzimele de biotransformare, inclusiv UDP-glucuroniltransferaze, ca rezultat al metabolismului de faza II [29,39,40]. S-a raportat, de asemenea, că metaboliții conjugați ai quercetinei se acumulează în plasma umană în intervalul de concentrație de la 10-'la 10- grad M după ingestia periodică de ceapă în timpul meselor timp de 1 săptămână[41]. Timpul de înjumătățire al metaboliților quercetinei este destul de mare, de aproximativ 11 până la 28 de ore [29]. Deoarece acești compuși au fost observați ca principalele forme de metaboliți conjugați ai quercetinei, studiile care se concentrează pe activitatea biologică a flavonolilor folosind acești metaboliți conjugați ar fi esențiale, ceea ce ne-a determinat să studiem activitatea biologică a unuia dintre metaboliții quercetinei conjugați. Unul dintre cei mai abundenți metaboliți glucuronizi găsiți în principal în plasmă și țesuturi, inclusiv în ficat, rinichi și creier este quercetina 3-O{- -D-glucuronida (Q{-3-G) (Figura 1) [31,35,40,42,43], care pot genera activități similare, mai puternice sau mai slabe în comparație cu compușii de bază din diferite modele. Q-3-G este transportat la țesuturile țintă prin plasmă pentru a-și exercita activitatea biologică [39]. O-3-G s-a dovedit, de asemenea, a fi un metabolit eficient în plasma de șobolan după administrarea orală de quercetină [43]. În alte studii, s-a descoperit că metabolitul care conține Q-3-G este acumulat în aortă după administrarea de alimente bogate în quercetină și a fost identificat ca un principiu activ detectat în sângele uman, variind de la 0.{{48} } μM【44】. În plus, Q-3-G poate fi găsit în vin [45] și în plante medicinale precum Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis și fasole verde [{46-49].Q{-3-G a fost descrisă ca o componentă antiinflamatoare în condiții stimulate de LPS și a prezentat proprietăți antioxidante în plasma sanguină [50-52]. Cu toate acestea, în comparație cu istoria lungă de aplicare și cu studiul amplu al quercetinei, studiul Q-3-G rămâne de explorat. Prin urmare, Q-3-G a fost ales ca reprezentant al metaboliților quercetinei ca jucător activ in vivo al quercetinei. În plus, rolul Q-3-G asupra efectelor de protecție a pielii nu a fost încă pe deplin elucidat. În acest studiu, folosind diferite evaluări in vitro, am investigat efectele protectoare ale pielii ale Q-3-G împotriva stresului oxidativ și inflamației induse de UVBor H2O{2-, hidratarea pielii în HaCaT (o linie celulară de keratinocite umane) celule și activitate antimelanogeneză în celulele B16F10 (o linie celulară de melanom murin).

2. Rezultat

2.1. Efectele antiinflamatorii și antioxidante ale Q-3-G împotriva celulelor HaCaT stimulate de UVB sau H2O2-

Țesutul pielii poate fi deteriorat de radiațiile UV. Radiațiile UV activează mai mulți factori nocivi, inclusiv stresul oxidativ, moartea celulelor apoptotice, inflamația și îmbătrânirea pielii. Pentru a determina activitățile de protecție UV ale Q-3-G, inițial, am evaluat dacă Q-3-G are vreun efect asupra viabilității celulare a keratinocitelor umane. Folosind un test de 3-(4-5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-difenil{-243 bromură de tetrazoliu (MTT), am investigat efectele citotoxice de O-3-G în celulele HaCa. După cum se arată în Figura 2a, nu a existat nicio interferență semnificativă asupra viabilității celulare la o concentrație de 2,5-20 uM de Q-3-G, ceea ce a indicat că O-3-G nu a prezentat nicio citotoxicitate până la 20 μM și nu a afectat cheratinocitele, stratul superficial al celulelor pielii. Apoi, am evaluat efectele de protecție a pielii ale Q-3-G în celulele HaCaT expuse la UVB. După iradierea UVB la 30 mJ/cm², Q-3-G a protejat semnificativ celulele HaCaT de moartea celulară indusă de UVB într-o manieră dependentă de concentrație (Figura 2b). În acord cu testul MTT, folosind o cameră conectată la un microscop pentru a capta morfologia celulelor HaCaT, Q-3-G a protejat împotriva morții celulare din cauza celulelor HaCaT iradiate cu UVB până la o concentrație de 10 μM (Figura 2c) . Numărul de celule HaCaT în fiecare condiție a fost de 482 pentru grupul netratat, 91 pentru grupul UVB 30 mJ/cm, 276 pentru grupul UVB 30 mJ/cm² plus 5μM O-3-G și 320 pentru UVB 30 mJ/cm² plus 10μM Q-3-G Group (Figura 2d). Aceste rezultate au confirmat că Q-3-G inhibă daunele HaCaT induse de UVB și salvează efectul de protecție a pielii de la iradierea UVB.

Apariția și exacerbarea inflamației în organism activează ocazional macrofagele și eliberează unele citokine. Inflamația este un semn distinctiv al stresului oxidativ. Am investigat efectul antiinflamator al Q-3-G împotriva inflamației induse de UVB sau HO2-. Este bine cunoscut faptul că UVB poate promova deteriorarea ADN-ului și inflamarea celulelor pielii 【10】. Am iradiat celulele HaCaT cu UVB 30mJ/cm² și am incubat celulele HaCaT cu H2O2 (500 uM). Am folosit un test PCR în timp real pentru a verifica expresia ARNm a enzimei inflamatorii COX-2 și a citokinei proinflamatorii TNF-. După cum arată rezultatele din Figura 2e,f, o concentrație de 10 μM de O-3-G a inhibat semnificativ expresia ARNm a COX-2 și TNF-. În consecință, Q-3-G a suprimat răspunsurile inflamatorii induse în celulele HaCaT după expunerea la iradierea UVB sau H2O2.

Am folosit teste de captare a radicalilor 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-acid sulfonic)(ABTS) și 2,2-difenil-lpicrilhidrazil (DPPH) - sisteme model utilizate pe scară largă pentru a investiga activitățile de captare in vitro a compușilor naturali — pentru a evalua proprietatea antioxidantă a Q-3-G la diferite concentrații. Celulele HaCaT au fost tratate cu Q-3-G într-o manieră dependentă de concentrație de la 2,5-40 μM în prezența DPPH, iar rezultatul a arătat o activitate semnificativă de captare la mai mult de 2,5 uM (Figura 2g) . Testul ABTS a demonstrat, de asemenea, în mod semnificativ efectele Q-3-G asupra captării radicalilor liberi în moduri dependente de concentrație, cu o valoare IC50 de 1,75 μM (Figura 2h). Acidul ascorbic （AA）, ca martor pozitiv, a arătat cele mai mari efecte antioxidante atât în ​​testele DPPH cât și ABTS. Factorul nuclear eritroid 2-factorul 2 (Nrf2), una dintre genele dependente de elementul de răspuns antioxidant (ARE), sa raportat că reglează oxidoreductazele protectoare și substraturile sale nucleofile, promovând astfel enzimele antioxidante pentru a elimina deteriorarea și repararea. sisteme [53]. Apoi, am examinat nivelul de expresie al Nrf2 în celulele HaCaT iradiate cu UVB. Consolidând constatările de mai sus, O-3-G a îmbunătățit semnificativ nivelul de expresie al Nrf2 la iradierea UVB în comparație cu controlul într-o manieră dependentă de concentrație, până la 10 uM (Figura 2i), ceea ce a implicat că Q-3- G prezintă un efect antioxidant atât din punct de vedere chimic, cât și biologic, cu o proprietate de captare a radicalilor liberi și, respectiv, crește efectul protector al semnalizării ARE dependente de Nrf2-. În plus, am efectuat și citometrie în flux ROS folosind diacetat de diclorodihidrofluoresceină (DCFDA) în condiții UV. Antioxidantul este larg cunoscut că suprimă factorii de stres celulari prin inhibarea producției de ROS [54]. Rezultatul a arătat că tratamentul cu Q-3-G la concentrații de 5 și 10 μM a scăzut nivelul de ROS indus de UVB (Figura 2j). Luate împreună, aceste date au implicat că Q-3-Gexertă proprietăți de protecție a pielii, cum ar fi efecte antiinflamatorii și antioxidante împotriva H2O sau stresul oxidativ și inflamația induse de UVB în celulele HaCaT.

2.2. Efectul antitimelanogeneză în B16F10 și efectul de hidratare în celulele HaCaT ale Q-3-G

Pentru a examina efectele O-3-G asupra melanogenezei, celulele melanomului au fost tratate cu -MSH timp de 48 de ore pentru a secreta melanina în celulele B16F10. Utilizând teste MTT, am confirmat mai întâi că Q-3-G nu a avut citotoxicitate în celulele B16F10 la concentrații de până la 20 μM timp de 48 de ore (Figura 3a). Acest rezultat a arătat, pentru următoarele evaluări, că efectele O-3-G în B16F10 nu s-au datorat morții celulare. Apoi, am evaluat B16F10 cu Q-3-Gand -MSH timp de 48 de ore pentru a determina efectele Q{-3-G asupra melanogenezei. După cum se arată în Figura 3b, Q-3-G a inhibat semnificativ secreția de melanină. Arbutina de control pozitiv a scăzut, de asemenea, semnificativ secreția de melanină.

Molecula legată de umiditatea pielii este acidul hialuronic (HA). După cum sa menționat anterior, HA, distribuit în epidermă și dermă, este un NMF care îmbunătățește hidratarea pielii [55]. Am folosit un test PCR cu transcripție inversă (RT-PCR) pentru a examina nivelul de transcripție al HAS-1 după 12 ore cu o concentrație de Q-3-G de până la 30 uM. HAS promovează acumularea de HA de mărime intermediară în cheratinocite [12]. După cum se arată în Figura 3c, expresia HAS-1 a fost crescută prin tratamentul cu Q-3-G până la 10 μM. Pe lângă factorul de hidratare, am examinat și expresia FLG și TGM{{ 13}}. Am folosit retinolul ca grup de control pozitiv. Nivelurile de transcripție ale FLG și TGM-1 au crescut considerabil după tratamentul cu Q{-3-G la concentrații de până la 10 μM (Figura 3d). Aceste descoperiri sugerează că Q-3-G are activitate de hidratare a pielii în celulele HaCaT. Mai mult, folosind SB203580 (inhibitor p38), SP600125 (inhibitor JNK), UO126 (inhibitor ERK) și Bay11-7082 (inhibitor NF-kB), am examinat implicarea căilor de semnalizare MAPK și NF-kB în hidratare. factorul celulelor HaCaT tratate cu Q-3-G. Pe baza expresiei genei indusă de O-3-G, atât nivelurile de TGM-1, cât și de FLG au fost reduse prin tratamentul cu SP600125, un inhibitor JNK (Figura 3e), sugerând că JNK este necesar pentru a crește expresia. de TGM-1 și FLG în ceea ce privește efectul de hidratare a pielii al O{-3-G. În plus, expresia FLG a fost scăzută și de Bay11-7082, un inhibitor al IKK și IkB, sugerând că mecanismul farmaceutic al Q{-3-G ar putea aparține, de asemenea, căii de semnalizare NF-kB.

2.3. Căile de semnalizare legate de hidratare ale Q-3-G prin activarea AP-1 și NF-kB

Pe baza rezultatelor anterioare ARNm, am emis ipoteza că implicarea semnalizării AP-1 și NF-kB asupra efectului de hidratare al Q-3-G poate apărea și în nivelurile proteinei. Folosind un test Western blot, am examinat fosforilarea moleculelor din amonte de AP-1 și NF-kB. În primul rând, în calea AP{-1, fosforilarea c-Jun a fost crescută după incubarea celulelor HaCaT cu Q-3-G timp de 24 de ore (Figura 4a). Nivelul p-INK a fost, de asemenea, crescut după tratamentul cu Q-3-G la concentrații de 2,5,5 și 10 μM. Forma totală a JNK a rămas neschimbată (Figura 4b). Am examinat în continuare fosforilarea MKK4 și TAK-1, care sunt regulatori în amonte ai JNK. După cum se arată în Figura 3c, după tratamentul celulelor HaCaT cu O-3-G, nivelurile de proteine ​​ale p-MKK4 și p-TAK1 au fost, de asemenea, reglate.

Pe lângă semnalizarea NF-kB, Q-3-G a crescut fosforilarea p50 și p65, o subunitate a NF-kB (Figura 4c). Mai mult, am evaluat activarea IKK și IkBa, care au fost, de asemenea, crescute cu Q-3-G până la 10 uM în comparație cu grupul de control (Figura 4d). În cele din urmă, am determinat activarea moleculelor din amonte implicate în calea de semnalizare NF-kB. Fosforilarea Src și Akt (Ser473) a fost îmbunătățită prin tratamentul cu O-3-G (Figura 4e). În general, aceste date indică faptul că efectele de protecție a pielii ale Q-3-G vizează activarea TAK1 și Src prin creșterea nivelului de proteine, reglând astfel activitatea AP{-1 și, respectiv, NF-kB.

2.4. Efectele Q-3-G asupra activării transcripționale a AP-1 și NF-kB

Am investigat citotoxicitatea celulară a Q-3-G în celulele HEK293T ale liniei de celule de rinichi embrionari umani printr-un test MTT (Figura 4f). Viabilitatea celulelor HEK293T nu a fost afectată semnificativ după tratamentul cu Q-3-G（2.5-20 μM） în comparație cu celulele netratate.

Am folosit un test de luciferază pentru a determina dacă Q-3-G ar putea modula testele de promotor NF-kB și AP-1. Am confirmat că O-3-G a crescut activitatea luciferazei mediată de AP-1- (Figura 4g) și activitatea luciferazei mediată de NF-kB (Figura 4h) într-o manieră dependentă de concentrație. Aceste rezultate validează faptul că activarea AP-1 și activarea NF-KB sunt ținte farmacologice importante ale Q{-3-G.

Faceți clic pe link pentru a obține mai multe informații:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html