Determinarea a cinci componente în Rehmannia Glutinosa și stabilirea amprentei HPLC

Abstract:Metoda de determinare a conținutului a cinci componente înRehmannia glutinosa, și anume,rehmannoside D, ,echinacozid,cistancheside Aşiverbascozid, a fost stabilită și amprenta cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) a Rehmannia glutinosa a fost stabilită pentru a oferi o bază științifică pentru controlul calității Rehmannia glutinosa. S-a folosit coloana Shiseido CAPCELL PAK C18, cu soluție de acetonitril-0.1% acid formic ca fază mobilă, gradient de eluție, temperatura coloanei de 30 grade, determinarea lungimii de undă variabilă și debitul de 1,0 ml/min. Amprenta HPLC a Rehmannia glutinosa a fost analizată de către "Sistemul de evaluare a similitudinii amprentelor cromatografice în medicina chineză (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), RSD-ul testului de precizie, testului de repetabilitate și testului de stabilitate a fost de 0,12%~1,58%, iar rata medie de recuperare a probei a fost de 96,5% ~98,6%; amprenta Rehmannia glutinosa HPLC stabilită a identificat 23 de vârfuri comune, iar asemănarea dintre proba de Rehmannia glutinosa și amprenta de control a fost de 0,904~0,950. Rezultatele sugerează că metoda stabilită de determinare a conținutului și amprenta digitală HPLC sunt adecvate pentru evaluarea calității Rehmannia glutinosa și identificarea Rehmannia glutinosa crudă și Rehmannia glutinosa gătită, cu precizie ridicată și reproductibilitate bună și pot oferi suport tehnic pentru controlul calității Rehmannia glutinosa materiale medicinale.

Cuvinte cheie:Rehmannia glutinosa; determinarea continutului; amprenta; evaluarea calitatii

CISTANCĂ NOUĂ PIRBĂ CUEchinacosidă,Cristancheside aŞIVERBASCOSIDE

Rehmannia glutinosaeste tuberculul rădăcină proaspăt sau uscat al plantei Scrophulariaceae Rehmannia glutinosa Libosch. Datorită diferitelor metode de procesare, este împărțit în principal în rehmannia proaspătă, rehmannia crudă și rehmannia gătită [1-2]. Principalele zone de producție sunt Henan, Shanxi, Shaanxi, etc. Printre acestea, rehmannia glutinosa crudă are efectele de curățare a căldurii și de răcire a sângelui, hrănirea yinului și promovarea producției de fluide și este folosită în principal pentru a trata căldura din sânge, toxinele calde și petele etc.; rehmannia glutinosa gătită are efecte de hrănire a sângelui și a yinului, de a reumple esența și de a reumple măduva și este folosită în principal pentru a trata deficiența de sânge, cloroza etc. Palpitații, neliniște etc.[1-2]. Cele două au proprietăți și arome diferite, dar ambele aparțin meridianelor ficatului și rinichilor. Rehmannia glutinosa conține componente chimice complexe, incluzând în principal iridoide, ionone, feniletanol glicozide, flavonoide etc. [3-5].

După ce Rehmannia glutinosa este procesată prin diferite metode de procesare, tipurile, conținutul și proporțiile componentelor chimice din fiecare produs procesat variază foarte mult, rezultând diferențe semnificative în activitatea sa farmacologică [6-10]. conform

Studii înrudite[11-12] arată că în procesul de schimbare a Rehmannia glutinosa de la „crud” la „gătit”, conținutul de componente chimice precum catalpol, mușca, stahioză și aminoacizi au scăzut semnificativ, iar conținutul de fructoză, 5-hidroximetilfurfural etc. Conținutul de , izorebascozidă etc. a crescut semnificativ. În prezent, controlul calității rehmannia glutinosa crudă și gătită utilizează în principal conținutul de catalpol și rehmanniaside D ca indicatori de evaluare. Indicatorii sistemului de evaluare sunt relativ unici, ceea ce face dificilă controlul cuprinzător al calității rehmannia glutinosa. În plus, studiile au arătat că conținutul de rehmannia glutinosa D se modifică înainte și după procesare. Este mic și are o specificitate slabă în caracterizarea modificărilor compoziției după prelucrare și a gradului de prelucrare [12-13].

Prin urmare, pentru a evalua mai cuprinzător calitatea Rehmannia Glutinosa, acest studiu a stabilit relația dintre Rehmanniaside D și Yimu în Rehmannia glutinosa.

Metode de determinare a conținutului a cinci componente comune, inclusiv glucozid, echinaceaside, cistancheoside A și verbascozid și a stabilit o amprentă HPLC a Rehmannia glutinosa pentru a analiza conținutul principalelor componente din Rehmannia glutinosa din diferite zone de producție și înainte și după procesare; pentru a furniza informații pentru controlul calității Rehmannia glutinosa. Suport tehnic.

Instrumente, reactivi și medicamente de testare

Cromatograf lichid de înaltă performanță Agilent 1260 (detectorul este o matrice de diode); balanta analitica electronica cu gama variabila (METTLER TOLEDO); aparat de curățat cu ultrasunete digital (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). Metanolul (Grupul Sinopharm) este de calitate analitică; acetonitrilul (Merck) este de calitate cromatografică; apa este apă îmbuteliată Watsons. Substanță de referință Rehmannia glutinosa D (număr de lot RFSD8401909016, puritate 98,0%), substanță de referință glicozidă Leonurus (număr de lot RFS-Y22002208010, puritate 98,0%) și substanță de referință cistancheside A (lot numărul RFS-R05002009014, puritate 96,0%) au fost toate achiziționate de la Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; Substanța de referință echinacozidă (număr de lot 111670-201907, puritate 91,8%) și substanța de referință verbascozidă (număr de lot 11530-201914, puritate 95,2%) au fost toate achiziționate de la institutele de inspecție pentru alimente și medicamente din China. Probele de Rehmannia (SX1~SX4, HN1 și HN2) au fost colectate din diferite zone de producție (a se vedea tabelul 1), dintre care SX4 și HN2 au fost aburite de SX1 și, respectiv, HN1, iar SX2 și SX3 au fost colectate din aceeași zonă de producție. Toate probele au fost identificate ca fiind autentice de Song Pingshun, medic șef de medicină chineză al Institutului Provincial de Control al Drogurilor din Gansu.

Tabelul 1 Informații despre probele de sperma Rehmanniae

2.1 Condiții cromatografice

S-a folosit coloana Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm), acetonitril a fost folosit ca fază mobilă A și soluție de acid formic 0,1% a fost utilizată ca fază mobilă B Condițiile de eluție în gradient au fost: 0-3 min, 1%A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min, 65%A→90%A. Detectare cu lungime de undă variabilă (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). Volumul de injectare a fost de 15 μL de soluție de referință și 20 μL de soluție de probă.

2.2 Pregătirea soluției

2.2.1 Prepararea soluției de referință

Luați cantitățile adecvate din cele cinci substanțe de referință de mai sus, adăugați 70% metanol pentru a prepara o soluție de referință mixtă cu o concentrație de masă de 0,4 mg/mL.

2.2.2 Test solution preparation

Se cântăresc aproximativ 1,0 g de pulbere de Rehmannia (trecută prin sita nr. 2), se cântărește cu precizie, se pune într-un balon conic cu dop, se adaugă cu precizie 25 ml de metanol 70%, se sigilează, se cântărește, se tratează cu ultrasunete (putere 300 W, frecvență 50 kHz) timp de 30 de minute, se lasă să se răcească la temperatura camerei, se cântărește din nou, se completează masa pierdută cu metanol 70%, se filtrează și se ia filtratul pentru a obține.

2.3 Investigarea metodologică

2.3.1 Investigarea specificității

Se ia soluția de referință amestecată la „2.2.1” și soluția de testat (proba SX1) la „2.2.2” și se injectează și se măsoară în conformitate cu condițiile cromatografice de la „2.1”. Rezultatele arată că cromatograma probei de Rehmannia prezintă un vârf cromatografic cu același timp de retenție ca și standardele de referință ale Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A și Verbascoside (vezi Figura 1), indicând faptul că această metodă are o putere puternică. specificitate.

2.3.2 Investigarea relațiilor liniare

Se adaugă metanol 70% la soluția de referință amestecată, se diluează de 5 ori, de 10 ori, de 25 de ori, de 50 de ori, de 100 de ori și, respectiv, de 250 de ori și se injectează și se măsoară conform condițiilor cromatografice de la "2.1". Curbele standard au fost trasate cu concentrația de masă a fiecărei referințe ca axă orizontală (x) și aria corespunzătoare a vârfului cromatografic ca axă verticală (y). Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2, indicând faptul că fiecare componentă are o relație liniară bună în intervalul corespunzător de concentrație de masă.

1.rehmanniozid D; 2. leonuridă; 3. echinacozid; 4. castanozidă A;5. acteozid

Figura 1 Cromatogramele investigației specificității

Tabelul 2 Relația liniară a 5 componente în Semen Rehmanniae

2.3.3 Investigarea de precizie

Luați soluția de testare (proba SX1) la „2.2.2” și efectuați testul de injecție conform condițiilor cromatografice de la „2.1”. Se injectează proba de 6 ori în mod continuu, se înregistrează aria vârfului fiecărei componente și se calculează aria vârfului RSD a rehmannia glutinosa D, glicozida de mușcă, glicozida de echinaceea, glicozida cistanche A și verbascozida din proba de testare să fie 0. 46%, 0,12%, 0,85%, 0,48% și, respectiv, 0,82%, indicând că instrumentul are o precizie bună.

2.3.4 Studiu de repetabilitate

Șase probe din aceeași probă de rădăcină Rehmannia (SX1) au fost preparate în paralel conform metodei din „2.2.2” și injectate și determinate conform condițiilor cromatografice din „2.1”. RSD-urile conținutului de glicozidă D rădăcină de rehmannia, glicozidă de mușcă, glicozidă de echinaceea, glicozidă de cistanche A și verbascozidă din cele șase probe au fost 0,46%, 0,69%, 1,42%, {{ 12}}.48% și, respectiv, 1,58%, indicând că metoda are o repetabilitate bună.

2.3.5 Studiu de stabilitate

Se ia soluția de testat (proba SX1) la „2.2.2” și se injectează și se măsoară conform condițiilor cromatografice la „2.1” la 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}} h, 12 h, 18 h și, respectiv, 24 h. RSD-ul zonelor de vârf ale rehmannia glutinosa D, glicozida mușchiului, echinacozida, glicozida cistanche A și verbascozida a fost de 0,94%, 1.04%, 0,73% , 0,83% și, respectiv, 0,71%, indicând că soluția de testat are o stabilitate bună în 24 de ore.

2.3.6 Rata de recuperare a probei

{{0}}. 5 g de eșantion de rădăcină Rehmannia (SX1) cu conținut cunoscut a 5 componente au fost cântărite cu exactitate într -un balon conic oprit și s -au adăugat 6 porțiuni paralele și s -au adăugat 5 soluții de referință ale anumitor concentrații de concentrații respectiv. Probele au fost preparate conform metodei sub „2.2.2”, iar eșantioanele au fost injectate și măsurate în funcție de condițiile cromatografice din „2.1”. Rata de recuperare a fost calculată, iar rezultatele sunt prezentate în tabelul 3. Rata medie de recuperare a eșantionului a fiecărei componente a fost de 96,5%~ 98,6%, iar RSD a fost de 0,73%~ 1,52%, ceea ce indică faptul că metoda are o precizie bună.