FOXO reglează expresia peptidelor antimicrobiene și promovează fagocitoza hemocitelor din imunitatea antibacteriană a creveților

Abstract

Nevertebratele se bazează pe imunitatea înnăscută, inclusiv pe imunitatea umorală și celulară, pentru a rezista infecțiilor patogene. Studiile anterioare au arătat că factorul de transcripție O (FOXO) participă la răspunsurile imune mucoase ale mamiferelor și la reglarea imună umorală intestinală a nevertebratelor. Cu toate acestea, rămâne necunoscut dacă FOXO este implicat în reglarea imunității sistemice și celulare la nevertebrate. În studiul de față, am identificat un FOXO din creveți (Marsupenaeus japonicus) și am constatat că acesta a fost exprimat la niveluri relativ bazale la creveții normali, dar a fost reglat în mod semnificativ la creveții provocați de Vibrio anguillarum. FOXO a jucat un rol critic în menținerea homeostaziei hemolimfei și microbiotei intestinale prin promovarea expresiei Relish, factorul de transcripție al căii deficienței imune (IMD) pentru exprimarea peptidelor antimicrobiene (AMP) la creveți. De asemenea, am constatat că infecția cu patogen a activat FOXO și a indus translocarea sa nucleară prin reducerea activității AKT serin/treonin kinazei. În nucleu, FOXO activat a reglat direct expresia genelor sale țintă Amp și Relish împotriva infecției bacteriene. În plus, FOXO a fost identificat ca fiind implicat în imunitatea celulară prin promovarea fagocitozei hemocitelor prin reglarea în sens pozitiv a exprimării receptorului fagocitotic C (Src) și a două GTPaze mici, Rab5 și Rab7, care sunt legate de traficul de fagozomi către lizozom. în citoplasmă. Luate împreună, rezultatele noastre au indicat că FOXO își exercită efectele asupra homeostaziei hemolimfei și a microbiotei enterice prin activarea căii IMD la creveții normali și promovând direct sau indirect expresia AMP și sporind fagocitoza hemocitelor împotriva agenților patogeni la creveții infectați cu bacterii. Acest studiu a relevat diferitele funcții ale FOXO în imunitatea antibacteriană a mucoasei (locală) și sistemică a nevertebratelor.

Beneficiile suplimentului cistanche-cum să întărești sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Introducere

Proteinele familiei O (FOXO) cu factor de transcripție forkhead box sunt implicate în diferite procese biologice critice ale organismelor, inclusiv reglarea ciclului celular, repararea ADN-ului deteriorat, imunitatea anticancer și reglarea duratei de viață [1,2]. Mamiferele au patru proteine ​​​​FOXO diferite (FOXO1, FOXO3, FOXO4 și FOXO6); cu toate acestea, nevertebratele au un singur FOXO, care este cunoscut și ca Daf-16 în Caenorhabditis elegans [3]. Activitatea transcripțională a FOXO este reglată de mai multe tipuri de modificări post-translaționale, cum ar fi fosforilarea, acetilarea, metilarea și ubiquitinarea [4]. Aceste modificări afectează translocarea nucleară FOXO sau ieșirea din nucleu și interacțiunea acestuia cu co-represori și co-activatori, care pot promova sau scădea activitatea FOXO și pot media diferitele sale funcții biologice [5,6]. După activare, FOXO participă la multe funcții fiziologice prin reglarea transcripției unei varietăți de gene țintă [7]. FOXO sunt activate de diverși stimuli extracelulari, inclusiv factori de creștere, citokine și hormoni [8]. Semnalele de creștere, cum ar fi insulina sau factorul de creștere asemănător insulinei 1 (IGF-1), interacționează cu receptorii căii insulinei și activează semnalizarea fosfatidilinozitol 3-kinazei (PI3K), conducând la fosforilarea FOXO de către serin/treonin kinaza, protein kinaza B (AKT) [9]. FOXO fosforilat se translocă din nucleu în citosol sau împiedică translocarea acestuia din citosol în nucleu, unde devine ubiquitinat, ducând la degradarea sa de către proteazom [10]. În schimb, în ​​absența semnalelor externe de creștere, calea de semnalizare PI3K-AKT este inactivă, iar FOXO nefosforilat se translocă în nucleu pentru a promova transcripția genei țintă [11]. FOXO participă, de asemenea, la răspunsurile imune înnăscute anti-bacteriene și antivirus ale nevertebratelor [12,13]. Activarea cronică a FOXO în intestinele îmbătrânite ale Drosophila reprimă expresia proteinei de recunoaștere a peptidoglicanilor SC2 (un regulator negativ al căii deficienței imune (IMD)) și rupe homeostazia imună intestinală [14]. FOXO reglează direct genele peptidelor antimicrobiene (AMP) în țesuturile epiteliale ale Drosophila neinfectate ca răspuns la stresul de foame, care este independent de căile imunității înnăscute care răspund la patogeni [15]. Cu toate acestea, infecția cu patogen poate induce, de asemenea, enterocitele FOXO să intre în nucleul din citoplasmă direct în intestinele Drosophila [12]. Reglarea dependentă de FOXO a AMP-urilor apare și în țesuturile epiteliale de mamifere, sugerând că aceasta este conservată evolutiv la animale [16]. Mai multe studii au arătat că FOXO sunt activate de agenți patogeni sau de stimularea citokinelor în răspunsurile imune ale mucoasei [17]. Translocarea lor la nucleu și legarea la promotorii genelor lor țintă este stimulată de calea kinazei proteinei activate de mitogen (MAP) și inhibată de calea PI3K/AKT. Genele țintă ale FOXO includ molecule de semnalizare pro-inflamatorii, molecule de adeziune și receptori de chemokine [17]. Dacă FOXO sunt implicați în răspunsurile imune sistemice împotriva agenților patogeni rămâne neclar. Promovarea exprimării AMP-urilor împotriva agenților patogeni este un mecanism important al imunității înnăscute umorale la nevertebrate [18]. În imunitatea înnăscută la Drosophila, căile Toll și IMD sunt implicate în reglarea expresiei AMP, iar AMP-urile joacă un rol important în eliminarea agenților patogeni invadatori [19-21]. Similar cu imunitatea insectelor, căile Toll, IMD și Janus kinazei (JAK)/semnal și activatorul transcripției (STAT) sunt implicate în reglarea expresiei AMP la crustacee [22,23]. Dacă FOXO poate regla expresia AMP-urilor independent de căile Toll, IMD și JAK/STAT împotriva infecției cu agenți patogeni la crustacee necesită clarificare. Pe lângă imunitatea umorală, nevertebratele se bazează și pe imunitatea celulară pentru a îndeplini funcții de imunitate înnăscută împotriva infecției cu patogeni. Fagocitoza de către hemocite este unul dintre mecanismele importante pentru imunitatea celulară împotriva infecției cu patogeni [24]. Studiile anterioare au descoperit că autofagia mediată de FOXO1-este necesară pentru dezvoltarea celulelor ucigașe naturale (NK) [25]. Mai mult, FOXO este implicat în promovarea fagocitozei bacteriene de către neutrofile [26]. Deși nu există celule imunitare specializate în crustacee, cum ar fi celulele NK sau neutrofilele, hemocitele de creveți pot exercita imunitate sistemică înnăscută împotriva infecției cu bacterii patogene prin fagocitoză [27]. Cu toate acestea, nu este clar dacă FOXO participă la fagocitoza patogenului hemocitelor la creveți. Acvacultura creveților este una dintre industriile cu cea mai rapidă creștere din lume pentru producerea de proteine ​​animale și a adus o contribuție semnificativă la satisfacerea cererii crescute la nivel mondial pentru proteine ​​animale. În prezent, producția globală de creveți este de aproximativ 4,88 milioane de tone, cu o valoare de aproximativ 39 miliarde USD [28]. Cu toate acestea, creșterea unui număr mare de animale împreună are ca rezultat un stres substanțial la animale, care facilitează agenții patogeni, inclusiv bacterii și viruși, multiplicarea și bolile clinice, ceea ce duce la pierderi economice mari pentru industrie [29]. Studiile mecanismelor imunitare ale creveților ar putea oferi noi strategii pentru prevenirea și controlul bolilor [30]. În studiul de față, am identificat un FOXO în creveții kuruma (Marsupenaeus japonicus). După expresia Foxo, urmată de provocarea Vibrio anguillarum, am constatat că capacitatea de eliminare a bacteriilor și rata de supraviețuire a creveților au scăzut semnificativ. Studiile suplimentare au indicat că FOXO a promovat expresia AMP-urilor direct sau indirect și a îmbunătățit fagocitoza bacteriilor din creveți. Au fost analizate posibilele mecanisme ale efectelor FOXO împotriva infecției cu agenți patogeni la creveți.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Rezultate

FOXO este exprimat la niveluri bazale la creveții necontestați și este suprareglat la creveții provocați cu V. anguillarum

Din secvențierea transcriptomului hemocitelor de M. japonicus, am obținut secvența de ADNc de lungime completă a lui Foxo (număr de acces GenBank: MW080526). Comparația domeniului a arătat că proteina FOXO prezisă are un domeniu Forkhead (FH), care este similar cu Homosapiens FOXO, inclusiv FOXO1, FOXO3, FOXO4 și FOXO6 și are o fosforilare AKT similară (Fig S1A). Rezultatele analizei filogenetice au arătat că FOXO au fost împărțiți în două grupuri, inclusiv FOXO vertebrate și nevertebrate, iar creveții FOXO a fost grupat în ramura de nevertebrate din arborele filogenetic (S1B Fig). Similar cu FOXO-urile umane [31], creveții FOXO au site-uri de modificare a fosforilării extracelulare ale kinazei reglate (ERK) și site-uri de modificare a acetilării CREB Binding Protein (CBP), dar nu are situri de modificare a deacetilarii sir tuin 1 (SIRT1) și N-terminal c-JUN situsuri de modificare a fosforilării kinazei (JNK) (S2 Fig). Anticorpii policlonali care recunosc creveții FOXO au fost preparați folosind domeniul FH recombinant al FOXO exprimat în Escherichia coli (Fig 1A). Analiza distribuției tisulare a FOXO la nivelurile de ARNm și proteine ​​a arătat că acesta a fost exprimat în toate țesuturile testate (Fig 1B). Cursul de timp al expresiei FOXO în hemocite și intestine ale creveților provocați de V. anguillarum a fost analizat utilizând qPCR și Western blotting. Rezultatele au arătat că FOXO a fost reglat în sus în hemocite și intestine la nivel de ARNm (Fig 1C și 1D) și la nivel de proteine ​​(Fig 1E și 1F). Aceste rezultate au sugerat că FOXO este implicat în răspunsul la infecția cu V. anguillarum și ne-au determinat să explorăm funcția FOXO în imunitatea creveților.

FOXO participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și microflorei intestinale la creveții sănătoși

Pentru a explora funcția FOXO în homeostazia hemolimfei și microflorei intestinale la creveți, a fost efectuată interferența ARN și a fost analizată încărcătura bacteriană. Rezultatele au arătat că expresia Foxo a scăzut semnificativ la creveții Foxo-ARNi (Fig 2A și 2B). Efectele în afara țintă ale Foxo ARNi au fost, de asemenea, analizate prin detectarea expresiei altor gene ale familiei Fox (inclusiv Foxk2 și Foxn3). Rezultatele au arătat că distrugerea lui Foxo nu a scăzut nivelurile de expresie ale Foxk2 sau Foxn3 (S3A-S3C Fig). Folosind teste de imunocitochimie western blotting și fluorescente, am observat în continuare distribuția subcelulară a FOXO în intestine și hemocite ale creveților provocați de bacterii după tăcere Foxo. Rezultatele au arătat că, în comparație cu grupul dsGfp, nivelul FOXO din nucleu a scăzut semnificativ la creveții Foxo-RNAi, chiar dacă creveții au fost infectați cu V. anguillarum (Figurile S3D-S4E). Toate rezultatele de mai sus au sugerat că testul nostru Foxo ARNi ar putea reduce în mod specific Foxo în hemocite și intestine (inclusiv în citoplasmă și nucleu). Apoi, am analizat încărcătura bacteriană din hemolimfă și intestine după doborârea Foxo la creveți în condiții normale (fără provocare bacteriană). Rezultatele au arătat că numărul de bacterii din hemolimfă și intestine a crescut semnificativ după ce expresia Foxo a fost doborâtă cu succes (Fig 2C și 2D). Am analizat în continuare rata de supraviețuire a creveților Foxo-RNAi fără provocare bacteriană, iar rezultatele au arătat că rata de supraviețuire a creveților Foxo-knockdown a scăzut semnificativ în comparație cu cea a controlului (Fig 2E). Pentru a verifica în continuare aceste rezultate, am analizat rata de supraviețuire a creveților Foxo-RNAi tratați cu antibiotice, iar rezultatele au arătat că, în comparație cu grupul dsGfp, rata de supraviețuire a creveților fără germeni nu a scăzut semnificativ (Fig 2F). Toate rezultatele au sugerat că FOXO joacă un rol în homeostazia microbiotei in vivo (inclusiv hemolimfa și microbiota enterică) la creveți în condiții normale.

beneficii supliment cistanche-crește imunitatea

FOXO participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și microflorei intestinale prin promovarea expresiei Relish și Amp la creveții sănătoși

Studiile anterioare demonstrează că creveții sănătoși conțin un număr scăzut, dar stabil, de bacterii în hemolimfa circulantă și cantități mari, deși constante, de bacterii în tractul gastrointestinal și efectori imunitari, cum ar fi peptidele antimicrobiene (AMP) reglate de factorul nuclear kappa B (NF). Calea -κB și speciile reactive de oxigen (ROS) reglate de calea duală oxidază (DUOX), joacă un rol esențial în hemolimfa homeostaziei și microbiota intestinală [32-34]. Pentru a explora mecanismul implicării FOXO în reglarea homeostaziei hemolimfei și microflorei intestinale în condiții normale, am detectat mai întâi distribuția subcelulară a FOXO în hemocite și intestine în condiții normale. Rezultatele au arătat un semnal slab de FOXO în nucleele hemocitelor de creveți și a celulelor intestinale în condiții normale (Fig. 3A și 3B), sugerând că puțin FOXO a fost activat de microbiota in vivo la creveți în condiții normale. Expresia AMP este reglată de calea IMD în intestinele Drosophila [35]. Prin urmare, am presupus că factorul de transcripție Relish ar putea fi o genă țintă a FOXO. Am detectat expresia ARNm a lui Relish, factorul de transcripție al căii IMD, în hemocitele și intestinele de creveți după distrugerea lui Foxo. Rezultatele au arătat că expresia Relish a scăzut semnificativ la creveții Foxo-knockdown (Fig 3C și 3D), iar rezultate similare au fost obținute la nivel de proteine ​​(Fig 3E și 3E'). Rezultatele au sugerat că FOXO ar putea promova expresia Relish și ar putea activa calea IMD. Pentru a confirma că FOXO participă la homeostazia hemolimfei și a tractului gastrointestinal prin semnalizarea IMD, au fost obținuți creveți fără germeni (Fig 3F) și au fost detectate activarea RELISH și expresia AMP. În comparație cu cea din control, cantitatea de FOXO și RELISH din nucleele celulelor intestinale și ale hemocitelor a scăzut semnificativ (Fig 3G și 3H). Între timp, expresia AMP-urilor, inclusiv a crustinelor (CrusI-2 la 5) și a factorilor anti-lipopolizaharidici (Alf A1, B1, C1, D1 și E1), eventual reglați de FOXO și/sau RELISH, a fost testată în germen. creveți liberi, iar rezultatele au arătat că expresia CrusI-3, Alf-B1 și Alf-C1 a scăzut semnificativ în hemocite și intestine ale creveților (Fig 3I și 3J). Având în vedere că expresia Alf-B1 și Alf C1 a fost reglată de calea IMD [36], aceste rezultate au sugerat că FOXO participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și a tractului gastrointestinal în condiții normale prin calea IMD pentru a promova expresia AMP-uri.

Fig 1. FOXO a fost supraregulat la creveții provocați de V. anguillarum. (A) Expresia recombinantă a domeniului FH al FOXO în E. coli și western blot pentru a detecta FOXO folosind anticorpi policlonali împotriva FOXO preparați la iepuri. Banda 1, proteinele totale ale E. coli cu Foxo-pGEX4T-1. Banda 2, proteinele totale ale bacteriilor după inducerea IPTG. Banda 3, FOXO recombinant purificat. Banda 4, FOXO în intestinele creveților netrați a fost detectată folosind Western blot. M, Markeri de masă moleculară proteică. (B) Distribuția tisulară a Foxo la niveluri de ARNm (panoul superior) și proteine ​​(panoul inferior) a fost detectată prin RT-PCR și, respectiv, western blot. ACTB este abrevierea lui -actin. (C, D) Modelele de expresie ARNm ale Foxo în hemocite (C) și intestine (D) au fost analizate prin qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. (E, F) Modelele de exprimare a proteinelor FOXO în hemocite (E) și intestine (F) au fost detectate prin western blot. Rezultatele analizei statistice a trei replici au fost prezentate în panourile inferioare. Benzile de pe Western blot au fost digitalizate folosind software-ul ImageJ prin scanarea benzilor din trei repetări independente. Nivelurile relative de expresie ale FOXO/-actină au fost exprimate ca medie ± SD, iar valoarea creveților martor a fost stabilită ca una. Barele de eroare din figură indică SD-uri (trei replici).

FOXO este activat la creveți prin provocarea V. anguillarum și participă la eliminarea patogenului hemolimfei și intestinelor.

Se raportează că FOXO poate fi activat prin stimulare bacteriană sau cu citokine și este translocat în nucleu pentru a regla expresia anumitor gene țintă la mamifere [17]. Pentru a detecta dacă FOXO a fost activat în creveții provocați de bacterii, distribuția subcelulară a FOXO în intestinele creveților a fost analizată folosind Western blot. Rezultatele au arătat că cantitatea de FOXO din citoplasma celulelor intestinale a scăzut treptat de la 2 la 4 ore după provocarea cu V. anguillarum (Fig 4A). În schimb, cantitatea de FOXO din nucleul celulelor intestinale a crescut semnificativ după infectarea cu V. anguillarum (Fig 4B). Pentru a analiza rolul FOXO în imunitatea sistemică, a fost utilizat un test imunocitochimic fluorescent pentru a observa translocarea nucleară a FOXO în hemocitele de creveți la 2 ore după V. stimularea anuală a larumului. Am descoperit că translocarea FOXO indusă de provocarea bacteriană în nucleu a crescut semnificativ, dar nu a existat o schimbare evidentă în creveții provocați de PBS (Fig 4C și 4C'). Pentru a explora dacă FOXO translocat nuclear este implicat în eliminarea patogenului, am analizat încărcătura bacteriană din hemolimfă și intestine la creveții Foxo-knockdown la 6 ore după provocarea bacteriană. Am descoperit că, după doborârea lui Foxo, încărcarea bacteriilor din hemolimfă și intestine a crescut semnificativ în comparație cu cea din grupurile de control (Fig 4D). Mai mult, rata de supraviețuire a creveților Foxo-knockdown infectați cu V. anguillarum a scăzut semnificativ în comparație cu cea a martorului (Fig 4E). Aceste rezultate au indicat că FOXO a fost activat în celulele enterice și hemocite și au sugerat că FOXO participă la răspunsurile imune locale și sistemice împotriva infecției bacteriene.

Fig 2. FOXO participă la răspunsurile imune antibacteriene intestinale (locale) și sistemice. (A, B) Eficiența Foxo-ARNi în hemocite (A) și intestine (B) de creveți, determinată folosind qPCR (A) și Western blotting (B). Analiza datei qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. Barele de eroare arată SD-uri. (C) Detectarea bacteriilor hemolimfe ale creveților Foxo-knockdown prin cultură solidă LB (trei repetări); Injecția dsGfp a fost utilizată ca control. Raportul de diluare a fost 1:10. (D). Numărul de bacterii din hemolimfă și intestine în creveții Foxo knockdown și creveții cu injecție dsGfp fără provocare bacteriană. (E). Rata de supraviețuire a creveților Foxo-RNAi fără provocare bacteriană. Injecția dsGfp a fost utilizată ca control. (F). Rata de supraviețuire a creveților Foxo-RNAi tratați cu antibiotice. Injecția dsGfp a fost utilizată ca control. Normal: creveți de tip sălbatic netratați cu antibiotice.

Fig 3. O cantitate bazală de FOXO se translocă în nucleele hemocitelor și celulelor intestinale promovează expresia Relish și activează ulterior calea IMD pentru a regla homeostazia hemolimfei și microbiotei intestinale în condiții normale. (A) Imunocitochimia a fost utilizată pentru a detecta distribuția subcelulară a FOXO în hemocitele creveților normali. Bară de scară=20 μm. Cy: Citoplasmă; Nu: Nucleu. (B) Western blotting a fost utilizat pentru a detecta distribuția subcelulară a FOXO în celulele intestinului de la creveți normali și creveți infectați cu V. anguillarum. (C) Expresia Relish la nivel de ARNm a fost detectată în hemocitele de creveți după distrugerea Foxo prin qPCR folosind expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. (D) Expresia Relish la nivelul ARNm în intestinele creveților după distrugerea Foxo a fost detectată prin qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef -1 ca gene endogene de control. (E) Nivelul RELISH a fost detectat folosind Western blotting la creveți după doborârea lui Foxo. (E') Trei replici ale panoului E au fost digitalizate folosind software-ul ImageJ. (F) Încărcătura bacteriană a hemolimfei și a intestinelor la creveți la 24 de ore după tratamentul cu antibiotice. (G) FOXO în nucleu a fost detectat utilizând western blot în hemocite și intestine ale creveților la 24 de ore după tratamentul cu antibiotice. (H) RELISH în nucleu a fost detectat folosind western blot în hemocite și intestine de creveți la 24 de ore după tratamentul cu antibiotice. (I, J) Expresia Amps în hemocite (I) și intestine (J) ale creveților fără germeni a fost determinată prin qPCR utilizând -actina și Ef-1 ca gene de referință interne. Ca martor a fost folosit creveți normali (injecție cu H2O).

Studiile anterioare au indicat că activitatea transcripțională FOXO este reglată de modificarea fosforilării și că serină/treonin kinaza AKT reglează activitatea factorilor de transcripție Forkhead prin fosforilarea acestora și inhibarea translocației lor neclare [9,37]. Pentru a investiga dacă creșterea FOXO în nucleu după infecția cu bacterii patogene este afectată de AKT, am detectat mai întâi conținutul de FOXO în citoplasmă și nucleu prin western blot după distrugerea Akt de creveți. Rezultatele au arătat că cantitatea de FOXO din nucleul hemocitelor și al celulelor intestinale a crescut semnificativ după distrugerea expresiei Akt (Fig 5A și 5B) la creveți la 2 ore după infectarea cu V. anguillarum (Fig 5C și 5C'). Pentru a verifica rezultatele experimentale, am folosit și un test de imunocitochimie pentru a observa distribuția subcelulară a FOXO în hemocitele de creveți după distrugerea Akt. Rezultatele au arătat că FOXO a crescut semnificativ în nucleul hemocitelor atunci când Akt a doborât 2 ore după infecția cu V. anguillarum (Fig 5D și 5D'). Pentru a explora dacă infecția cu patogen afectează activitatea AKT, am detectat modificarea fosforilării AKT după infecția cu patogen utilizând un anticorp uman p-AKT (Ser473) (locul de fosforilare al AKT de creveți este Ser486) și am constatat că nivelul de AKT fosforilat a scăzut semnificativ în hemocite și intestine ale creveților după 30 de minute de infecție cu V. anguillarum (Fig 5E și 5F). Aceste rezultate au sugerat că infecția cu patogen poate reduce nivelul AKT fosforilat, care inhibă activitatea enzimatică și scade capacitatea AKT de a fosforila FOXO. FOXO nefosforilat intră în nucleu și induce expresia genelor sale țintă. figura indică SD-uri.

extract de cistanche

Infecția cu patogen scade activitatea AKT și induce translocarea nucleară FOXO

FOXO exercită apărare imună împotriva bacteriilor invadatoare prin reglarea expresiei peptidelor antimicrobiene la creveții infectați cu bacterii

Pentru a explora mecanismul prin care FOXO afectează răspunsul împotriva infecției bacteriene la creveți, am identificat mai întâi genele efectoare imune reglate de FOXO. După distrugerea cu succes a Foxo în hemocite și intestine ale creveților cu sau fără provocare cu V. anguillarum, nivelurile de expresie ale CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 și Alf-E1 au scăzut semnificativ în comparație cu creveții tăiați. cu cei din grupul de control (Fig 6A și 6B). Pentru a verifica în continuare rezultatele, am detectat, de asemenea, expresia a patru AMP-uri după distrugerea Akt. Rezultatele au arătat că expresia celor patru AMP a crescut semnificativ la 6 ore după infecția cu V. anguil larum în comparație cu cea din grupul de control (Fig 6C și 6D). În comparație cu AMP-urile suprareglate (inclusiv Alf-B1 și Alf-C1) în condiții normale (Fig. 3I și 3J), gena suplimentară a AMP-urilor (CrusI-3, Alf-E1) a fost, de asemenea, suprareglată la creveții infectați cu V. anguillarum (Fig. 6A și 6B). Studiul nostru anterior a indicat că RELISH a promovat expresia Alf-B1 și Alf-C1 în creveți [36]. Aceste rezultate indică faptul că FOXO ar putea regla în mod direct expresia AMP, cum ar fi CrusI-3 și Alf-E1, independent de calea de semnalizare IMD. Pentru a confirma ipoteza, a fost efectuat un test ChIP pentru a detecta dacă FOXO s-ar putea lega de promotorul Alf-E1. Secvența promotor a Alf-E1 a fost obținută (S4 Fig) și au fost prezise situsurile de legare FOXO (Fig 6E). Rezultatul ChIP a arătat că FOXO s-ar putea lega de promotorul Alf-E1 (Fig 6F). Aceste rezultate au sugerat că FOXO participă și la imunitatea antibacteriană prin reglarea directă a expresiei AMP-urilor la creveți.

Fig 4. FOXO translocat în nucleul creveților provocați de V. anguillarum. (A, B) Modelele de distribuție FOXO în citoplasmă (A) și nucleul (B) ale celulelor intestinale ale creveților provocate de bacterii, așa cum au fost analizate utilizând western blot (panourile inferioare ale A și B). Benzile de western blot au fost digitalizate folosind software-ul ImageJ prin scanarea benzilor din trei repetări. Nivelurile relative de expresie ale FOXO/-actină sau FOXO/Histone 3 au fost exprimate ca medie ± SD, iar valoarea creveților martor a fost stabilită ca una. (C) Translocarea nucleară a FOXO în hemocite de creveți la 2 ore după V. anguillarum provocarea a fost detectată folosind teste imunocitochimice fluorescente. Injecția cu PBS a fost utilizată ca martor. Bară de scară=20 μm. (C') Analiza statistică a panoului C Colocalizarea nucleelor ​​colorate cu FOXO și DAPI în hemocite a fost analizată prin software-ul WCIF ImageJ. (D) Numărul bacterian din hemolimfă și intestine ale creveților Foxo-knockdown a urmat injecția cu V. anguillarum; Injecția dsGfp în creveți după injectarea bacteriană a fost utilizată ca martor. (E) Rata de supraviețuire a creveților Foxo-ARNi infectați cu V. anguillarum. Injecția dsGfp a fost utilizată ca control.

FOXO promovează fagocitoza hemocitelor împotriva bacteriilor prin promovarea expresiei SRC

Studiile anterioare au raportat că FOXO interacționează direct cu regiunile promotoare ale CXCR2 și CD11b pentru a regla fagocitoza neutrofilelor la mamifere [26]. Pentru a testa dacă FOXO este asociat cu fagocitoza hemocitelor în imunitatea antibacteriană a creveților, am examinat rata fagocitară după interferența cu Foxo folosind diferite metode. După distrugerea Foxo, rata fagocitară și indicele fagocitar al grupului Foxo-knockdown au fost semnificativ mai mici decât cele ale grupului de control (dsGfp) (Fig 7A și 7A'). Am folosit, de asemenea, citometria în flux pentru a cuantifica rata fagocitară a hemocitelor după tăcere a lui Foxo. Rezultatele au arătat că rata de citoză fagică a grupului Foxo-ARNi a scăzut, de asemenea, semnificativ în comparație cu cea a grupului dsGfp (Fig 7B și 7B'). Pentru a valida în continuare aceste rezultate, am examinat, de asemenea, rata fagocitară după distrugerea Akt. Rezultatele au arătat că, în comparație cu cele ale grupului de control, rata fagocitară și indicele fagocitar au crescut semnificativ (Fig 7C și 7C'). Aceste rezultate au sugerat că FOXO promovează fagocitoza hemocitelor la creveți. Pentru a explora modul în care FOXO îmbunătățește fagocitoza hemocitelor la creveți, am detectat expresia genelor raportate anterior implicate în fagocitoza creveților. Receptorii Scavenger clasa B (SRB) și clasa C (SRC) sunt raportate a fi implicate în fagocitoza hemocitelor [38,39]. Am descoperit că nivelul de expresie a ARNm al Src, mai degrabă decât al Srb, a scăzut semnificativ după tăcere Foxo în hemocite și intestine (Fig. 7D și 7E), în timp ce expresia Src a crescut semnificativ după distrugerea Akt în creveți (Fig 7F). Rezultate similare au fost obținute la nivel de proteine ​​(Fig 7G și 7G'). Aceste rezultate au sugerat că FOXO promovează fagocitoza hemocitelor a agenților patogeni la creveți prin promovarea expresiei SRC.

FOXO promovează exprimarea RAB5 și RAB7 în timpul fagocitozei la creveți

Studiile anterioare au arătat că GTPazele mici, RAB5 și RAB7, sunt regulatorii cheie ai transportului veziculelor nou endocitate către endozomii timpurii și tardivi [40]. RAB5 este un regulator cheie al evenimentelor inițiale de fuziune și este un marker al endozomilor timpurii [41,42]. RAB7 este necesar pentru fuziunea tardivă fagozom-lizozom și este un marker al endozomilor tardivi [43]. Pentru a explora dacă RAB5 și RAB7 sunt implicate în eliminarea agenților patogeni la creveți, am analizat mai întâi modelele de expresie ale Rab5 și Rab7 și am constatat că cele două GTPaze mici au fost reglate în creștere la creveții provocați cu bacterii (Fig S5A-S5D). Am analizat în continuare rata de supraviețuire a creveților Rab{5-ARNi și Rab{7-ARNi după provocarea bacteriană, iar rezultatele au arătat că rata de supraviețuire a creveților knockdown Rab5 și Rab7 a scăzut semnificativ în comparație cu cea a martorului ( S5E și S5F Fig). Aceste rezultate au sugerat că RAB5 și RAB7 joacă funcții importante în rezistența împotriva agenților patogeni bacterieni. Pentru a explora dacă RAB5 și RAB7 sunt implicate în fagocitoza mediată de FOXO, am examinat nivelurile de expresie ARNm ale Rab5 și Rab7 după interferența cu expresia Foxo la creveți. Rezultatele au arătat că nivelurile de expresie ale Rab5 și Rab7 au scăzut semnificativ în hemocite și intestine (Figurile 8A și S6A). în timp ce expresia Rab5 și Rab7 a crescut semnificativ după distrugerea Akt la creveți (Fig 8B). Pentru a confirma în continuare rezultatele de mai sus, au fost detectate și nivelurile de proteine ​​ale RAB5 și RAB7 la creveții Foxo sau Akt knockdown. În comparație cu grupul de injectare dsGfp, nivelurile RAB5 și RAB7 au scăzut, de asemenea, semnificativ în hemocite și intestine la creveții Foxo-knockdown, dar au crescut semnificativ la creveții Akt-knockdown la 2 ore după stimularea de către V. anguillarum (Figurile 8C-8D'; S6B și S6B'). Aceste rezultate au sugerat că RAB5 și RAB7 participă la citoza fagică mediată de FOXO a hemocitelor la creveți. Am detectat în continuare că RAB5 și RAB7 au fost co-localizate cu V. anguillarum în hemocitele de creveți (Fig 9). Luate împreună, rezultatele au sugerat că RAB5 și RAB7 sunt implicate în fagocitoza mediată de FOXO la creveți.

Fig 5. Infecția cu patogeni a scăzut activitatea AKT, ceea ce a promovat translocarea nucleară FOXO în hemocite și celule enterice ale creveților. (A, B) Eficiența Akt-ARNi în hemocite și intestine de creveți, determinată de qPCR folosind expresia medie geometrică a -actinei și Ef{3} ca gene de control endogene (A) și Western blotting (B). (C) Cantitatea de FOXO din citoplasmă și nucleul intestinelor de la creveții Akt-knockdown a fost analizată prin western blot. dsGfp a fost folosit ca control. (C') Analiza statistică a panoului (C). Software-ul ImageJ a fost folosit pentru a digitaliza benzile prin scanarea imaginilor cu trei repeturi. (D) Translocarea nucleară a FOXO în hemocite ale creveților Akt-knockdown a fost detectată la 2 ore după provocarea cu V. anguillarum folosind un test imunocitochimic fluorescent. dsGfp a fost folosit ca control. Bară de scară=20 μm. (D') Analiza statistică a (D). Software-ul WCIF ImageJ a fost utilizat pentru a analiza co-localizarea prin raportul intensității fluorescenței a nucleului anti-FOXO (verde) și colorat cu DAPI (albastru) în hemocite după fixarea valorii expunerii. (E, F) Modificarea conținutului de AKT fosforilat (p-AKT) în hemocite (E) și intestine (F) ale creveților provocați de V. anguillarum. Panourile inferioare sunt cifre digitalizate ale (E) și (F) bazate pe benzi de western blot și, respectiv, analiză statistică.

ceai de Cistanche

Discuţie

FOXO, ca factor de transcripție foarte important, participă la multe funcții fiziologice și metabolice [44,45]. În studiul de față, am identificat un FOXO din creveți (M. japonicus) și am constatat că acesta participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și a microbiotei enterice prin reglarea expresiei AMP în condiții normale. FOXO poate fi activat prin infecția bacteriană la creveți și translocat în nucleu, unde reglează direct și indirect (prin calea IMD) expresia AMP-urilor. FOXO a reglat expresia genelor legate de fagocitoză, cum ar fi SRC și GTPazele mici, RAB5 și RAB7, pentru a promova fagocitoza hemocitelor împotriva agenților patogeni. Prin urmare, creveții FOXO joacă roluri diferite în răspunsurile imune sistemice și locale (enterice) împotriva agenților patogeni (Fig 10). În comparație cu FOXO-urile umane, creveții FOXO au o secvență de aminoacizi relativ conservată și situsuri de fosforilare AKT; cu toate acestea, al doilea loc de fosforilare AKT al creveților FOXO este treonina în loc de serină. Fosforilarea AKT a FOXO controlează transportul nuclear și citoplasmatic al FOXO [9]. În acest studiu, am descoperit că AKT este legat de controlul intrării nucleare a lui FOXO. După infecția cu V. anguillarum, nivelul de AKT fosforilat a fost redus semnificativ, ceea ce a indicat că activitatea AKT a fost scăzută la creveții infectați cu agenți patogeni, crescând astfel retenția nucleară sau translocarea nucleară a FOXO și, ulterior, inducerea expresiei genelor țintă, precum Relish și Amp, pentru a rezista împotriva infecției cu patogeni. Studiile anterioare au descoperit că FOXO participă la homeostazia microflorei intestinale a Drosophila prin reprimarea expresiei proteinei de recunoaștere a peptidoglicanilor SC2 (regulatorul negativ al căii IMD) pentru a activa calea pentru expresia AMP [14]. RELISH a fost raportat ca o genă țintă cheie a FOXO în controlul toleranței la hipoxie la Drosophila [46]. Ca și alte animale, tractul gastrointestinal al creveților conține microbiotă relativ ridicată și constantă. Dovezile tot mai mari dezvăluie, de asemenea, că hemolimfa unor nevertebrate acvatice sănătoase, inclusiv creveții, găzduiește și cantități stabile de bacterii [47]. Studiul nostru anterior a constatat că o lectină de tip C participă la reglarea homeostaziei microbiotei hemolimfei prin menținerea expresiei AMP-urilor [34], dar nu știm ce căi de semnal sunt implicate în reglarea expresiei AMP. Aici, rezultatele noastre au sugerat că FOXO este implicat în reglarea homeostaziei hemolimfei și microflorei enterice prin semnalizarea IMD în condiții normale. La creveții neinfectați, distrugerea Foxo a dus la o expresie semnificativ redusă a Relish, iar rata de supraviețuire a creveților a scăzut semnificativ, chiar și fără infecție bacteriană. De asemenea, am găsit o cantitate mică de FOXO în nucleul celulelor normale de creveți. Prin urmare, credem că FOXO participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și florei enterice în condiții normale prin promovarea expresiei Relish și, ulterior, îmbunătățirea expresiei AMP prin calea IMD. Aceste rezultate au sugerat că FOXO participă la imunitatea locală și sistemică pentru a promova homeostazia microbiotă a hemolimfei și a tractului gastrointestinal la creveți. Imunitatea umorală joacă un rol critic în rezistența la infecția cu patogeni în rate inverse prin producerea unei baterii de AMP [21,48]. Răspunsul umoral cuprinde sinteza și secreția inductibile de AMP, care sunt eliberate în hemolimfă ca răspuns sistemic sau eliberate pe suprafața epidermică sau în cavitatea tractului gastrointestinal ca răspuns local [19]. Expresia AMP este reglată în principal de căile de semnalizare Toll/Dif și IMD/Relish la muștele de fructe [49]. În prezent, la creveți au fost identificate mai multe familii de AMP, inclusiv crustine, factori anti-lipopolizaharidici (Alfs) și penaeidine [50]. Prezentul studiu a arătat că FOXO poate regla direct sau indirect (prin semnalizare IMD/Relish) expresia AMP-urilor, inclusiv CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 și Alf-E1. Ne-am gândit că activarea scăzută a FOXO în hemocite și intestine ale creveților în condiții normale ar putea regla gena țintă cheie a Foxo, adică Relish, pentru a menține homeostazia microbiotei in vivo. În timpul infecției, agenții patogeni invadatori activează FOXO, cea mai mare parte fiind translocată în nucleu, unde reglează mai multe gene țintă, inclusiv unele AMP, cum ar fi Alf-E1 și CrusI-3, în plus față de Relish. Luați împreună, FOXO participă la reglarea homeostaziei hemolimfei și microbiotei intestinale la creveții sănătoși prin activarea la nivel bazal a semnalizării IMD în hemolimfe și tractul gastrointestinal. Infecția cu patogen activează FOXO prin scăderea activității AKT și promovează expresia AMP-urilor direct și indirect în imunitatea sistemică și imunitatea locală (intestinală). Fagocitoza este un fenomen mediat de receptor, dependent de actină și ATP, care este declanșat de legarea particulelor sau agenților patogeni de receptori specifici din citomembrană și reprezintă un proces imunitar important prin care gazda se poate proteja de agenți patogeni [24]. GTPazele mici, cum ar fi RAB5 și RAB7, sunt implicate în remodelarea continuă a membranei și în traficul veziculelor în fagocitoză. Studiul nostru anterior a raportat că receptorii scavenger SRB și SRC sunt implicați în fagocitoza hemocitelor ca receptori la creveți [38,39]. În studiul de față, am constatat că după distrugerea lui Foxo, expresia Src a scăzut semnificativ, iar rata de fagocitoză a hemocitelor a scăzut semnificativ, sugerând că Src este o genă țintă a FOXO și că FOXO este implicat în fagocitoza mediată de SRC a bacteriilor patogene. FOXO ar putea promova, de asemenea, expresia a două GTPaze mici, RAB5 și RAB7. Aceste mici GTPaze sunt implicate în transportul secvenţial şi sunt determinanţii cheie ai fagozomilor timpurii şi târzii [51]. Fagozomii migrează de la periferia celulei în regiunea intracelulară, RAB5 fiind înlocuit cu RAB7 în timpul transportului, iar bunurile finale sunt transportate la lizozom pentru degradare [52,53]. De asemenea, am descoperit că RAB5 și RAB7 s-ar putea co-localiza cu agenții patogeni din hemocite, ceea ce a indicat că agenții patogeni au fost fagocitați de hemocite din creveți trecând prin fagozomi timpurii și târzii, înainte de a fi degradați în cele din urmă în lizozomi. Prin urmare, FOXO este implicat în răspunsul imun celular prin promovarea fagocitozei hemocitelor. În concluzie, rezultatele noastre indică faptul că FOXO nu numai că participă la reglarea homeostaziei microbiotei în condiții normale, ci și la eliminarea bacteriilor patogene din creveții infectați prin promovarea expresiei AMP-urilor și fagocitozei hemocitelor.

Fig 6. FOXO își îndeplinește rolurile antibacteriene la creveți prin reglarea expresiei AMP-urilor. (A, B) Expresia Amps în hemocite (A) și intestine (B) ale creveților Foxo-knockdown, determinată prin qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef{3}} ca gene de control endogene; Injecția dsGfp în creveți a fost utilizată ca martor. Datele au fost analizate statistic folosind testul Mann-Whiteny U. (C, D) Expresia Amps în hemocite (C) și intestine (D) ale creveților knockdown Akt a fost analizată prin qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene; Injecția dsGfp în creveți a fost utilizată ca martor. Diferențele semnificative au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional. (E) Diagrama schematică a situsurilor de legare prezise ale FOXO pe promotorul Alf-E1. (F) ChIP și RT-PCR au fost folosite pentru a detecta legarea FOXO la secvența promotorului Alf-E1 folosind primeri (Alf-E1-F și Alf-E{1-R, Tabelul 1). RT-PCR a fost, de asemenea, utilizat pentru a amplifica regiunea de codificare a Alf-E1 cu primeri RT-PCR (Alf-E1-RT-F și Alf-E{1-RT-R. Tabelul 1) utilizând ChIP a obţinut ca şablon ADN. Anticorpul IgG a fost utilizat ca control și fragmentul normal amplificat de ADN genomic a fost utilizat pentru a confirma banda țintă.

Fig 7. FOXO îmbunătățește fagocitoza hemocitelor a agenților patogeni la creveți prin promovarea expresiei SRC. (A) Fagocitoza hemocitară a V. anguillarum observată folosind un test imunocitochimic fluorescent la microscop cu fluorescență. V. anguillarum a fost marcat cu FITC (verde) iar nucleii celulari au fost colorați cu DAPI (albastru). Săgeata roșie indică hemocitele fagocitare. Bară de scară=20 μm. (A') Analiza statistică a ratei fagocitare și a indicelui fagocitar la creveții Foxo-knockdown. Grupul de injecție dsGfp a fost utilizat ca martor. Cinci sute de hemocite au fost numărate la microscopul cu fluorescență în fiecare experiment. Datele au fost analizate statistic folosind testul t Student. (B) Fagocitoza bacteriană de către hemocite analizată folosind citometrie în flux. Hemocitele fagocitate care conțin bacterii (R2) au fost separate de hemocitele nefagocitate (R3) pe baza semnalului de fluorescență al bacteriilor marcate din hemocite utilizând software-ul IDEAS Application v6.0. (B') Rata fagocitară a hemocitelor pe baza datelor de citometrie în flux. Au fost numărate trei mii de hemocite pentru fiecare analiză și au fost efectuate trei repetări. Grupul dsGfp a fost folosit ca control. (C) Fagocitoza hemocitelor de V. anguillarum la creveții knockdown Akt observați la microscopul cu fluorescență. Bară de scară=10 μm. (C') Analiza statistică a ratei fagocitare și a indicelui fagocitar pe baza datelor din panoul (C). (D) Nivelul de expresie a ARNm al Srb și Src în hemocite de la creveții Foxo knockdown analizat prin qPCR utilizând expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. Injecția dsGfp a fost utilizată ca control. (E) Expresia ARNm a Srb și Src în intestinele creveților Foxo-ARNi analizate prin qPCR folosind expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. (F) Expresia ARNm a Src în hemocite ale creveților Akt-ARNi analizată prin qPCR folosind expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. (G) Nivelul proteic al SRC în hemocite ale creveților Foxo-ARNi sau Akt-ARNi, așa cum a fost analizat utilizând western blot. injecția dsGfp folosită ca control. (G') Analiza statistică bazată pe datele a trei replici ale panoului (G).

Materiale și metode

Declarație de etică

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu directivele naționale ale Chinei (GB 14922.2–2011 și GB 14925–2010). Experimentele la iepure pentru prepararea anticorpilor din studiu au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și bunăstarea animalelor de la Shandong University School of Life Sciences (SYDWLL-2021-54). Aprobarea conform reglementărilor privind utilizarea creveților în studiul nostru nu a fost necesară deoarece cercetarea noastră a folosit un număr limitat de creveți obișnuiți consumați frecvent de comunitatea mai largă.

Animale

Creveții sănătoși (Marsupenaeus japonicus), cântărind aproximativ 6-10 g fiecare, au fost obținuți de pe piața produselor acvatice din Qingdao, provincia Shandong, China. Înainte de experiment, creveții au fost cultivați timp de cel puțin 1 zi în sistemul de cultură de creveți cu apă de mare aerată la 23–25 °C pentru aclimatizarea la noul mediu.

Fig 8. RAB5 și RAB7 sunt implicate în fagocitoza mediată de FOXO a hemocitelor la creveți. (A, B) qPCR a fost utilizat pentru a analiza nivelurile de expresie a ARNm ale Rab5 și Rab7 în hemocitele de creveți Foxo-knockdown (A) și Akt-knockdown shrimp (B) cu și fără infecție bacteriană. qPCR a folosit expresia medie geometrică a -actinei și Ef-1 ca gene de control endogene. (C) Nivelurile de proteine ​​ale RAB5 și RAB7 în hemocite ale creveților Foxo-knockdown la 2 ore după provocarea cu V. anguillarum au fost determinate utilizând Western blot. (C') Analiza statistică bazată pe datele a trei replici ale panoului (C). (D) Nivelurile de proteine ​​ale RAB5 și RAB7 din hemocite ale creveților Akt-knockdown la 2 ore după provocarea cu V. anguillarum au fost determinate folosind Western blotting. (D') Analiza statistică bazată pe datele a trei replici ale panoului (D).

Analiza bioinformatică

Secvența de ADNc de lungime completă a lui Foxo a fost obținută din secvențierea hemocitelor și a transcripției intestinale a M. japonicus (BGI, Shenzhen, China). Cadrul de citire deschis (ORF) al lui Foxo a fost amplificat folosind o pereche de primeri (Foxo-EX-F și Foxo-EX-R; Tabelul 1) pentru confirmarea secvenței. ADNc-ul corespunzător a fost tradus conceptual pentru a obține secvența de proteine ​​dedusă folosind instrumentul ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). Analiza similarității a fost efectuată folosind BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), iar predicția arhitecturii domeniului a fost efectuată folosind SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Un arbore filogenetic de FOXO din diferite specii a fost construit folosind programul MEGA 6.0 [54].

Fig 9. RAB5 și RAB7 co-localizează cu V. anguillarum. Co-localizarea RAB5 și RAB7 cu FITC etichetat-V. anguillarum în hemocite de creveți, așa cum a fost analizat folosind un test imunocitochimic fluorescent. Bacteriile au fost etichetate cu FITC (verde) și injectate în creveți. Hemocitele au fost colectate de la cinci creveți la 30 de minute și 1 oră după injectarea bacteriană și incubate cu anticorpi anti-RAB5 sau anti RAB7. Anticorpul secundar a fost IgG de iepure Alexa-546 (roșu). Nucleii au fost colorați cu DAPI (albastru). Co-localizarea în hemocite este indicată de săgeți albe. Bară de scară=10 μm.

Fig 10. Reprezentarea schematică a implicării FOXO în imunitatea înnăscută locală și sistemică la creveți. (A) În condiții neinfectate, FOXO menține homeostazia hemolimfei și a microbiotei intestinale prin promovarea Relish și, ulterior, expresia AMP. (B) În condiții infectate, fosforilarea AKT este scăzută de infecția cu patogen, ceea ce duce la creșterea conținutului de FOXO în nucleu. FOXO promovează direct expresia Relish și AMP-uri pentru a elimina agenții patogeni invazivi; pe de altă parte, FOXO promovează fagocitoza agenților patogeni prin calea de fagocitoză mediată de SRC.

Provocare bacteriană și recoltare de probe

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) obținut de la Marine College, Universitatea Shandong (Wei hai, China) și acum păstrat în laboratorul nostru. V. anguillarum a fost cultivat peste noapte la 37°C în mediu LB și re-cultivat timp de 4 ore la inoculare 1:100 în a doua zi. Bacteriile în faza de creștere logaritmică au fost colectate prin centrifugare la 5000 × g timp de 5 minute la 4°C și spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl și 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). V. anguillarum resuspendat în soluție salină tamponată cu fosfat pentru provocarea creveților. Aproximativ 2 × 107 unități formatoare de colonii (CFU)/creveți au fost injectate în abdomenul fiecărui creveți folosind o microseringă. Grupul de control a fost injectat cu același volum de PBS. Hemocitele, inima, hepatopancreasul, branhiile, stomacul și intestinele au fost colectate de la cel puțin trei creveți pentru extragerea ARN și a proteinelor. Pentru colectarea hemocitelor, hemolimfa a fost extrasă din sinusul ventral folosind o seringă preîncărcată cu 0,8 ml tampon anticoagulant (10% citrat de sodiu), apoi centrifugata rapid la 700 × g timp de 8 minute la 4 °C pentru izolarea hemocitelor.

Extracția ARN și proteinelor și sinteza ADNc

ARN-ul total a fost extras din hemocite și diferite organe ale creveților folosind TRIzol (ET101, Transgen, Beijing, China). Proteinele din diferite organe au fost extrase folosind tampon de liză pentru testul de radioimunoprecipitare (RIPA) (P0013B, Beyotime, Jiangsu, China). Sinteza ADNc-ului primei catene a fost efectuată utilizând un kit de sinteză ADNc (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canada), urmând instrucțiunile producătorului.

Tabelul 1. Secvențe de primeri utilizați în acest studiu.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canada), urmând instrucțiunile producătorului.

Expresia recombinantă și prepararea anticorpilor

Secvența de ADNc a Foxo a fost amplificată prin reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă (RT-PCR) folosind primeri Foxo-EX-F și Foxo-EX-R (Tabelul 1). Produsele PCR purificate au fost apoi digerate folosind enzime de restricție și ligate în plasmida pGEX-4T{-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, SUA). iar plasmidele construite au fost transformate în celule Escher ichia coli Rosseta (DE3). Expresia proteinei a fost indusă folosind 1 mM izopropil- - D-tio galactopiranozidă la 37°C. Proteinele recombinante au fost supuse cromatografiei de afinitate folosind rășină glutation (GST) (C600031, BBI, Shanghai, China), urmând instrucțiunile producătorului. Antiserurile de iepure împotriva FOXO au fost preparate conform unei metode descrise anterior [55].

Western blot

Proteinele extrase din diferite organe sau hemocite au fost separate folosind electroforeză în gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu 10% (SDS-PAGE). Proteinele din gelurile SDS-PAGE au fost transferate pe o membrană de azotat de celuloză folosind tampon de transfer (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicină, 0,037% mM SDS și 20% etanol) și incubate în lapte degresat 5% sau albumină serică bovină (BSA) 3% în soluție salină tamponată cu Tris (TBS: 150 mM NaCI, 10 mM Tris HCI, pH 8,0) timp de 1 oră cu agitare ușoară la temperatura camerei. Membranele au fost apoi incubate cu antiser primar: Anti-FOXO la o diluție de 1:100, anti-RAB5 la 1:25, anti Rab7 la 1:25, anti-beta actină (ACTB) la 1:250 (preparat în laboratorul nostru). ); Anticorpi policlonali histonă-3 (A2348, ABclonal, Wuhan, China, 1:2500); anticorpi policlonali anti-fosforilați (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, China, 1:500) și agitați ușor peste noapte la 4°C. După spălare de trei ori cu TBST (0,1% Tween-20 adăugat la TBS), membranele au fost incubate cu anticorp secundar (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) sau ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) timp de 3 ore la temperatura camerei cu agitare ușoară. Benzile de proteine ​​imunoreactive au fost dezvoltate folosind o soluție de clorură de albastru de nitrotetrazoliu (A610379, BBI) și sare de P-toluidină (A610072, BBI) în condiții de întuneric sau folosind chemiluminiscență îmbunătățită (ECL). -actina sau Histone-3 au fost folosite de referințăs.

Distribuția tisulară și modelele de expresie la creveții provocați de bacterii

Distribuția tisulară a Foxo/FOXO în hemocite, inimă, branhii, spută, stomac și intestine a fost analizată folosind RT-PCR cu primerii Foxo-F și Foxo-R (Tabelul 1) și prin western blot cu anticorpi anti-FOXO, respectiv. Procedura PCR a constat într-o incubare inițială la 94˚C timp de 3 minute; urmate de 35 de cicluri de 94˚C timp de 30 s, 50˚C timp de 30 s, și 72˚C timp de 30 s; urmat de 72˚C timp de 10 min. Produsele PCR au fost analizate folosind electroforeză pe gel de agaroză (1,5% agaroză). Gena -actină (-actină-F și -actină-R; Tabelul 1) a fost utilizată ca control intern. Modelele de expresie ale Foxo/FOXO la nivelurile de ARN și proteine ​​la creveții provocați cu V. anguillarum au fost analizate utilizând PCR cantitativă în timp real (qPCR) într-un termociclator (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Germania) și prin west ern blot, respectiv. Procedura qPCR a cuprins: 95˚C timp de 10 min; 40 de cicluri la 95˚C timp de 10 s și 60˚C timp de 50 s; și apoi o perioadă de topire de la 65°C la 95°C. Fișierele de expresie ale lui Foxo au fost produse folosind metoda 2-ΔΔCT [56] folosind media geometrică a celor două gene de control intern ale -actinei și Ef-1 pentru normalizare. Eficiența perechii de primeri în qPCR a fost analizată urmând metoda MIQE [57] cu o diluție logaritmică de 10-ori a unui amestec de ADNc pentru a genera o curbă standard liniară.

Izolarea proteinelor nucleare și citoplasmatice

Țesutul intestinal a fost disecat din creveți și spălat în PBS de trei ori. Extracția proteinelor a fost efectuată utilizând un kit de extracție a proteinelor nucleare și citoplasmatice (R0050, Solarbio, Beijing, China) urmând instrucțiunile producătorului. Cel puțin trei creveți au fost utilizați pentru extracția proteinelor pentru a elimina diferențele individuale.

Test de interferență ARN

Pentru a analiza funcția genelor, am efectuat teste de interferență ARN (ARNi). Mai multe perechi de primeri care conțin secvența promotorului T7 (Foxo-RI-F și Foxo-RI-R; Rab5-RI-F și Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F și Rab7 -RI-R; Akt-RI-F și Akt-RI-R. Tabelul 1) au fost concepute pentru a amplifica șabloanele pentru sinteza dsARN. Folosind ARN polimeraza T7 (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și șablonul ADNc, am sintetizat fragmentele de ARNds. Proteina verde fluorescentă dublu catenară dsGfp ARN a servit drept control, care a fost amplificat folosind Gfp-RI-F și Gfp-RI-R (Tabelul 1) ca primeri pentru sinteza dsGfp. Apoi, fragmentele dsARN (50 ug/fiecare) au fost injectate în segmentul abdominal de M. japonicus folosind o microseringă și a fost efectuată o a doua injecție 12 ore mai târziu folosind aceeași doză. Eficiența interferenței ARN a fost analizată utilizând PCR cu transcripție inversă cantitativă în timp real (qRT-PCR, care cuprinde transcrierea inversă a ARN pentru a forma ADNc, care a fost apoi utilizat ca șablon într-un test qPCR) sau Western blotting la 24 de ore după a doua injecție. -actina a fost folosită ca referință internă.

Referințe

1. Calnan DR, Brunet A. Codul FoxO. Oncogene. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Calea de reparare a ADN-ului stimulată de factorul de transcripție FOXO3a prin intermediul proteinei Gadd45. Ştiinţă. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Trăiască FOXO: dezlegarea rolului proteinelor FOXO în îmbătrânire și longevitate. Celulă în vârstă. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Control triplu strat-fosforilare, acetilare și ubiquitinare a proteinelor FOXO. Ciclul celulei. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Reglarea factorilor de transcripție FoxO prin acetilare și interacțiuni proteine-proteine. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Factorii de transcripție FOXO: semnificația și reglarea lor clinică. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Gene care acționează în aval de DAF-16 pentru a influența durata de viață a Caenorhabditis elegans. Natură. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Căile insulinei/IGF-1R, SIRT1 și FOXO-o formă de interacțiune interesantă pentru os și osteosarcom. Endocrinol frontal (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS și colab. Akt promovează supraviețuirea celulară prin fosforilarea și inhibarea unui factor de transcripție forkhead. Celulă. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA și colab. Skp2 inhibă FOX01 în suprimarea tumorii prin degradarea mediată de ubiquitină. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Factorul de transcripție Fork head DAF-16 transduce semnale metabolice și longevitate asemănătoare insulinei la C. elegans. Natură. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Semnalizarea FoxO intestinală este necesară pentru a supraviețui infecției orale la Drosophila. Imunol mucoase. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO reglează interferența ARN în Drosophila și protejează de infecția cu virusul ARN. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 promovează homeostazia imună intestinală pentru a limita disbioza comen sal și a prelungi durata de viață. Celulă. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. Reglarea dependentă de FOXO a homeostaziei imune înnăscute. Natură. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Factorii de transcripție FOXO reglează mecanismele imune înnăscute în celulele epiteliale respiratorii. J Immunol. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. Imunitatea mucoasei și factorii de transcripție FOXO1. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Peptide antimicrobiene: de la nevertebrate la vertebrate. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Imunitatea la Drosophila melanogaster — de la recunoașterea microbiană la fiziologia întregului organism. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Imunitatea înnăscută la Drosophila: o perspectivă evolutivă. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Imunitatea la Drosophila: căi și tipare. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Progrese recente în cercetările privind imunitatea înnăscută a creveților din China. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Legarea domeniului spiralat al lectinei de tip C la receptorul Domeless activează direct calea JAK/STAT în răspunsul imun al creveților la infecția bacteriană. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Fagocitoza: un proces imunobiologic. Imunitate. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ și colab. Autofagia mediată de FoxO1-este necesară pentru dezvoltarea celulelor NK și imunitatea înnăscută. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J și colab. FOXO1 reglează activitatea neutrofilelor induse de bacterii. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lectina de tip C se leagă de beta-integrină pentru a promova fagocitoza hemocitară la un nevertebrat. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Predarea autoapărării creveților pentru a lupta împotriva infecțiilor. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Apariția istorică, impactul și starea actuală a agenților patogeni de creveți în Asia. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Apărare antivirală la creveți: de la imunitatea înnăscută la infecția virală. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. Relații structură/funcție care stau la baza reglementării factorilor de transcripție FOXO. Oncogene. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.