Efectele de albire a pielii și antirid ale compușilor bioactivi izolați din coaja de arahide folosind extracția asistată cu ultrasunete

Contact:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 și Jin Woo Kim 1,2,3*

Abstract:Metodologia suprafeței de răspuns a fost folosită pentru a optimiza condițiile de extracție asistată cu ultrasunete (UAE) pentru optimizarea simultană a variabilelor dependente, inclusiv activitatea de captare radicală a DPPH (RSA), inhibarea activității tirozinazei (TAI) și inhibarea activității colagenazei (CAI) a extractelor de coajă de arahide. Efectele principalelor variabile, inclusiv timpul de extracție (5.0~55.0 min, X1), temperatura de extracție (26.0~94.0 ◦C , X2) și concentrația de etanol (0.{0 procente ~99,5 la sută, X3) au fost optimizate. Pe baza valorilor experimentale din fiecare condiție, au fost derivate modele de regresie pătratică pentru predicția condițiilor optime. Coeficientul de determinare (R2) al variabilei independente a fost în intervalul 0.89~{0.96, ceea ce demonstrează că modelul de regresie este potrivit pentru predicție. În prezicerea condițiilor optime din Emiratele Arabe Unite pe baza metodei de suprapunere, au fost identificate timpul de extracție de 31,2 min, temperatura de extracție de 36,6 ◦C și concentrația de etanol de 93,2%. În aceste condiții, au fost prezise RSA de 74,9 la sută, TAI de 50,6 la sută și CAI de 86,8 la sută, arătând o concordanță bună cu valorile experimentale. O reacție în lanț de transcripție inversă-polimerază a arătat că extractul de coajă de arahide a scăzut nivelurile de ARNm detirozinazagenele legate de proteine-1 și metaloproteinaze-3 ale matricei din celulele B16-F{0. Prin urmare, am identificatalbirea pieliiși efectele antirid ale extractelor de coajă de arahide la nivelul proteinelor, precum și la nivelul expresiei genelor, iar rezultatele arată că coaja de arahide este un material cosmetic eficient pentrualbirea pieliiși efecte antirid. Pe baza acestui studiu, coaja de arahide, care a fost considerată un produs secundar, poate fi utilizată pentru dezvoltarea alimentelor sănătoase, a medicamentelor și a produselor cosmetice.

Cuvinte cheie:coajă de arahide; optimizare;albirea pielii; antirid; antioxidant;tirozinaza; colagenază; proteină înrudită cu tirozinaza umană-1 (TRP-1); metaloproteinaza matricei (MMP)

Faceți clic pentru organicproduse de îngrijire a pielii pentru albirea cistanche.

1. Introducere

Melanina este un pigment polimer de culoare maro sau negru care este sintetizat din melanosomii melanocitelor din epidermă. Funcția sa principală este de a bloca razele ultraviolete (UV) pentru a proteja pielea. Alternativ, producția sa excesivă poate provoca întunecări ale pigmentului, cum ar fi melasma, alunițe și pete de vârstă [1-3]. Tirozinaza este o enzimă majoră care catalizează reacțiile de autooxidare și polimerizare, prin care tirozina este transformată în dopachinonă prin dihidroxifenilalanină și produce melanină prin biosinteza melaninei cu dopacromatură [4]. Astfel, este utilizat pe scară largă pentru a reduce sau a atenua producția de melanină prin inhibareatirozinazaactivitate pentru a spori efectul de albire al produselor cosmetice [5]. Industrializarea rapidă și utilizarea sporită a clorofluorcarburilor au deteriorat grav stratul de ozon protector al pământului, ducând astfel la o cantitate mai mare de UV care ajunge la sol și expune pielea. Această creștere a radiațiilor UV induce, în consecință, generarea activă de specii reactive de oxigen (ROS) în corpul uman, cum ar fi anionii superoxid, peroxizii de hidrogen și radicalii hidroxil. Astfel de specii au promovat oxidarea continuă a tirozinei, rezultând o producție crescută de melanină. În acest sens, sunt efectuate în mod activ studii privind inhibareatirozinazaactivitatea precum şi eliminarea ROS în vederea dezvoltăriialbirea pieliiagenţi [6].Colagenul este o matrice extracelulară majoră care cuprinde 90 la sută din derm. Colagenul protejează și conferă elasticitate pielii și este implicat în rigiditatea mecanică a pielii, rezistență, legarea țesuturilor conjunctive și proliferarea și diferențierea celulelor [7]. Proteinele care alcătuiesc matricea extracelulară, cum ar fi colagenul, sunt descompuse de colagenază, cum ar fi metaloproteinaza matricei (MMP), provocând riduri, scăderea delasticității și lăsarea pielii [8]. Diverse tipuri de MMP care sunt exprimate prin ROS hidrolizează lanțul de colagen, țesutul conjunctiv al pielii și generează reticulare anormală a acestuia pentru a crește descompunerea colagenului și a accelera formarea ridurilor [9]. Din acest motiv, inhibarea producției de melanină și descompunerea colagenului prin reducerea generării de ROS a fost principalul obiectiv pentru albirea pielii și prevenirea ridurilor [10]. -produsele cosmetice antirid, au fost utilizate pe scară largă în ultimii ani. Cu toate acestea, utilizarea acestor materiale este limitată, având în vedere instabilitatea lor în prezența luminii și căldurii, precum și a reacțiilor adverse, inclusiv iritația pielii și dermatita de contact [11]. Cu un interes din ce în ce mai mare pentru antioxidanții naturali pentru depășirea deficiențelor ingredientelor convenționale de albire și antirid, extractele derivate din plante au fost utilizate în mod activ pentru a dezvolta compuși bioactivi pentru pielea prietenoasă și sigură.albireși cosmetice antirid [12,13].

Există diverse metode de extracție care sunt utilizate în prezent pentru extracția compușilor bioactivi din plante. Cu toate acestea, extracția compușilor bioactivi din surse naturale, în special din plante, a fost efectuată în principal prin metode de extracție cu solvent, apă caldă și Soxhlet, care au prezentat diverse dezavantaje, inclusiv eficiență scăzută de extracție, descompunere a ingredientelor, stabilitate scăzută și cost ridicat de operare. [14]. Astfel, metodele de extracție au fost testate recent, inclusiv extracția asistată cu ultrasunete, asistată cu microunde și extracția supercritică [15]. În special, ultrasunetele este o undă sonoră cu o frecvență de aproximativ 20 kHz sau mai mult, care are ca rezultat compresia, cavitația și rarefacția lichidului, maximizând astfel mișcarea moleculară într-un timp scurt pentru a obține o eficiență ridicată de extracție [16]. În plus, ultrasunetele sunt avantajoase, deoarece timpul scurt de extracție minimizează descompunerea compușilor bioactivi și este evaluat ca o metodă eficientă de extragere a ingredientelor naturale cu antioxidanti,albire, și proprietăți antirid de la multe plante și ierburi [17]. Optimizarea condițiilor de extracție este esențială pentru a crește eficiența extracției asistate cu ultrasunete (UAE), iar procesul de optimizare poate fi realizat fie prin metode experimentale, fie prin metode statistice. Metoda tradițională un factor la un moment dat, cu toate variabilele rămânând constante și în schimbare doar un factor la un moment dat, are limitări în determinarea efectelor interactive dacă este un experiment multivariat. Pe de altă parte, RSM oferă informații statistice despre corelația dintre variabile în experimentele multivariate, împreună cu experimente eficiente folosind un număr minim de eșantioane, precum și tehnici matematice și statistice importante pentru evaluarea eficacității și adecvarea modelului de regresie. Pentru optimizarea bazată pe statistică, diferite modele RSM, cum ar fi proiectarea factorială completă, designul Box-Behnken și designul central compozit (CCD), au fost utilizate pe scară largă. Printre acestea, CCD este foarte eficient și, prin urmare, oferă multe informații despre efectele variabilei experimentului și despre eroarea experimentală generală, cu un număr minim de rulări necesare [18]. Prin urmare, în multe studii existente, CCD a fost utilizat pe scară largă pentru a dezvolta, îmbunătăți și optimiza procesul. condiții pentru extragerea diverșilor antioxidanți și alți metaboliți din produsele naturale.

Arahida (Arachis hypogaea) este o plantă anuală aparținând familiei leguminoase. Este cultivat în peste 50 de țări din întreaga lume, inclusiv Coreea de Sud, India, China și Statele Unite [19]. Alunele sunt surse bogate de proteine ​​(25 la sută), lipide (47 la sută) și carbohidrați (16 la sută), precum și minerale, vitamine, niacină, acizi grași nesaturați și acizi andoleici [20]. Ele sunt consumate fie ca produse neprocesate, fie ca produse procesate, inclusiv nuci, unt și ulei de gătit. Se estimează că producția anuală de arahide la nivel mondial se ridică la 4,1 milioane de tone în total și că coaja de arahide reprezintă 35% ~ 40% din greutatea totală a arahidei [21]. Se estimează că peste 1,5 milioane de tone de coji de arahide sunt aruncate anual ca produse secundare. Cu toate acestea, având în vedere că doar o parte din cojile de arahide sunt folosite ca hrană pentru animale și că cele mai multe dintre ele sunt incinerate sau depozitate, provocând costuri de eliminare și probleme de mediu, este necesar să se producă materiale cu valoare adăugată mare folosind cojile de arahide pentru a depăși problema subproduselor [22]. ]. Studiile anterioare despre antioxidanți au arătat că au fost raportate activități antiinflamatorii și anti-obezitate ale extractelor de piele de arahide [23,24]. Cu toate acestea, până acum, nu există nicio cercetare privind producerea de materiale cosmetice funcționale pentru îmbunătățirealbireși efecte antirid folosind compuși bioactivi din coji de arahide. Prin urmare, acest studiu a extras compuși bioactivi dintr-o coajă de arahide utilizând extracția asistată cu ultrasunete (UAE) pentru a confirma efectele lor antioxidante, de albire și antirid și a prezentat în continuare o stare optimă de EAU folosind metoda suprafeței de răspuns (RSM) și a crescut funcționalitatea extractelor. pentru a confirma posibilitatea utilizării sale ca ingrediente alimentare, cosmetice și medicale.

2. Rezultate și discuții

2.1. Montarea modelelor RSM

În această lucrare, temperatura de extracție, timpul de extracție și concentrația de etanol au fost selectate ca principale variabile ale CCD utilizând experimentul preliminar de un factor la un moment dat pentru a determina variabilele semnificative care afectează EAU (Tabelul 1).

Apoi, au fost construite 17 curse experimentale, inclusiv 3 replici în punctul central folosind variabile 3-și CCD cu 5 niveluri. Erorile experimentale au fost minimizate prin randomizarea ordinii experimentale pentru a minimiza impactul variabilității inexplicabile. Rezultatele experimentale și prezise pentru activitatea de captare a radicalilor DPPH (RSA),tirozinazainhibarea activității (TAI) și inhibarea activității colagenazei (CAI) sunt prezentate în Tabelul 2.

Pentru a determina corelația dintre cele 17 runde experimentale ale condițiilor experimentale CCD și rezultatele experimentale, au fost propuse modele de regresie multiple pentru a prezice nivelurile optime ale acestor 3 variabile. Prin aplicarea analizei de regresie multiplă la datele experimentale, variabilele dependente (Y) și variabilele testate au fost legate prin următoarele ecuații de regresie pătratică (Tabelul 3).

Analiza varianței (ANOVA) este un test statistic pentru analiza datelor experimentale. Subdivide variația totală dintr-un set de date în părți componente care sunt asociate cu surse specifice de variație pentru a testa o ipoteză asupra variabilelor modelului sau pentru a estima componentele varianței [25]. Analiza suprafeței de răspuns și ANOVA au fost folosite pentru a determina coeficienții, a evalua semnificația statistică a termenilor modelului și a potrivi modelele matematice ale datelor experimentale care au vizat optimizarea regiunii generale pentru variabilele de răspuns [26]. După cum a fost stabilit de model, coeficienții de corelație (R2) utilizați pentru a determina relația dintre răspunsurile experimentale și cele prezise prin modelele de regresie au fost în intervalul 0.8862~0.9622. Acest lucru sugerează că variabilele de proces analizate explică mai mult de 88,6 la sută din variabilele independente. Software-ul Design-Expert a fost folosit pentru a calcula coeficienții ecuațiilor de regresie pătratică și adecvarea modelului a fost testată prin ANOVA. Conform valorii coeficientului monomial al ecuațiilor de regresie pătratică sunt enumerate în Tabelul 4, iar ordinea de prioritate între efectul principal al variabilelor independente este concentrația etanolului (X3) > temperatura de extracție (X2) > timpul de extracție (X1).

2.2. Efectul condițiilor de extracție asupra RSA

Tabelul 2 prezintă datele experimentale ale RSA în funcție de diferite condiții din Emiratele Arabe Unite. RSA a extractului de coajă de arahide a fost determinată în intervalul de 7,6 la sută ~ 89,9 la sută. Cel mai mare RSA a fost identificat în următoarele condiții de extracție: timp de extracție de 55.0 min, temperatura de extracție de 60.{{10}} ◦C și concentrația de etanol de 5 0.0 procente (Executarea #10). Cel mai mic RSA de 7,6 la sută, sub un timp de extracție de 30.{0 min, temperatura de extracție de 60,0 ◦C și concentrație de etanol de 0,0 la sută, a fost identificat ca valoare experimentală (execuția #13) . Prin aplicarea analizei de regresie multiplă, datele experimentale și răspunsurile au fost legate prin ecuații de regresie pătratică (Tabelul 3). Analiza statistică a arătat că R2 al modelului de regresie a fost 0,9308 (p=0,0027), ceea ce indică faptul că această ecuație ar putea explica 93,0 la sută din rezultatele condițiilor experimentale, ceea ce implică faptul că modelul a fost foarte semnificativ și ar putea fi utilizat pentru a prezice cu precizie. funcția de răspuns.

Efectul unei variabile individuale din Emiratele Arabe Unite la niveluri fixe ale altor variabile asupra RSA este prezis și prezentat în Figura 1a. RSA tinde să crească și apoi să scadă pe măsură ce toate variabilele EAU au crescut. Concentrația de etanol a avut cel mai mare efect asupra RSA dintre cele trei variabile UAE, în timp ce timpul de extracție și temperatura de extracție au avut cel mai puțin efect asupra RSA. Acest rezultat este în concordanță cu rezultatele ANOVA în care concentrațiile de etanol au arătat un efect mai semnificativ (p=0.0002) asupra RSA, așa cum se arată în tabelul 4. Efectul de interacțiune între variabilele independente asupra RSA a fost vizualizat folosind 3D curbe de suprafață de răspuns. Temperatura de extracție și timpul de extracție au fost modificate simultan la nivelul fix de concentrație de etanol (Figura 2A). Pe măsură ce cele două variabile (temperatura de extracție și timpul) au crescut, RSA a crescut la nivelul maxim și apoi a scăzut din nou. Cea mai mare RSA a fost obținută la o temperatură de extracție de 56,1 ◦C, ceea ce sugerează prin urmare extracția compușilor bioactivi cu potențial antioxidant, precum polifenolii, crește odată cu distrugerea componentelor peretelui plantei, precum lignina, la temperaturi de până la 56,1 ◦C; cu toate acestea, la temperaturi mai ridicate, RSA a fost scăzută datorită descompunerii sau polimerizării ingredientelor antioxidante. Figura 2B, C arată că RSA nu a fost afectată semnificativ de timpul de extracție sau de temperatură, în timp ce RSA a fost afectată semnificativ de concentrația de etanol, care a fost cea mai mare la concentrația de etanol de 61,0 la sută și care, de asemenea, a scăzut din nou. Acest rezultat este în concordanță cu cel al experimentului de extracție cu apă caldă a Lespedeza cuneata de Kim și colab. în care RSA a fost mai afectată de concentrația de etanol decât temperatura de extracție, iar RSA a fost maxim la intervalul de concentrație de etanol de 60% ~ 70% [27]. Aceste rezultate indică faptul că eficiența extracției solventului binar (apă și etanol) este mai eficientă pentru extracția cu un singur solvent în EAU a cojilor de arahide.

2.3. Efectul condițiilor de extracție asupra TAI

Tirozinazaeste o enzimă care promovează producția de melanină prin oxidarea tirozinei în stratul de bază al epidermei, iar inhibarea acestei enzime este esențială pentru îmbunătățireaalbirea pielii [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >temperatura de extracție (p < {{0}}.0598) > timpul de extracție (p < 0,4329), ceea ce a confirmat că efectul concentrației de etanol a fost cel mai semnificativ în TAI.

Pentru a compara efectul condițiilor EAU asupra TAI, graficul de perturbații a fost utilizat pentru a evalua efectul variabilelor individuale asupra TAI prin fixarea a două variabile în punctul central. După cum se arată în Figura 1b, TAI a arătat un model diferit față de experimentul RSA anterior; a crescut pe măsură ce concentrația de etanol a crescut, în timp ce timpul de extracție nu a afectat semnificativ TAI. Creșterea proporțională semnificativă a TAI cu concentrația de etanol poate fi explicată prin rezultatele ANOVA. TAI a fost afectat semnificativ de termenul primar al concentrației de etanol (X3) și (p <0.{05) termenul="" patratic="" nu="" este="" semnificativ="" statistic,="" demonstrând="" astfel="" o="" relație="" proporțională="" puternică="" între="" tai="" și="" concentrația="" de="" etanol.="" curba="" suprafeței="" de="" răspuns="" 3d="" este="" reprezentarea="" grafică="" a="" ecuației="" de="" regresie="" pătratică="" și="" a="" rezultatelor="" tai,="" așa="" cum="" sunt="" afectate="" de="" temperatura="" de="" extracție="" (x1),="" timpul="" de="" extracție="" (x2)="" și="" concentrația="" de="" etanol="" (x3).="" figura="" 3a="" vizualizează="" efectul="" de="" interacțiune="" al="" timpului="" de="" extracție="" și="" al="" concentrației="" de="" etanol="" asupra="" tai.="" rezultatul="" a="" confirmat="" că="" timpul="" de="" extracție="" nu="" a="" arătat="" niciun="" efect="" semnificativ="" asupra="" tai,="" în="" timp="" ce="" concentrația="" de="" etanol="" a="" avut="" o="" relație="" proporțională="" puternică="" cu="" tai.="" în="" mod="" similar,="" așa="" cum="" se="" arată="" în="" figura="" 3b,="" tai="" a="" fost="" mai="" dependent="" de="" concentrația="" de="" etanol="" decât="" de="" temperatura="" de="" extracție="" și="" cel="" mai="" mare="" tai="" a="" fost="" atins="" pe="" măsură="" ce="" concentrația="" de="" etanol="" a="" crescut="" la="" 99,5="" la="" sută.="" în="" explorarea="" condițiilor="" din="" emiratele="" arabe="" unite="" pentru="" tai="" maxim,="" valorile="" maxime="" ale="" condițiilor="" tai="" au="" fost="" prezise="" a="" fi="" 3{{20}},0="" min,="" 26,3="" ◦c="" și="" 99,5="" la="" sută.="" acest="" rezultat="" este="" similar="" cu="" cel="" raportat="" de="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" într-un="" studiu="" privind="" activitatea="" biologică="" a="" frunzelor="" de="" cedri,="" când="" 20,0%="" ~="" 80,0%="" etanol="" a="" fost="" folosit="" ca="" solvent="" de="" extracție,="" tai="" a="" crescut="" proporțional="" ca="" răspuns="" la="" creșterea="" concentrației="" de="" etanol="" și="" a="" arătat="" valoarea="" maximă="" în="" extracție="" folosind="" 80%="" etanol.="" acest="" lucru="" sugerează="" că="" utilizarea="" unei="" concentrații="" mai="" mari="" de="" etanol="" este="" avantajoasă="" în="" extragerea="" compușilor="" bioactivi="">albirea pieliiefect de la cojile de arahide sau alte plante.

2.4. Efectul condițiilor de extracție asupra CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >concentrația de etanol (p=0.0240) > timpul de extracție (p=0.8505), indicând astfel că efectul temperaturii de extracție și concentrația de etanol au fost semnificative asupra CAI.

Figura 1c prezintă un diagramă de perturbație în care sunt fixate două variabile și a vizualizat efectul unei singure variabile asupra CAI. Efectele tuturor celor trei variabile asupra CAI s-au dovedit a fi similare, iar cele trei variabile au prezentat efecte semnificative și au crescut și ulterior au scăzut CAI pe măsură ce fiecare variabilă independentă a crescut. În studiul nostru, curbele de răspuns la suprafață 3D au fost dezvoltate pentru a vizualiza interacțiunea a două variabile independente în CAI folosind ecuații de regresie pătratică (Figura 4). Când concentrația de etanol a fost fixată în punctul central, efectul timpului de extracție și al temperaturii asupra CAI a fost evaluat în Figura 4A. Pe măsură ce cele două variabile s-au schimbat simultan, CAI a crescut la 33,4 min și 76,8 ◦C și a scăzut din nou după un CAI maxim de 92,8 la sută. După cum se arată în Figura 4B, C, CAI a avut cea mai mare valoare la concentrația de etanol de 64,3%, arătând ulterior tendință de scădere graduală, ceea ce sugerează că un solvent binar format din 64,3% etanol este mai potrivit ca solvent de extracție. Acest rezultat este în concordanță cu cercetările anterioare care au raportat că un solvent binar de apă și etanol a arătat un CAI mai mare decât apa în extracția compușilor bioactivi din Orostachys japonica, ceea ce sugerează că 50% etanol ar fi mai avantajos în extracție.albirea pieliiingrediente [34]. CAI maxim al extractului de coajă de arahide prezis de modelul de cuadratricregresie a fost de 94,5 la sută, care a fost obținut în condiții de timp de extracție de 45,1 min, temperatură de extracție de 93,6 ◦C și concentrație de etanol de 42,3 la sută. CAI obținut în studiul nostru a fost de 94,5 la sută, ceea ce reprezintă mai mult de două ori mai mult decât efectele de 39,4 la sută și 40,3 la sută din valorile CAI ale extractelor de ceai verde raportate de Oh și colab. [35].

2.5. Condiții optime de extracție

antioxidant,albirea pieliiși efectele antirid sunt toate funcții importante pentru cosmetică și este necesar să se obțină condiții care să poată maximiza aceste trei funcții simultan în optimizarea condițiilor din Emiratele Arabe Unite. Figura 5 prezintă o procedură de optimizare care poate maximiza simultan RSA (Y1), TAI (Y2) și CAI (Y3) prin suprapunerea fiecărei condiții optime a unui grafic de contur derivat printr-o ecuație de regresie pătratică. Intervalele de variabile independente pentru optimizarea a trei variabile au fost limitate la timpul de extracție de 5,0~55,0 min, temperatura de extracție de 26,{{10}}~94. .0 ◦C și o concentrație de etanol de 0,0 la sută ~99,5 la sută (Tabelul 5). În conformitate cu condițiile optime individuale de extracție, condițiile optime EAU au fost 31,2 min de timp de extracție, 36,6 ◦C de temperatură de extracție, 93,2 la sută din concentrația de etanol și, în condițiile de mai sus, RSA de 74,9 la sută, TAI de 50,6 la sută și CAI de 50,6 la sută. 86,8 la sută a fost prezis. Când valorile prezise RSA, TAI și CAI au fost comparate cu cele obținute din experiment pentru validare, valorile din testul de validare au fost similare cu cele ale valorilor prezise, ​​unde valorile au fost de 78,2 la sută, 52,3 la sută și, respectiv, 87,7 la sută.

2.6. Comparație între SE și Emiratele Arabe Unite

Pentru a confirma eficacitatea extracției EAU, comparăm RSA, TAI și CAI ale extractului de coajă de arahide produs folosind tehnicile de extracție din Emiratele Arabe Unite și Soxhlet (SE). Când SE a fost efectuată în condiții generale de SE utilizând 99,5% etanol la 70 ◦C timp de 4 ore de extracție, RSA, TAI și CAI s-au dovedit a fi 75,5%, 60,2% și 74,4%, ceea ce nu au fost. mult diferit de rezultatele obținute în condiții optime din Emiratele Arabe Unite. Cu toate acestea, când condițiile SE au fost stabilite egale cu condițiile optime din Emiratele Arabe Unite de 31,2 min și 93,2% etanol, RSA, TAI și CAI au scăzut cu 62,0, 28,3 și, respectiv, 45,6%, comparativ cu Emiratele Arabe Unite în condiții optime. Avantajul ultrasunetelor în producerea de materiale utile din coji de arahide a fost evaluat ca un proces potrivit pentru o productivitate ridicată și industrializare datorită consumului scăzut de solvenți și timpului scurt de extracție.

2.7. Expresia ARNm a MMP-3 și TRP-1

În melanocitele de mamifere, melanogeneza și hidroliza colagenului sunt controlate de genele TRP și, respectiv, MMP, iar TRP{{0}} și MMP-3 sunt cunoscute ca genele principale pentru reglarea melanogenezei și hidrolizei colagenului; prin urmare, a fost efectuată analiza RT-PCR pe lizate de celule întregi ale celulelor B16-F{{0 și efectul extractului de coajă de arahide produs din Emiratele Arabe Unite în condiții optime (31,2 min, 36,6 grade, 93,2 la sută) a fost studiată expresia ARNm a MMP-3 și TRP-1. După cum arată figura 6, extractul de coajă de arahide a redus în mod semnificativ expresia MMP-3 și TRP{-1 în celulele B{16-F{{0 atunci când experimentele de exprimare a genei au fost efectuate cu o arahide intervalul de concentrație al extractului de coajă de 0~1 mg/mL. Extractul de coajă de arahide a redus semnificativ expresia MMP-3 și TRP{-1 de 6,1-ori, respectiv de 8,7-ori, la 1,0 mg /mL. Aceste rezultate sugerează că extractul de coajă de arahide inhibă degradarea colagenului în celulele B16F0 prin inactivarea MMP 3 la inactivarea MMP-1 și interferează cu cooperarea MMP{-9 [36]. Studiile existente au arătat că tratamentul cu extracte de plante a inhibat expresia factorului de transcripție asociat microftalmiei (MITF) prin fosforilarea protein kinazei reglate de semnal extracelular (ERK). Astfel, efectul inhibitor al producției de melanină prin extractul de coajă de arahide este atribuit inhibăriitirozinazaactivitatea prin inhibarea expresiei ERK și MITF [37]. Astfel, extractele de coajă de arahide au redus nivelurile de expresie a ARNm de TRP-1 și MMP{-3, ceea ce indică faptul că extractul de coajă de arahide posedă activități puternic inhibitoare asupra colagenolizei și melanogenezei, făcându-l un material cosmetic excelent cualbirea pieliisi efecte antirid.

3. Materiale și Metode

3.1. Materiale și reactivi

Cojile de arahide au fost achiziționate de la Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Coreea) în 2 martie019 și cojile au fost uscate la 60 ◦C folosind cuptor uscat (FC 49, Lab House, Seul, Coreea) timp de 24 de ore până la greutatea uscată a rămas constantă. Cojile de arahide uscate au fost pulverizate folosind un robot de bucătărie (Hanil HMF-3800, Seul, Coreea) și apoi trecute printr-o sită de 600 µm. Etanolul a fost achiziționat de la Samchun chemical (95,0 procente v/v, Seul, Coreea). Reactivul Folin-Ciocalteu, acidul galic (97 la sută) și quercetina au fost achiziționate de la Merck (Kenilworth, NJ, SUA). 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), acid ascorbic și 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Toate celelalte substanțe chimice utilizate în acest experiment au fost de calitate analitică și achiziționate de la Sigma-Aldrich. Toate soluțiile stoc au fost preparate cu apă deionizată purificată folosind un sistem de purificare Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, SUA).

3.2. Extracție asistată cu ultrasunete și extracție Soxhlet

Coaja de arahide sub formă de pulbere (1 g) a fost plasată într-un vas de extracție, fiecare cu 10 ml de solvent și amestecată folosind un amestecător vortex (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coreea) pentru 1 min. Extracția a fost efectuată prin circularea apei în extractorul cu ultrasunete (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coreea) folosind un circulator de baie refrigerat extern (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Coreea). ) cu un temporizator digital și un controler de temperatură. Extracția a fost efectuată cu un dispozitiv cu ultrasunete echipat cu un cronometru digital și un regulator de temperatură. Proba a fost supusă cu ultrasunete pentru diferite durate și temperaturi experimentale la o frecvență de lucru de 40 kHz. Apoi, extractul a fost centrifugat la 10,000 rpm timp de 10 minute (236R, Labogene, Seul, Coreea). După centrifugare, volumele de probă au fost aduse până la 5 mL și filtrate printr-un filtru cu membrană de 0,2 µm înainte de analiză. Pentru extracția Soxhlet, coaja de arahide sub formă de pulbere (5 g) a fost extrasă în mod continuu cu 100 ml folosind 99,5% etanol timp de 4 ore (8 cicluri) la o temperatură maximă de 70 ◦ C într-un aparat Soxhlet. Tehnica de extracție asistată cu ultrasunete s-a dovedit a fi foarte eficientă în extragerea uleiului din sâmburi de struguri, avantajul ultrasunetelor, în comparație cu metodele convenționale de extracție atât pentru uleiuri, cât și pentru polifenoli, a fost similar deoarece randamentul uleiului/polifenolilor obținut cu un consum mai mic de solvenți și un consum mai scurt de solvenți. timpul de extracție.

3.3. Design experimental

Designul experimental a fost realizat folosind CCD, un tip de RSM pentru a minimiza numărul de rulări experimentale și a studia interacțiunea dintre factori. Software-ul Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, SUA) a fost utilizat pentru proiectarea experimentelor, analiza datelor și optimizarea condițiilor de extracție pentru maximizarea extracției de compuși bioactivi care au antioxidant,albirea pielii, și efecte antirid de la coaja de arahide. Experimentele au fost proiectate conform CCD, valorile intervalului și punctului central ale trei variabile independente prezentate s-au bazat pe rezultatele experimentelor preliminare (Tabelul 1). CCD a fost aplicat pentru a prezice condițiile optime din Emiratele Arabe Unite pentru maximizarea răspunsurilor, inclusiv RSA, TAI și CAI din cojile de arahide. Ca variabile independente, cele trei variabile alese au fost timpul de extracție (X1), temperatura de extracție (X2) și concentrația de etanol (X3). Un total de 17 runde experimentale au fost generate cu trei replicări la punctele centrale pentru a estima reproductibilitatea. Modelul de regresie pătratică a fost utilizat pentru a se potrivi cu datele experimentale și a fost aplicat pentru a prezice variabilele de răspuns, așa cum se arată în ecuația (1):

Y= 0 plus 1X1 plus 2X2 plus 3X3 plus 11X12 plus 22X22 plus 33X32 plus 12X1X2 plus 13X1X3 plus 23X2X3 (1)

unde Y este răspunsul prezis; 0 este constanta (interceptarea); 1, 2 și 3 sunt coeficienții de regresie pentru termenii efectului liniar; 11, 22 și 33 sunt termeni cu efect de pătrat; și, respectiv, 12, 13 și 23 sunt termenii efectului de interacțiune. O analiză a suprafeței de răspuns și ANOVA au fost folosite pentru a determina coeficienții de regresie și semnificația statistică a termenilor modelului și pentru a se potrivi modelelor matematice ale experimentului [38].

3.4. Activitatea de eliminare a radicalilor DPPH (RSA)

RSA a extractului de coajă de arahide a fost așa cum este descris de Pereira-Caro și colab. [39]. S-a preparat o soluție de 0.{01 mM DPPH în metanol (95 la sută) și s-au adăugat 1,25 mL la 0,25 mL de extract diluat. RSA a fost determinată pentru a măsura absorbanța la 517 nm utilizând UV-Visspectrofotometru (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japonia) după 20 de minute de incubare. Martorul a fost preparat folosind apă distilată și RSA a fost calculat conform celor de mai jos. (Ecuația (2)):

RSA ( procente )={1 −Abs (eșantion) /Abs (control) }× 100 (2)

3.5. Inhibarea activității tirozinazei (TAI)

TAI a fost efectuat conform metodei modificate folosind L-DOPA ca substrat de Jo et al. [40]. Probele au fost amestecate cu 200 µL L-DOPA și 200 µL tampon fosfat de potasiu (pH 6,8) și 200 µL detirozinaza(125 U/mL) a fost adăugat în eprubetă și incubat la 37 °C timp de 20 min. Absorbanța probei a fost măsurată la 475 nm utilizând un spectrofotometru UV-Vis și rezultatele au fost comparate cu controlul. Pentru fiecare concentrație, activitatea enzimatică a fost calculată ca procent în comparație cu cea a testului utilizând un tampon fără niciun inhibitor și TAI a fost calculat pe baza următoarei formule. (Ecuația (3)):

TAI ( procente )={1 −Abs (martor) − Abs (eșantion) /Abs (martor)}× 100 (3)

unde Abs (control) este absorbanța tamponului plus colagenază; Abs (probă) este absorbanța tamponului plus colagenază plus probă/standard.

3.6. Inhibarea activității colagenazei (CAI)

Măsurarea CAI a extractelor a fost efectuată prin modificarea metodelor lui Wünsch și Heindrich [41]. Substratul, 4-fenilazobeziloxylcarbonil-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), a fost dizolvat în 10 mL tampon la 1,2 mg/mL și apoi s-au adăugat 125 µL de soluție și s-au incubat timp de 60 de minute la 37 ◦C. Colagenaza a fost dizolvată în tampon la 0,4 mg/mL și s-au adăugat 75 ui de soluție de enzimă la soluția tampon. Amestecul de enzimă-substrat a fost incubat într-o baie de apă la 37 °C timp de 30 de minute și reacția a fost oprită prin adăugarea a 75 uL de acid citric 20% (g/v). După adăugarea a 1,5 ml de acetat de etil, stratul de acetat de etil a fost separat şi absorbanţa a fost măsurată la 320 nm. Procentul de inhibare a fost calculat conform următoarei formule.

CAI (procent )={1 − [Abs (control) − Abs (eșantion)] /Abs (control)}× 100 (4)

unde Abs (control) este absorbanța tamponului plus colagenază; Abs (probă) este absorbția tamponului plus colagenazei plus probă/standard.

3.7. Întreținerea și cultivarea liniilor celulare

Celula melanomului B16-F{0 producătoare de melanină a fost obținută de la Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) și a fost cultivată în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) suplimentat cu ser fetal bovin (FBS, 10 la sută, Welgene, Gyeongsan, Coreea) și soluție antibiotică de penicilină-streptomicină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Tripsină-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, SUA) a fost utilizată pentru tripsinizarea celulelor. Toate materialele utilizate au fost de calitate pentru culturi celulare.

3.8. Reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă (RT-PCR)

RT-PCR a fost efectuată pentru a măsura modificările nivelurilor de expresie a genelor MMP-3 și TRP-1 asociate cualbireși efecte antirid, celulele B{16-F{{0 au fost cultivate într-o placă de24-godeuri tratate cu diferite concentrații de extract de coajă de arahide în DMEM fără ser și incubate timp de 24 de ore. Controlul celular netratat a fost menținut în aceleași condiții ca și grupul testat în timpul experimentului. Izolarea ARN din celule a fost efectuată utilizând kitul universal de extracție ARN AccuPrep® (Bioneer, Daejeon, Coreea). ADN-ul complementar a fost sintetizat folosind MasterMix de sinteză AmfiRiert Platinum cADN (GenDEPOT, Barker, TX, SUA). Analiza RT-PCR a fost efectuată folosind sistemul CFX 96 touch PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) pentru a determina nivelurile de ARNm. Primerii utilizați au fost după cum urmează: MMP-3 sens, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 și antisens, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; și TRP-1 sens, 50-GCTCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 și antisens, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Un set adecvat de primeri menționate mai sus a fost utilizat pentru a amplifica genele respective utilizând următoarele condiții de ciclism: 94 °C timp de 5 minute, urmate de 25 de cicluri la 95 °C timp de 5 s, 60 °C timp de 30 s (forMMP-3) , și 60 ◦C pentru 30 s (pentru TRP-1) și 72 ◦C pentru extensie de 30 s. Produsele PCR au fost supuse electroforezei pe un gel de agaroză 1%, colorate cu bromură de etidio și vizualizate utilizând Gel Doc TM XR plus System and Quantity One software 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). O proteină de întreținere, -actina, a fost utilizată ca control al încărcării cu presupunerea că nivelurile de expresie ale acestor proteine ​​rămân constante.

4. Concluzii

În acest studiu, abordarea complementară a fost folosită pentru recuperarea și utilizarea substanțelor bioactive din subprodusele agricole ale cojilor de arahide pentru a dezvolta ingrediente cu valoare adăugată cu utilizări multiple. În primul rând, am încercat să creștem eficiența extracției compușilor bioactivi cu efecte antioxidante, de albire a pielii și antirid prin optimizarea procesului din Emiratele Arabe Unite. Prin urmare, acest studiu a folosit Emiratele Arabe Unite pentru producția eficientă de compuși bioactivi cualbirea pieliiși efecte antirid de la coji de arahide și optimizare bazată pe statistici aplicate pentru a maximiza RSA, TAI și CAI simultan. Condițiile din Emiratele Arabe Unite au fost optimizate folosind CCD și s-a confirmat că alegerea solventului și a concentrației ar trebui luate în considerare în extracția compușilor bioactivi din cojile de arahide. Prin suprapunerea suprafețelor de răspuns, curbele a trei variabile dependente, un timp de extracție de 31,2 min, temperatura de extracție de 36,6 ◦C și concentrația de etanol de 93,2% au fost determinate a fi condițiile optime ale EAU. S-a confirmat că RSA a extractelor de coajă de arahide este foarte mare și se poate aștepta să crească în TAI și CAI, care sunt indicatori aialbirea pieliiși efecte antirid, respectiv. Optimizarea condițiilor din Emiratele Arabe Unite a confirmat o creștere a producției de substanțe bioactive din cojile de arahide și activitățile de albire și antirid ale extractului de coajă de arahide printirozinazași scăderea activității colagenazei. Pe baza acestui fapt, au fost evaluate efectul cojilor de arahide asupra nivelurilor de expresie ale MMP și TRP pentru a evalua dacă au efecte de albire și antirid la nivelul expresiei genelor. Efectele de albire și antirid ale extractelor de coajă de arahide au fost confirmate prin reglarea în jos a Expresiile ARNm, precum și inhibarea expresiilor proteice ale MMP-3 și TRP-1. Prin urmare, extractul de coajă de arahide s-a dovedit a fi eficientalbireși îmbunătățirea ridurilor la nivelul expresiei proteinelor și a genelor. Extractul de coajă de arahide, folosind Emiratele Arabe Unite, are activitate antioxidantă ridicată și efecte excelente de albire a pielii și antirid, oferind coajelor de arahide un mare potențial ca cosmetic natural și ingredient alimentar. În plus, se crede că producția de compuși bioactivi folosind EAU poate fi aplicată procesului de comercializare pentru producerea de produse cosmetice, alimente și materiale farmaceutice, având în vedere randamentul de producție mai mare și costurile reduse de procesare în comparație cu procesele convenționale.