Cum afectează sintaza oxidului nitric rinichii?

Contact: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Studiu molecular al toxicității diazinonului pe baza expresiei sintazelor de oxid nitric inductibil (iNOS) în hepatocite și histopatologie renală la șobolani (Rattus norvegicus)

Abstract

Diazinonul este un insecticid organofosforic care este utilizat pe scară largă pentru eradicarea dăunătorilor, dar are o toxicitate mai mare decât alte insecticide. Diazinonul care este consumat accidental pe cale orală are un impact asupra creșterii speciilor reactive de oxigen (ROS) din organism. Speciile reactive de oxigen (ROS) vor activa citokinele proinflamatorii care vor induceSintaza de oxid nitric(iNOS) la care iNOS (Sintaza de oxid nitric) va produceOxid de azot(NO) ca radical liber. Un nivel ridicat de ROS va cauza deteriorarea celulelor. Acest studiu a avut ca scop determinarea efectului de toxicitate al diazinonului față de iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie în ficat şirinichihistopatologia șobolanilor (Rattus norvegicus). Șobolanii au fost împărțiți în 4 grupuri care constau din grupul martor negativ și trei grupuri experimentale cărora li sa administrat diazinon 20 mg/kg BW (P1), 40 mg/kg BW (P2) și 60 mg/kg BW (P3). Parametrii care au fost observați în această cercetare sunt expresia iNOS (Sintaza de oxid nitric)în ficat folosind colorarea imunohistochimică, apoi analizată folosind ANOVA unidirecțional urmată de testul Tukey (a=0,05) șirinichihistopatologie care a fost observată cu ajutorul colorației Hematoxilină-Eozină și analizată calitativ descriptiv. Rezultatele au arătat că administrarea de diazinon pe cale orală a crescut semnificativ iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie (p<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">rinichicortexul care s-a arătat prin infiltrarea celulelor inflamatorii, necrozată derinichicelule tubulare și hemoragie în spațiul intertubular.

Cuvinte cheie:Diazinon, organofosfat, iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie,rinichihistopatologie.

Cistanche îmbunătățește funcția rinichilor

1. Introducere

S-a considerat că utilizarea pesticidelor crește producția, în special ca prevenire împotriva dăunătorilor și buruienilor (Kusriani, 2012). Cu toate acestea, utilizarea frecventă a pesticidelor poate face ca aceste pesticide să fie toxice pentru consumatori, inclusiv pentru animale atât prin inhalare, pe cale orală, cât și prin piele (Ameriana, 2006). Un pesticid utilizat în mod obișnuit este diazinonul. Diazinonul este un pesticid organofosfat care are un mecanism care inhibă funcția enzimei colinesterazei. Aceste pesticide au, de asemenea, un efect mai mic asupra organismelor care nu sunt țintă și sunt mai toxice pentru animalele vertebrate în comparație cu substanțele organoclorate (Luthfanto, 2014). În mod normal, pesticidele vor fi neutralizate în ficat de către hepatocite prin detoxifiere, dar acești compuși sunt, de asemenea, capabili să formeze radicali liberi din cauza leziunilor celulare. Expunerea la organofosfați care are loc continuu poate declanșa leziuni hepatice ca organ care joacă un rol în procesul de detoxifiere (Ginting, 2014). Organofosfații care au fost metabolizați în ficat au potența de a inhiba enzima AChE. Inhibarea acestei enzime are ca rezultat o creștere a nivelului de acetilcolină în sistemul nervos și sistemul neuromuscular. Creșterea AChE poate face ca ionii din celule să devină instabili și să declanșeze formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) (Uchendu, 2012). Creșterea ROS va declanșa producerea de citokine proinflamatorii. Naik și Vishva (2011) afirmă că ROS afectează transcripția citokinelor proinflamatorii, unde nivelurile ridicate de ROS vor fi urmate de niveluri ridicate de citokine proinflamatorii, precum și dacă producția de ROS este inhibată de inhibitori, va afecta scăderea producției de citokine proinflamatorii, cum ar fi ca IL-6 și TNF. Producția crescută de citokine proinflamatorii va induce iNOS (Sintaza de oxid nitric)și formează NO în cantități excesive (Aktan, 2004).

Therinichieste principalul organ care menține echilibrul fluidului extracelular (ECF) prin îndeplinirea funcțiilor sale de excreție și metabolism (Curthoys, 2014). Excreția sau eliminarea rezultatelor metabolismului xenobiotic efectuată înrinichi. Therinichideteriorarea poate reduce nivelul de excreție a substanțelor chimice fără a crește toxicitatea substanțelor toxice (Gupta, 2012). Starea de stres oxidativ va iniția procesul de peroxidare a lipidelor prin luarea ionilor de hidrogen din legătura acidului gras polinesaturat (PUFA) pentru a forma o moleculă mai stabilă. Procesul de rupere a legăturilor pe PUFA poate provoca necroză celulară sau tisulară (Sharma et al..2003).

Acest studiu a fost realizat pentru a determina efectul de toxicitate al diazinonului împotriva iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie în histopatologia hepatică și renală la șobolani.

Sintaza de oxid nitric afectează funcția rinichilor

2. Materiale și metode

2.1. Modele animale și design experimental

Douăzeci de șobolani (Rattus norvegicus) au fost împărțiți în 4 grupuri: grupul martor negativ (șobolani sănătoși). Grupurile P1, P2 și P3 au fost administrate cu diazinon timp de 8 săptămâni pe cale orală folosind un tub de hrănire cu doze de 20 mg/kg BW, 40 mg/kg BW și, respectiv, 60 mg/kg BW. Diazonium 600EC a fost amestecat cu apă distilată până când a conținut 5 mg de diazoniu în 1 ml (Baconi și colab., 2013).

Sobolanii au fost aclimatizati timp de o saptamana inainte de a primi tratament. Toate condițiile și manipularea animalelor au fost efectuate conform protocolului aprobat de Comitetul de autorizare etică al Universității Brawijaya (nr: 732-KEP-UB).

2.2.Pregătirea și observarea histopatologiei renale

Pregătirea derinichihistopatologia constă din următoarele etape: fixare, deshidratare, curăţare, înglobare, secţionare, lipire de obiecte din sticlă conform Muntiha (2001). Observatii alerinichihistopatologia a fost efectuată folosind un microscop cu lumină binoculară cu mărire la microscop de 100x urmată de până la 400x. Observația s-a făcut pe glomerul renal și tubuli renali.

2.3.Analiza expresiei iNOS (Nitric Oxide Synthase) pe ficat

iNOS (Sintaza de oxid nitric)Expresia pe ficat a fost analizată prin metode imunohistochimice, folosind anti iNOS (Sintaza de oxid nitric) ca anticorp primar și IgG anti-iepure marcat cu biotină ca anticorp secundar. Măsurarea iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresia pe ficat a fost efectuată utilizând software-ul Immunoratio. Rezultatele zonei procentuale de expresie iNOS au fost analizate cantitativ utilizând testul unidirecțional de analiză a varianței (ANOVA) și au fost urmate cu testul Tukey.

3. Rezultate și discuții

3.1.Analiza expresiei iNOS (Nitric Oxide Synthase) pe ficat

Pentru a analiza expresia iNOS (Sintaza de oxid nitric)asupra celulelor hepatice s-a realizat prin metoda imunohistochimiei. Expresia iNOS (Sintaza de oxid nitric)poate fi prezentată ca o expresie de culoare maro pe hepatocite, care poate fi văzută în Figura 1.

Figura 1. iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie pe ficat.

(1) Grupul de control negativ (K-). (2) P1 (indus cu diazinon 20 mg/kg BW. (3) P2 (indus cu diazinon 40 mg/kg BW).

(4) P3 (indus cu diazinon 60 mg/kg BW. Cercul alb arată aria iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie.

Rezultatul imunohistochimiei a fost analizat calitativ și a arătat că există o creștere a intensității culorii maro (Figura 1). Acest rezultat indică faptul că există o creștere a iNOS (Sintaza de oxid nitric)nivelurile de expresie în grupul de tratament comparativ cu grupul de control.

Pentru a măsura nivelul iNOS (Sintaza de oxid nitric)exprimarea pe hepatocite a folosit software-ul de imunoreacție. Rezultatele analizei cantitative a iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresia în ficatul șobolanilor poate fi văzută în Tabelul 1 și se poate concluziona că există o diferență semnificativă (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Sintaza de oxid nitric)Expresia a fost de 1,340 ±0,092 procente. În grupul de tratament 1 (P1), acesta a fost grupul indus de organofosfatul de diazinon la o doză de 20 mg/kg BW, suprafața procentuală medie a iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresia a fost de 4,184±1,041 la sută. Grupul de tratament 2(P2) a fost un grup indus de organofosfatul de diazinon la o doză de 40 mg/kg BW și media iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresia a fost de 7,496±0,997 la sută. Grupul de tratament 3(P3) a fost un grup indus de organofosfatul de diazinon la o doză de 60 mg/kg BW și media iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresia a fost 11,604 ± 0.864.

Pe grupul martor negativ a prezentat iNOS (Sintaza de oxid nitric)expresie în intensitate scăzută (1,340 ± 0,092 la sută). McNaughton și colab. (2002) au descoperit că iNOS (Sintaza de oxid nitric)a fost exprimat în acini hepatici normali. Răspândirea iNOS (Sintaza de oxid nitric)în ficatul normal arată zona din jurul portalului cu cea mai puternică expresie și intensitatea scade de-a lungul acinilor hepatici. Potrivit lui Kubes (2000), iNOS (Sintaza de oxid nitric)poate oferi efecte terapeutice dacă este reglat în cantitatea și locația potrivite, iNOS are un rol pozitiv, inclusiv vindecarea pielii și a mucoasei intestinale, combaterea anumitor bacterii, potențialul în reglarea proliferării și diferențierii celulelor T și reglarea recrutării leucocitelor. .

Grupul de tratament a arătat o creștere semnificativă a zonei procentuale de iNOS (Sintaza de oxid nitric) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Creșterea ROS va declanșa producerea de citokine proinflamatorii. Speciile reactive cu oxigen afectează transcripția citokinelor proinflamatorii, unde nivelurile ridicate de ROS vor fi urmate de niveluri ridicate de citokine proinflamatorii, de asemenea, dacă producția de ROS este inhibată cu inhibitori, va afecta și scăderea producției de citokine proinflamatorii, cum ar fi IL{0 }} și TNF (Naik și Vishva, 2012). Dunlop și colab. (2014) și Pahan și colab. (2000) au declarat că TNF- și IL-1 joacă un rol în creșterea expresiei iNOS (Sintaza de oxid nitric)în țesuturi prin activarea Nappar Kappa B(NF-kB) în care NF-kB intră în nucleu și se leagă de regiunea promotoare a iNOS (Sintaza de oxid nitric). Producția crescută de citokine proinflamatorii va induce iNOS (Sintaza de oxid nitric)și formează cantități excesive deOxid de azot(NU) (Aktan, 2004).

3.2.Analiza histopatologiei rinichilor

Rezultatele acestei cercetări privind efectul toxicității diazinonului asuprarinichiCaracteristicile histopatologice folosind colorația Hematoxilină-Eozină (HE) sunt prezentate în Figura 2. Imaginea histologică a cortexului renal al șobolanului din grupul de control negativ (K-) a fost prezentată într-o stare normală și nu a fost găsită nicio anomalie. Acest lucru este dovedit de apariția corpului renal, a tubilor convulsivi proximali și distali cu un strat de celule epiteliale cuboide (Figura 2(1)).

Tabloul histopatologic al cortexului renal al șobolanilor din lotul P1 a evidențiat anomalii, care se caracterizează prin prezența celulelor supuse carioliză și hipertrofie. Celulele de carioliza s-au caracterizat prin dispariția nucleului celular, în timp ce celulele epiteliale care suferă de hipertrofie au caracteristici de mărime celulară mărită astfel încât structura tubulilor renali pare neregulată. Eritrocitele din spațiul intertubular pot fi observate în această imagine care indică prezența hemoragiei (Figura 2(2). Tabloul histopatologic din grupul P2 arată anomaliile ca fiind similare cu grupul P1. Anomalii care pot fi observate în cortexul renal. de șobolani P2 includ aspectul celulelor supuse cariolizei, hipertrofia celulelor și hemoragie. În plus, structurarinichitubii apare neregulat, comparativ cu grupul K (Figura 2(3)). Tabloul histopatologic al cortexului renal la șobolanii din grupul P3 a arătat anomalii așa cum se observă în tabloul histopatologic al cortexului renal la șobolanii Pl și P2, caracterizate prin apariția hipertrofiei celulelor, cariolizei și eritrocitelor în spațiul intertubular (hemoragie). ). De asemenea, se poate observa prezența infiltrației celulelor inflamatorii în țesuturi (Figura 2(4)).

Organofosfatul de diazinon care a fost administrat șobolanilor pe cale orală va fi digerat de tractul digestiv care va fi apoi absorbit de intestin, în special de duoden. Metabolismul organofosfaților are loc în principal în ficat, dar într-o măsură mai mică metabolismul are loc și în palmă și intestin. Organofosfatul va suferi metabolismul de faza 1, care este un proces de oxidare în care organofosfatul va fi descompus în metaboliți oxon-organofosfat și ioni liberi de sulf cu ajutorul enzimelor citocrom (CYP) (Gupta, 2009; Elersek și Metka 2011). Metabolitul oxon-organofosfat intră apoi în fluxul sanguin și merge în ficat pentru un metabolism suplimentar. În ficat, metaboliții oxon-organofosfat vor fi hidrolizați cu ajutorul enzimelor carboxilesterază (CE) și paraoxonază (PON), divizați în dialchil fosfat și părăsind grupul. Dialchilfosfataza va fi apoi catalizata de enzime in metabolismul de faza 2 care vor produce molecule care sunt hidrofile si pot fi excretate in urina in timp ce lasa grupuri (sub forma de dietil) care pot induce stres oxidativ in organism. Dietilul este o moleculă foarte reactivă și poate reacționa cu grupările radicale hidroxil (-OH) pentru a forma noi radicali liberi (Elersek și Metka, 2011). Numărul mare de radicali liberi din organism nu poate fi neutralizat de antioxidanții endogeni, rezultând un dezechilibru între radicalii liberi și antioxidanți care provoacă daune oxidative (Caramori și Papi, 2004). Această deteriorare oxidativă are loc deoarece dietil-hidroxil ca radical liber din diazinonul organofosfat este capabil să producă cantități mari de ROS (Uchendu și colab., 2012). Creșterea ROS va provoca apoi condiții de stres oxidativ și va iniția procesul de peroxidare a lipidelor prin luarea ionilor de hidrogen din acidul gras polinesaturat (PUFA) pentru a forma molecule mai stabile. Procesul de rupere a legăturilor PUFA poate provoca necroză celulară sau tisulară (Sharma et al., 2003).

Anomaliile au apărut înrinichiepiteliul tubular datorită contactului direct al epiteliului cu substanța toxică a diazinonului, iar înrinichitubulului, există un proces de reabsorbție și augmentare în procesul de formare a urinei (Mescher, 2010). Substanța toxică a diazinonului care se află încă în vasele de sânge va fi în contact direct cu endoteliul, provocând astfel perturbarea permeabilității membranei vasculare. Hemoragia în spațiul intertubular a fost cauzată de perturbarea permeabilității membranei vaselor de sânge (capilare peritubulare), astfel încât eritrocitele pot pătrunde în țesut (Djumadi și colab., 2008). Leziunile celulelor endoteliale inițiază reacții inflamatorii, ducând la acumularea de macrofage și trombocite în exteriorul și în interiorul arterelor. Apariția infiltrației celulelor inflamatorii în țesutul deteriorat indică faptul că metaboliții din diazinon provoacă toxicitate pentrurinichi(Khudair și colab., 2017).

Pe baza rezultatelor aspectului histopatologic, cortexul renal din grupul de tratament a prezentat anomalii în comparație cu grupul K. Se știe că grupul P1 cu cea mai mică doză de 20 mg/Kg BW a arătat deteriorarearinichicelule tubulare comparativ cu grupul K.

Cistanche îmbunătățește funcția renală

4. Concluzie

Sa demonstrat că administrarea de diazinon cu cea mai mică doză de 20 mg/kg BW are un efect toxic la șobolani, așa cum este indicat de o creștere semnificativă a iNOS. (Sintaza de oxid nitric)expresie (p<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Referințe

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Sintaza de oxid nitric)- Producția mediată de oxid nitric și reglementarea acesteia. Life Sciences,75:639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran dalam Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CGand EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana și NL Rahmah.2012. The Potency of Sargassum duplicated Bory Extracts on Inflammatory Bowel Extract Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Caramori, G. și A. Papi.2004.Antioxidants in Organophosphforus Compounds Poisoning. IntJ Pharm Bio Sci,59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000.Diazinon: Toxicology.Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NP și WM Orson.2014.Proximal Tubule Function and Response to Acidosis. Societatea Americană de Nefrologie. Jurnalul clinic al Societății Americane de Nefrologie 9:1627-1638

[8] Djumadi, H., dan H. Sugiyono.2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon dan Kurkumin Kunyit(Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi,Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G.Kiranjot, K. Crystal, I.Julijana, D.Rupinder, D.Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara și PJ Robert. 2014. Hipercapnia terapeutică previne disfuncția sistolică a ventriculului drept indusă de oxid nitric inhalat la șobolanii tineri. Elsevier Inc. Free Radical Biology and Medicine 9: 35-49.

[10] Elersek,T.and F.Metka.2011.Pesticides: The Impacts of Pesticides Exposure.InTech Europe. Rijeka.

[11] Frazier, SK, CSJohn, CHGordon, B.Graham, B.Roger, N.Shinji, N.Akiyoshi, D.Beate și B. Axel.2012. Leziuni proliferative și neproliferative ale sistemului urinar de șobolan și șoarece. Patologia toxicologică, 40:14S-86S

[12] Georgievskii, V.1., BNAnnenkov și VTSamokhin.2013.Material Nutrition of Animals: Studies in the Agricultural and Food Sciences. Butterworths & Co.(Publishers)Ltd.Londra. 160-161.

[13] Gupta, RC2012.Toxicologie veterinară ediția a doua.Elsevier inc. Waltham.SUA.

[14]Hubrecht, R. și J.Kirkwood. 2010. UFAW: Manual de îngrijire și management al animalelor de laborator și de cercetare. Federația Universităților pentru Bunăstarea Animalelor. Regatul unit.

[15]Khudair, ZW, ASHanan și KE Manal.2017. Modificări histopatologice induse în organele interne ale șobolanului alb după expunerea la diazinon.Bas..Vet.Res. 1(2)

[16] Kubes, P.2000. Inductible Nitric Oxide Synthase: A Little Bit of Good in All of Us. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24 iulie 2019].

[17] McNaughton, L., P.Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba și WR Marek.2002. Distribuția oxidului nitric sintaza în ficatul uman normal și cirotic. Proceedings of the National Academy of Science Vol.99, Nr.26 17161-17166.

[18] Mescher, AL2010.Junqueira's Basic Histology: Text &Atlas 12 Edition.The McGraw-Hill Companies, Inc.Statele Unite ale Americii.

[19] Mishra, BP 2013. Statusul antioxidant și stresul oxidativ în otrăvirea cu pesticide organofosfați.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Volumul 7, numărul 6 (mai-iunie 2013), PP 20-24