Cum să protejați celulele tubulare renale afectate de apoptoza indusă de gentamicina?

Efectele protectoare ale Zhibai Dihuang Wan asupra celulelor tubulare renale afectate de apoptoza indusa de gentamicina

Pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Cuvinte cheie: Acut rinichiboala, Apoptoza, Gentamicină,Celulă tubulară renală, rinichi.

Abstract

Relevanță etnofarmacologică: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) este o medicină tradițională chineză străveche, compusă din opt ingrediente din plante și a fost utilizată pentru tratarea bolilor cronice.rinichiinflamație și diabet de mii de ani. Cu toate acestea, influența ZDW asupra acutărinichirănirea este încă necunoscută. Ne-am propus să identificăm influența ZDW asupra creșterii celulelor șigentamicina-leziune apoptotică indusă încelule tubulare renale.

Materiale și metode: Am extras ZDW cu lichid intestinal artificial și am tratat șobolancelule tubulare renale(NRK-52E) cu diferite concentrații ale extracției ZDW. Proliferarea celulară șigentamicina-induseapoptozacelulele NRK-52E au fost evaluate utilizând monitorizarea în timp real a proliferării și, respectiv, colorarea anexinei V. Western blotting a fost folosit pentru a evalua nivelurile expresiei Bcl-2 și caspazei-3. Efectul ZDW asupragentamicina-induserinichileziunea a fost, de asemenea, monitorizată la șoareci utilizând testul de etichetare UTP nick end (TUNEL) biotinilat mediat de deoxinucleotidil transferază și măsurarea creatininei serice și a azotului ureic din sânge.

Rezultate: Am descoperit că 30 μ g/ml de ZDW au promovat proliferarea celulară a șobolanuluicelule tubulare renale. ZDW a exprimat, de asemenea, un efect protector dependent de doză împotrivagentamicina-induseapoptozaîn celule. Pretratarea cu 3 μ g/ml sau 30 μ g/ml de ZDW a crescut maxim Bcl-2 și a scăzut caspaza scindată-3 îngentamicinacelule NRK-52E tratate. Dintre ingredientele pe bază de plante ale ZDW, numai Phellodendron amurense Rupr., scoarța (Cortex Phellodendri) și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul au inhibat atâtgentamicinascăderea Bcl-2 indusă și creșterea caspazei scindate-3. Phellodendron amurense Rupr., scoarța și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul de asemenea inhibatgentamicina-induseapoptozala anumite concentrații; cu toate acestea, aceste două ingrediente au fost mai puțin eficiente decât ZDW. În modelul mouse-ului degentamicina-nefropatie indusă, tratamentul cu ZDW a redus semnificativ celulele apoptotice din cortexul renal și a îmbunătățit funcția renală.

Concluzii: Rezultatele noastre sugerează că ZDW la doze adecvate se atenueazăgentamicina-leziune apoptotică indusă încelule tubulare renaleși, de asemenea, protejeazărinichidingentamicina-leziune indusa la soareci.

1. Introducere

Medicamentele din plante au fost folosite pentru a trata diverse boli timp de multe secole, în special în societatea chineză. Recent, efectele secundare potențiale ale plantelor asuprarinichiau fost raportate (Isnard Bagnis et al., 2004). În 1991, medicii nefrologi din Belgia au raportat despre multe femei tinere care au ingerat extracte de plante chinezești conținând Aristolochia fang chi în regimuri de dietă care prezentau diferite grade de insuficiență renală (Vanherweghem și colab., 1993). Expunerea la planta Aristolochia adăugată din greșeală care conține acid aristolohic (AA) s-a dovedit a fi principala cauză a leziunii renale, atipiei celulelor uroteliale și a carcinomului (De Broe, 2012). Deoarece medicina tradițională chineză este practicată în general în Taiwan și China continentală, nefropatia AA este răspândită în aceste zone și reprezintă o potențială problemă de sănătate publică (Grollman, 2013). Majoritatea nefrologilor din Taiwan recomandă pacienților să evite medicina tradițională pe bază de plante. Cu toate acestea, unele medicamente tradiționale pe bază de plante s-au dovedit promițătoare în tratamentulrinichiboala în studii preclinice sau studii clinice (Wojcikowski și colab., 2006; Wang și colab., 2012; Zhang și colab., 2012). În timp ce evitarea utilizării plantelor Aristolochia în medicamentele pe bază de plante este esențială, medicamentele pe bază de plante sunt încă potențiali candidați pentru tratamentul anumitorrinichiboli.

Faceți clic pe Cistanche efecte pentru suprarenale

Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), o formulă pe bază de plante, a fost folosită pentru tratarea cronicilorrinichiinflamație și diabet de mii de ani. ZDW este făcut din Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8 la sută), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, coaptă (Radix Rehmanniae preparata, 27,6 la sută), Dioscorea oppositifolia L. (13,8 la sută), Phellodendron amurense Rupr., scoarță (Cortex Phellodendri, 6,9 la sută), Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom (6,9 la sută), Paeonia suffrutticose Andrews, scoarță de rădăcină (Moutan Cortex, 10,3 la sută), Alisma Plantago-Aquatica L., rizom (Rhizoma Alismatis co) 10. (Schw.) Wolf (10,3 la sută) și nu conține Aristolochia. Printre aceste ingrediente se numără Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, coaptă, Phellodendron amurense Rupr., scoarța și cocos Poria sunt raportate a fi benefice pentru nefropatia diabetică sau leziuni renale cronice la modelele animale (Yokozawa). și colab., 2004; Kim și colab., 2008; Jiang și colab., 2012; Zhao și colab., 2013). ZDW fără Anemarrhena asphodeloides Bunge și Phellodendron amurense Rupr., scoarța a avut, de asemenea, un efect de protecție parțial asupra nefropatiei diabetice precoce la șobolani (He et al., 2007). Aceste constatări sugerează că ZDW are efecte potențial de protecție împotriva leziunii renale. Cu toate acestea, influența ZDW asupra creșterii celulare șiapoptozadecelule tubulare renaleeste încă neclar.

Gentamicinăeste un antibiotic aminoglicozidic utilizat pe scară largă pentru tratarea infecțiilor bacteriene gram-negative, dar induce acutrinichileziuni la aproximativ 30% dintre pacienți (Singh și colab., 2012). In celulele tubulare proximale renale, inducandapoptozaeste un mecanism citotoxic cheie algentamicina(Servais et al., 2006).Gentamicinăinduceapoptozaprintr-o cale de semnalizare mediată de mitocondrii, inclusiv scăderea Bcl-xL și creșterea caspazei scindate-3 și -9 (Ali, 2003; Juan și colab., 2007). Până în prezent, nu există un remediu clinic ideal pentru a prevenigentamicina-induse acutărinichirănire. În acest studiu, am investigat influența ZDW asupragentamicina-induseapoptozaîncelule tubulare renalein vitro si in vivo. Datele noastre au dezvăluit efectul protector al ZDW asupragentamicina-tratatecelule tubulare renaleși a arătat în continuare contribuțiile ingredientelor sale la efectul protector al ZDW.

2. Materiale și metode

2.1. Reactivi și prepararea ZDW

Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal de vițel și reactivii de cultură de țesut au fost obținuți de la Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, SUA). Toate celelalte substanțe chimice de calitate reactiv au fost obținute de la Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, SUA). Pulberile de ZDW (lot nr. 051941) și ingredientele sale (Cornus officinalis Siebold & Zucc, lot nr. C81{0Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, coaptă, lot nr. C730N; Dioscorea oppositifolia L., lot nr. C624N; Phellodendron amurense Rupr., scoarță, lot nr. C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom, lot nr. C805N; Paeonia sufruticosa, Andrews, root bar. lotul nr. C813Y; Alisma Plantago-Aquatica L., rizom, lotul nr. C819N; Poria cocos (Schw.) Wolf, lotul nr. C827N) au fost cumpărate de la SunTen Pharmaceutical Co. (Taipei, Taiwan). Conform instrucțiunilor producătorului, 29 g din amestecul de 8-ierburi (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, coaptă, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., scoarță, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, scoarță rădăcină, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., rizom și 3 g Poria cocos (Schw.) Wolf) s-au fiert în 2290 ml. de apă distilată timp de 4 ore la 100 1C, filtrată, liofilizată pentru a da 7,5 g extracte uscate și apoi amestecată cu 2,2 g amidon de porumb și 5,3 g celuloză pulbere pentru a genera 15 g ZDW. Toate ierburile au fost verificate de un profesor de herbologie de la Institutul de Cercetare Brion din Taiwan, ROC. Exemplarele de voucher au fost depuse în Herbarul Institutului Național de Cercetare a Medicinei Chineze, Taiwan, ROC (numerele voucherului: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, copt -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. - NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., scoarță - NHP{-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom - NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, scoarță de rădăcină - NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., rizom - NHP{-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf - NHP -00309). Medicamentele pe bază de plante (0,1 g) au fost digerate cu 1 ml de lichid intestinal artificial (pancreatină 1%, fosfat dihidrogen de potasiu 50 mM, pH 7,5) la 37 1C timp de 2 ore, filtrat prin 0.22- μ m filtre și apoi aplicate în experimente cu celule. În plus, lichidul intestinal artificial a fost, de asemenea, incubat la 37 1C timp de 2 ore, filtrat prin filtre de 0,{22- μm și apoi aplicat în grupurile de control.

2.2. Analiza amprentei prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Calitatea ZDW a fost măsurată prin HPLC. Pe scurt, {{0}},1 g pulbere ZDW a fost dizolvată în apă demonică la temperatura camerei timp de 2 ore, filtrată prin filtre {{{0}}.22- μm și apoi aplicat în analiza HPLC. O sută de μ l de soluție au fost aplicate pe o coloană de 250 4,6 mm C18- (Grace. Columbia, SUA) folosind un sistem HPLC Waters echipat cu un 60{{18 }} controler și un detector cu matrice de fotodiode 996 (Waters, St. Massachusetts, SUA). Proba a fost apoi eluată cu un gradient liniar de metanol de 0-95% în apă demonică, pH 7,0, timp de 60 de minute la un debit de 0,8 ml/min. Eluenții au fost detectați și cuantificați la 254 nm de la 0 min la 60 min la temperatura camerei. Analiza a fost efectuată de 10 ori și rezultatele sunt consistente.

2.3. Cultură de celule

Am achiziționat celule tubulare proximale renale de șobolan (NRK-52E) de la Centrul de Colectare și Cercetare Bioresource (Hsinchu, Taiwan). Celulele au fost cultivate în DMEM suplimentat cu soluție de antibiotic/antifungic și 10% ser fetal bovin. Au fost crescute până când monostratul a devenit confluent. Celulele cultivate au fost apoi cultivate în mediu fără ser peste noapte înainte de experiment. Extractele ZDW din fluid intestinal artificial au fost adăugate la celulele înfometate la concentrația indicată și fluidul intestinal artificial incubat a fost aplicat ca tratament de control. După 24 de ore de incubare, probele de celule au fost recoltate și aplicateapoptozaanaliză și analiză Western blot.

2.4. Monitorizarea în timp real a proliferării celulare

Pentru a monitoriza proliferarea celulară, am folosit sistemul „xCELLigence” de la Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN, SUA). Celulele NRK-52E au fost însămânțate în duplicat în plăci E la o densitate de 10000 celule/godeu. Plăcile E au fost apoi transferate la instrumentul xCELLi-glance RTCA DP pentru monitorizare automată în timp real într-un incubator umidificat care conține 5% CO 2 la 37 1C. După 24 de ore, celulele din plăcile E au fost înfometate peste noapte. Pentru testul de proliferare, extractele ZDW au fost adăugate la celule timp de 30 de minute, apoi 3 mmol/l degentamicinaa fost adăugat la celule. Indicele celulei, o unitate arbitrară care reflectă impedanța senzorului celulei, a fost măsurat la fiecare 15 minute. Calculul pantei a fost efectuat cu software-ul RTCA versiunea 1.2 (Roche Applied Sciences). Au fost efectuate trei experimente independente.

2.5. Detectarea apoptozei

A fost utilizată colorarea dublă cu izotiocianat de fluoresceină (FITC)-anexină V/iodură de propidiu (PI) pentru a detectaapoptozaindus degentamicinatratament. Celulele NRK-52E tratate au fost recoltate și spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) rece cu gheață. Legarea specifică a FITC-anexinei V și colorată cu PI au fost efectuate utilizând unapoptozatrusa de detectare (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, SUA), conform instructiunilor producatorului. Celulele au fost apoi analizate folosind citometrie în flux.

2.6. Analiza Western blot

Douăzeci de micrograme de lizat de proteină NRK-52E au fost aplicate pe fiecare bandă a benzii de blotting și analizate prin Western blotting. Anticorpii pentru Bcl-2 și caspază-3 au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA) și diluați 1:1000 pentru analiză. Gliceraldehida 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) a fost detectată ca control al încărcării. Nivelurile relative ale benzilor de proteine ​​au fost cuantificate folosind software-ul Quantiscan (Biosoft, Cambridge, Marea Britanie).

2.7. Animale și tratamente

Șoarecii masculi BALB/c în vârstă de 8 săptămâni și cântărind 20-25 g au fost obținuți de la BioLasco Taiwan (Taipei, Taiwan). Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare experimentală a animalelor din Taipei Medical University. Animalele au fost găzduite într-o unitate centrală, supuse unui ciclu lumină-întuneric de 12-h și au fost furnizate cu mâncare obișnuită de șobolan și apă de la robinet. Grupul experimental de șoareci (n¼6) pentrugentamicinatratamentului au fost supuse injectării intraperitoneale (IP) cugentamicina(20 mg/kg/zi) timp de 10 zile. Pulberea ZDW (1 sau 2 g/kg) a fost dizolvată în soluție salină și administrată oral înainte degentamicinainjectare de fiecare dată. Șoarecilor din grupul de control (n¼6) li s-a administrat ser fiziologic pe cale orală și intraperitoneală. Toți șoarecii au fost anesteziați utilizând pentobarbital 30-50 mg/kg greutate corporală intraperitoneal (Sigma, St. Louis, MO) la 1 zi după ultima lor injecție. Animalele au fost apoi sacrificate în timp ce erau încă sub efectul anesteziei și au fost colectate probe de sânge din inimă pentru măsurarea creatininei serice și a azotului ureic din sânge. Therinichiau fost recoltate prin laparotomie, iar țesutul cortexului renal a fost congelat rapid în azot lichid și depozitat la-80C.

2.8. Test in situ de deoxinucleotidil transferază mediată de biotinilate UTP nick end labeling (TUNEL)

Secțiuni de țesut înghețat (4 μ m) alerinichiau fost procesate cu ApopTag Fluorescein in situapoptozakit de detectare (CHEMICON International, Inc., CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Scurt,rinichilamele de țesut au fost pretratate cu proteinază K și H₂O₂și incubat cu amestecul de reacție care conține deoxinucleotidil transferază terminală (TdT) și dUTP conjugat cu digoxigenină timp de 1 oră la 37 1C, montat cu o soluție de montare care conține PI și, în final, observat cu microscopie cu fluorescență.

2.9. analize statistice

Datele sunt prezentate ca media7 abateri standard (SD). Analizele statistice au fost efectuate folosind testele t Student, unde P 0.05 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

3. Rezultate

3.1. Influența ZDW asupra proliferării celulare

Pentru controlul calității ZDW, am folosit HPLC pentru a stabili cromatograma amprentei așa cum se arată în Fig. 1. Am investigat mai întâi influența extractelor ZDW asupra proliferării celulelor NRK-52E. Pentru a imita mediul gastrointestinal, ZDW a fost digerat și extras folosind lichid intestinal artificial și apoi aplicat în experimente cu celule.

În monitorizarea în timp real a proliferării celulare, atât curbele de proliferare, cât și pantele au arătat că celulele tratate cu 30 μ g / ml de ZDW au avut rate de proliferare mai mari în comparație cu celulele martor tratate cu fluid intestinal artificial (Fig. 2A și B). În schimb, 300 μ g/ml de ZDW au redus semnificativ ratele de proliferare. Doza de 30 μ g/ml ZDW conține 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, copt, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., scoarță, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, scoarță rădăcină, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., rizom și 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Wolf. Cu toate acestea, aceste doze de ingrediente au redus în schimb proliferarea celulelor NRK-52E (Fig. 2C).Gentamicinăa inhibat semnificativ creșterea celulelor și chiar a scăzut indicele numărului de celule, care s-a recuperat parțial cu tratamentul cu 3 sau 30 μ g/ml de ZDW, așa cum se arată în Fig. 2A. Dozele mari de ZDW (300 μ g/ml) au crescut și mai mult efectul inhibitor algentamicinaasupra capacităţii de proliferare celulară. Rezultatele noastre sugerează că ZDW în doză mică (3–30 g/ml) promovează proliferarea celulelor NRK-52E, chiar și în prezențagentamicinatratament.

3.2. Influența ZDW asupra apoptozei

Apoi am evaluat influența extractelor ZDW asupragentamicina-induseapoptozaîn celulele NRK{{0}}E prin colorarea anexinei V/PI și citometrie în flux. După cum se arată în Fig. 3, extractele ZDW de la 0,3 la 300 μ g/ml nu au indus semnificativapoptozaîn celulele NRK-52E. Expunerea la 3 mmol/l degentamicinacelule apoptotice semnificativ crescute. Pretratarea celulelor cu ZDW a scăzut semnificativgentamicina-induseapoptozaîntr-o manieră dependentă de doză, iar efectul inhibitor a atins vârful la 30 μ g/ml și a scăzut la 300 μ g/ml de ZDW (Fig. 3).

Extrasul ZDW a protejat celulele NRK-52E degentamicina-induseapoptoza. Pentru a confirma acest rezultat, am monitorizat și influența ZDW asupra căii de semnalizare apoptotică indusă degentamicina. În celulele E normale NRK{{{0}}, concentrațiile ZDW de la 0,3 la 300 μ g/ml nu au influențat semnificativ expresia Bcl{{-2 și clivajul caspazei-3 (Fig. . 4).Gentamicinătratamentul a redus semnificativ expresia Bcl-2 și a indus scindarea caspazei-3 în celulele NRK{-52E. Pretratarea celulelor cu ZDW a îmbunătățit expresia Bcl-2 îngentamicina-celule tratate, si redus semnificativgentamicina-clivajul caspazei-3 indus (Fig. 4).

3.3. Influența ingredientelor ZDW asupra apoptozei

Rezultatele au arătat că cea mai eficientă concentrație de ZDW a fost aproape de 30 μ g/ml. Teoretic, 30 μ g/ml ZDW conţine 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, copt, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., scoarță, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, scoarță rădăcină, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., rizom și 3 μ g/ml Poria cocos. Cu toate acestea, extractele acestor ingrediente la concentrațiile indicate nu au influențat proliferarea celulelor NRK-52E, așa cum a evidențiat monitorizarea în timp real a proliferării celulare (datele nu sunt afișate). Am monitorizat în continuare ingredientele ZDW separat pentru efectele lor asupra expresiei clivajului Bcl-2 și caspazei-3gentamicinacelule NRK-52E tratate. Fig. 5 arată că Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., rădăcină, copt, Dioscorea opus, Paeonia suffrutticose Andrews, scoarță de rădăcină, Alisma Plantago-Aquatica L., rizom și Poria cocos nu au influențat expresia Bcl-2 și clivajul caspazei-3 îngentamicina-celule tratate. Doar 0.2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., scoarța și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul la 4 și 60 μ g/ml le-au inhibat pe ambelegentamicinascăderea Bcl-2 indusă și clivajul caspazei-3 crește în același timp (Fig. 5).

Similar cu rezultatele Western blotting, colorarea cu anexină V/PI a arătat că Phellodendron amurense Rupr., scoarța la 0,2 μ g/ml și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul la 4 și 60 μ g/ml au inhibat semnificativgentamicina-induseapoptoza(Fig. 6). Celelalte ingrediente din plante nu au exprimat un efect antiapoptotic asupragentamicina-celule NRK-52E tratate, așa cum a fost evidențiat prin citometrie în flux (datele nu sunt afișate). ZDW conține 6,9 ​​la sută Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom. Doza de 60 μ g/ml de Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma a fost cu mult peste cantitatea conținută în 300 μ g/ml de ZDW, care a fost cea mai mare doză utilizată în acest studiu. Phellodendron amurense Rupr., doza de scoarță de 0,2 μ g/ml a fost similară cu cantitatea de Phellodendron amurense Rupr., scoarță conținută în 3 μ g/ml de ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, doza de rizom de 4 μ g/ml a fost apropiată de cantitatea de Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom conținut în 30 μ g/ml de ZDW. Concentrațiile ZDW de 3 și 30 μ g/ml au avut efecte anti-apoptotice semnificative (Fig. 2), care pot rezulta parțial din Phellodendron amurense Rupr., scoarță și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom.

3.4. Efectul protector al ZDW asupra rinichilor

Efectul protector al ZDW asupragentamicina-induseapoptozaa fost demonstrat în continuare într-un model animal de șoarece. Șoarecii au fost tratați cugentamicina(20 mg/kg/zi) sau ser fiziologic ca martori; loturile experimentale au fost tratate cu ZDW (1 sau 2 g/kg/zi) în plus. La sfârșitul perioadei de tratament (9 zile),rinichiau fost recoltate prin laparotomie și secționate pentru teste TUNEL in situ. După cum se arată în Fig. 7, nucleele înrinichisecțiunile au fost dezvăluite ca pete luminoase colorate cu PI. Nucleii împrăștiați și strălucitori colorați de TUNEL au putut fi detectați pe întreg cortexul renal îngentamicina-animale tratate, dar acestea au fost rareori detectate în specimenele de control. Tratamentul ZDW redusgentamicina-nuclee apoptotice induse într-o manieră dependentă de doză. Majoritatea nucleelor ​​marcate cu TUNEL au fost observate în epiteliul tubului proximal. ZDW a inhibat in vivogentamicina-celula indusaapoptozala şobolancelule tubulare renale. Funcția renală a șoarecilor experimentali a fost de asemenea monitorizată prin măsurarea concentrației de azot ureic din sânge și a creatininei serice.

Fig. 8 arată că concentrațiile de azot ureic din sânge și creatinina serică au fost crescute îngentamicina-grupurile tratate, iar tratamentul cu ZDW le-a inhibat semnificativgentamicina-cresteri induse. Aceste rezultate sugerează că ZDW exprimă un efect protector renal in vivo.

4. Discutie

În acest studiu, ne-am concentrat asupra efectului ZDW asupragentamicina-induseapoptozala şobolan proximalcelule tubulare renale. Principalele constatări au arătat că ZDW (3 și 30 μ g/ml) sa atenuatgentamicina-leziune apoptotică indusă în celulele NRK-52E (Fig. 3). Pretratamentul ZDW a fost, de asemenea, inhibatgentamicina-semnalele apoptotice induse, inclusiv scăderea Bcl-2 și creșterea clivajului caspazei-3 (Fig. 4). Într-un model de mouse degentamicinatoxicitate, tratamentul cu ZDW a redus semnificativ celulele apoptotice din cortexul renal și a îmbunătățit funcția renală (Fig. 7 și 8). Rezultatele noastre sugerează că ZDW protejeazăcelule tubulare renaledingentamicina-induseapoptoza. În plus, am constatat, de asemenea, că 30 μ g/ml ZDW a promovat proliferarea celulelor NRK- 52E (Fig. 2), care ar putea contribui la recuperarea tubilor renali dinacutrinichiboala. Cu toate acestea, doza mare de ZDW (300 μ g/ml) a redus proliferarea celulară și, de asemenea, efectul său antiapoptotic a scăzut (Fig. 2 și 3). Aceste rezultate arată că ZDW la doze mari este citotoxică pentrucelule tubulare renale. Prin urmare, sugerăm că administrarea de ZDW în doze adecvate ar fi benefică pentru pacienții cugentamicina-induserinichirănire.

Medicamentele pe bază de plante utilizate în experimentele cu celule au fost digerate și extrase folosind lichid intestinal artificial care conține pancreatină. Pancreatina este compusă din amilază, lipază și protează. În principiu, moleculele bioaccesibile din medicamentele pe bază de plante pot fi obținute folosind o extracție de laborator care imită mediul gastrointestinal în detalii precum substanțele chimice și enzimele prezente, temperatura, timpii de expunere și pH-ul. În sistemul nostru,celule tubulare renalea avut șansa de a interacționa cu moleculele bioaccesibile din medicamentele pe bază de plante, dar nu cu materiile prime. Moleculele bioaccesibile eficiente ale ZDW din sistemul nostru sunt încă necunoscute. Detectarea absorbției ZDW încelule tubulare renaleeste dificil până acum, deoarece nu există o țintă potrivită de monitorizat. Cu toate acestea, extractele intestinale artificiale de ZDW au exercitat un efect dependent de doză în experimentele celulare. Aceste experimente sugerează că extractele intestinale artificiale de ZDW conțin molecule eficiente bioaccesibile care acționează asupra celulelor tubulare renale. Pe de altă parte, ZDW orală a exprimat, de asemenea, în funcție de doză, efectul protector renal îngentamicina-soareci tratati (Fig. 7 si 8). Aceste date implică faptul că moleculele eficiente ale extractelor intestinale artificiale de ZDW pot exista și înrinichide șoareci tratați cu ZDW. Rezultatele noastre arată o consistență farmacologică între studiile celulare cu extracte intestinale artificiale de medicamente pe bază de plante și studiile pe animale cu medicamente pe bază de plante orale. Aplicarea fluidelor intestinale artificiale în studiile celulare este disponibilă recent. În celulele Caco-2, fluidele intestinale artificiale au fost folosite pentru a investiga caracteristicile de absorbție celulară ale L-valyl-ara-C (Cheon și colab., 2006). Biodisponibilitatea orală a contaminanților din sol a fost măsurată in vitro folosind fluide intestinale artificiale (Ellickson și colab., 2001). Bioaccesibilitatea arsenicului în diferite tipuri de orez a fost, de asemenea, studiată folosind un sistem de fluid gastrointestinal in vitro (He et al., 2012). Extracția gastrointestinală artificială a dat rezultate într-un acord rezonabil cu măsurătorile clinice ale biodisponibilității arsenului măsurate prin analiza urinei la oameni adulți după ingestia de medicină tradițională chineză care conține arsenic (Koch și colab., 2007). În plus, pancreatina din lichidul intestinal artificial va fi autodigerată și își va pierde activitatea enzimatică în timpul incubării 37 1C. Concentrația de pancreatină în experimentele cu celule a fost, de asemenea, foarte scăzută (0,3 30 ppm). Influența pancreatinei asupra proliferării celulare șiapoptozaeste foarte limitat. Sugerăm că extracția artificială a fluidului intestinal este una dintre metodele de extracție ideale pentru medicamentele tradiționale din plante în experimentele de cultură celulară.

Printre ingredientele pe bază de plante ale ZDW, doar Phellodendron amurense Rupr., scoarță și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizom inhibatgentamicina-induseapoptozala anumite concentrații (Fig. 5 și 6). Phellodendron amurense Rupr., scoarța și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul ar trebui să joace un rol în efectul protector al ZDW în celulele NRK-52E. Phellodendron amurense Rupr., scoarța conține o serie de alcaloizi, cum ar fi berberina, palmatina și jatrorrhizine. Phellodendron amurense Rupr., scoarța este un agent antiinflamator cunoscut (Mori și colab., 1995; Uchiyama și colab., 1989) și reduce stresul oxidativ înrinichide șobolani diabetici (Kim și colab., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge este utilizat pe scară largă în medicamentele tradiționale chineze. Rizomii Anemarrhena asphodeloides Bunge au activități antidiabetice, antiagregante plachetare și diuretice (Takahashi și colab., 1985). Timosaponinele izolate din rizomii Anemarrhena asphodeloides Bunge suprimă agregarea trombocitară și generarea de superoxid indusă de AA în neutrofilele umane (Zhang și colab., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge joacă, de asemenea, un rol protector crucial în leziunile cerebrale induse de ischemie (Oh și colab., 2007). Spre deosebire de ZDW, Phellodendron amurense Rupr., scoarță și Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizomul a exprimat efecte anti-apoptotice într-un interval limitat de concentrații (Figurile 3 și 6). În plus, 30 μ g / ml ZDW a promovat proliferarea celulară, dar toate ingredientele din 30 μ g / ml ZDW au redus în schimb proliferarea celulară (Fig. 2C). Acest rezultat sugerează că efectul de promovare a proliferării al ZDW poate să nu rezulte din ingredientele sale individual. Efectul protector al ZDW ar putea rezulta, cel puțin parțial, din efectele sinergice cauzate de ingrediente sau din generarea de molecule modificate formate în procesele de combinare farmaceutică ale ZDW. În mod tradițional, mulți practicieni de medicină chineză cred că o formulă pe bază de plante este de obicei mai eficientă decât un singur medicament pe bază de plante, ceea ce este susținut de rezultatele noastre.

În acest studiu,gentamicinaconcentrația aplicată în experimentele de cultură celulară a fost similară cu studiile publicate anterior (Juan și colab., 2007).Gentamicinăconcentraţii de 1–3 mmol/l induse efectivapoptozaîncelule tubulare renale, iar acest interval de concentrație este apropiat de cel in vivorinichiniveluri constatate în timpulgentamicinatratamente antimicrobiene la șoareci și șobolani (El Mouedden și colab., 2000a, 2000b; Sandoval și Molitoris, 2004; Servais și colab., 2005). Cu alte cuvinte, celgentamicinaconcentrațiile utilizate în acest studiu in vitro au fost similare cu concentrațiile găsite la șoarecerinichiin vivo în timpulgentamicinatratament. În experimentul nostru cu șoarece,gentamicinaa fost administrat la 20 mg/kg intraperitoneal o dată pe zi, șigentamicina-induseapoptozaa fost observată la șoarecerinichi(Fig. 7). Această doză este sugerată ca doze de întreținere egale pentru un pacient adult cu un clearance estimat al creatininei de 90 ml/min (El Mouedden și colab., 2000a). În plus, doza de protecție a ZDW a fost de 1 până la 2 g/kg/zi în acest studiu. Un șoarece este de 7 până la 8 ori mai puțin eficient din punct de vedere metabolic decât un om. Având în vedere diferența dintre ratele metabolice ale șoarecilor și ale oamenilor, doza ZDW în studiile pe animale este aproape de aplicarea tradițională a ZDW la om. Aceste descoperiri oferă baza pentru investigații viitoare la om.

Semnalizarea apoptotică dependentă de caspază joacă un rol cheie îngentamicina-induseapoptoza. În calea mitocondrială, caspaza-3 este o caspază de călău care poate fi scindată la activ de către caspază-9 care este activată din procaspază-9 de către citocromul c citosolic (Padanilam, 2003; Jiang și Wang , 2004). Eliberarea mitocondrială a citocromului c este reglată de proteinele familiei Bcl-2 care se leagă de membrana exterioară mitocondrială și blochează efluxul citocromului c (Yang și colab., 1997). În studiul nostru,

gentamicinaa crescut clivajul caspazei-3 și a redus expresia Bcl-2 în celulele NRK{-52E. Aceste fenomene apoptotice mediate de mitocondrii au fost inversate prin tratamentul ZDW. Pe baza constatărilor acestui studiu, am sugerat că ZDW protejeazăcelule tubulare renaledingentamicina-leziune apoptotică indusă prin inhibarea căii mitocondriale.

5. Concluzii

În rezumat, ZDW în doze adecvate a promovat proliferarea celulară și a inhibatgentamicina-induseapoptozala şobolancelule tubulare renale. ZDW reduce, de asemeneagentamicina-toxicitate renală indusă in vivo. ZDW ar putea avea potențial terapeutic pentru pacienții cugentamicina-induserinichirănire.

Mulțumiri

Acest studiu a fost sponsorizat de Biroul pentru Promovarea Sănătății, Departamentul de Sănătate, ROC (DOH98-HP-1106).