Cum afectează factorul de creștere transformator B1 (TGF 1) fibroza renală
Mar 18, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
Inhibarea semnalizării factorului de creștere transformator b1 în celulele interstițiale rezidente atenuează expresia genei profibrotice și păstrează producția de eritropoietină în timpul fibrozei renale experimentale la șoareci
Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker și colab.
Fibroza rinichilorse caracterizează prin dezvoltarea miofibroblastelor provenite din rinichi rezidenți și celule imigrante. Formarea miofibroblastelor și producția de matrice extracelulară în timpul afectarii rinichilor sunt declanșate de diferite citokine. Printre acestea,factor transformator de creștere B1(TGF 1) este considerat un declanșator central pentrufibroza renala. Am găsit o expresie puternic reglată a TGF 1(factor transformator de creștere B1)și ARNm a receptorului TGF 2 (TGF -R2) în celulele interstițiale renale în experimentefibroză. Aici, am investigat contribuția TGF 1(factor transformator de creștere B1) semnalizarea în celulele interstițiale renale rezidente către fibroza de organ folosind modelele de nefropatie indusă de adenină și ocluzie ureterală unilaterală la șoareci. În acest scop, semnalizarea TGFB1 a fost întreruptă prin ștergerea inductibilă a genei TGF-R2 în celulele interstițiale care exprimă receptorul-B a factorului de creștere derivat din trombocite marker fibroblast. Expresia genelor profibrotice a fost atenuată cu până la 50 la sută în rinichii lipsiți de TGF-R2 în celulele pozitive pentru receptorul B al factorului de creștere derivat din trombocite. În plus, ștergerea TGF-R2 a prevenit scăderea producției de eritropoietină în rinichii ligați cu ureter. În special, expresia asociată cu fibroză a actinei x-muschiului neted ca marker de miofibroblast și depozitele de colagen extracelular nu au fost modificate la șoareci cu ștergerea țintită a TGF-R2. Astfel, descoperirile noastre sugerează un efect de îmbunătățire al TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalizare în celulele interstițiale rezidente care contribuie la expresia genei profibrotice și la reglarea în jos a producției de eritropoietină, dar nu la dezvoltarea miofibroblastelor în timpulfibroza renala.
Click pentru cistanche pudra beneficii pentru sănătate pentru boli de rinichi
Dezvoltarea și progresulfibroza renalaeste un semn distinctiv al bolii cronice de rinichi. Este considerată în mod obișnuit ca rezultatul unei producții și depuneri crescute de proteine din matricea extracelulară (ECM), cum ar fi colagenul, fibronectina sau tenascinele. În curs de desfășurarefibroza renaladuce la o scădere progresivă a funcției glomerulare și tubulare și, de asemenea, restrânge funcțiile endocrine ale rinichilor, rezultând o producție insuficientă de eritropoietină (EPO) care duce la anemie.-y
Printre citokinele și factorii de semnalizare care sunt implicați în bolile de rinichi șifibrozăprogresie,factorul de creștere transformator 1(TGF 1) a fost studiat în diverse modele.6.0-1 TGF 1(factor transformator de creștere B1)se leagă de receptorul TGF 2 (TGF-R2). Formarea unui complex heteromeric cu receptorul TGF 1 este esențială pentru activarea intracelulară a cascadei de semnalizare SMAD. i.1-18 În rinichii afectați, expresie crescută a TGF 1(factor transformator de creștere B1)ARNm în diferite tipuri de celule renale a fost raportat.1517,19-2lUn rol important al TGF 1 înrinichifibrozăa fost, de asemenea, delimitat din constatările că administrarea de TGF 1 exogen(factor transformator de creștere B1)poate inducefibroza renalași că TGF 1(factor transformator de creștere B1)anticorpii se pot atenua indus experimentalfibroză,10.22-24În plus, ștergerea genetică a Smad2 sau 3, efectorii intracelulari ai TGF-R2, a demonstrat efecte pozitive asupra dezvoltăriifibroză.1,1
Expresia TGF-R2 a fost raportată în multe tipuri de celule, limitând astfel valoarea informativă precisă a constatărilor obținute cu interferența generală a TGF 1 global.(factor transformator de creștere B1)semnalizare. Acest lucru poate explica, de asemenea, unele dintre rapoartele controversate din ultimii ani.1.1.2 TGF 1(factor transformator de creștere B1)a fost, de asemenea, raportat că promoveazărinichi fibrozăprin sporirea infiltrației macrofagelor, care se pot transdiferenția în miofibroblaste.
Cu toate acestea, rolul central al TGF 1(factor transformator de creștere B1)înrinichifibrozăa fost contestată recent prin constatarea cărinichifibrozănu este redusă prin blocarea TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalizare în celulele care produc în mod activ proteine de matrice. Este bine stabilit că producția crescută de proteine din matrice este derivată în principal din miofibroblaste, care se pot transdiferenția de la mai multe tipuri de celule, inclusiv fibroblaste, monocite, pericite și celule tubulare și endoteliale.6,10,2-32 Contribuția relativă a aceste tipuri de celule la populația de miofibroblasti pot varia în funcție de modelul experimental. Cu toate acestea, consensul tot mai mare este că fibroblastele rezidente, pericitele și celulele derivate din măduva osoasă sunt principalii precursori ai miofibroblastelor în rinichi și contribuie larinichifibrozăîntr-o proporție similară..102933-35 Fibroblastele și pericitele rezidente exprimă receptorul factorului de creștere derivat din trombocite (PDGFR-) și sunt unul dintre cei mai,31,36. Un studiu recent, de asemenea, numeroase tipuri de celule în rinichi. au confirmat celulele PDGFR-f ca principalii precursori ai miofibroblastelor din rinichii umani. Aceste celule PDGFR-f includ, de asemenea, toate celulele renale capabile să producă EpO,-9
Rinichi fibrozăeste asociată cu o capacitate redusă a rinichilor de a produce EPO.-,3,0 Deși motivele pentru aceasta nu au fost clar rezolvate, se crede că transformarea celulelor interstițiale PDGFR- plus în miofibroblaste are loc. mână în mână cu pierderea capacității lor de a produce EPO. Având în vedere rolul major al celulelor interstițiale PDGFR-B ca producători nativi de EPO și ca precursori ai miofibroblastelor, am fost interesați să definim rolul TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalizare în această populație celulară.
În acest scop, am generat un model de șoarece cu deleția inductibilă de tamoxifen a TGF-R2 în celulele PDGFR- plus (PDGFR-CeERT7 plus TGF-R2/, denumit în continuare șoareci TGF-R2ko). După ștergerea TGF(factor transformator de creștere)-R2 în PDGFR- plus celule la șoareci adulți, animalele au fost studiate în 2 modele experimentalerinichifibroză: ocluzie ureterală unilaterală (UUO) și nefropatie indusă de adenină (AN). Nefropatia indusă de adenină este un model de deteriorare cronică cu paralele puternice cu patologiile induse de cristale umane, în timp ce UUO este un model de deteriorare acută pentru stresul mecanic. ARNm țintă și marker până la o rezoluție cu o singură celulă. În aceste modele patologice, au fost examinate efectele deleției TGFB-R2 în celulele PDGFR-f asupra expresiei actinei (a-SMA) a mușchiului neted d ca marker pentru formarea miofibroblastelor. În plus, am investigat expresia genei profibrotice și depunerea ECM. Capacitatea rinichilor de a produce EPO în stări experimentalerinichi fibrozăa fost evaluată prin măsurători ale nivelurilor plasmatice de EPO și numărul și localizarea celulelor care exprimă ARNm EPO în rinichii afectați.
METODE
animale
Șoarecii TGF-R2lo au fost generați prin încrucișarea șoarecilor PDGFR-cexr2 (expresia recombinazei Cre inducibilă de tamoxifen sub controlul promotorului PDGFR-; stoc JAX #029684) și microfon cu TGF-frank loxP6- Alele R2 (stock IAX #012603) într-un fundal mixt C57BJ/6 și 129S1/SvmJ.” Pentru urmărirea descendenței, un reporter fluorescent dublu a interpretat mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm/; Stock JAX #007676) a fost crescut la șoareci TGF -R2ko. Genotiparea a fost efectuată folosind primerii enumerați în tabelul 1. Littermates negativi pentru Cre au fost utilizați ca animale martor. Animalele au fost menținute pe mâncare standard pentru rozătoare (0,6% NaCl; Ssniff) cu hrană liberă. acces la apa de la robinet.Toate experimentele pe animale au fost efectuate conform Ghidului pentru ingrijirea si utilizarea animalelor de laborator publicat de National Institutes of Health din SUA si aprobat de comitetul local de etica.
Tratamentul cu tamoxifen
Recombinarea Cre a fost indusă prin hrănirea unei diete care conține 400 mg de citrat de tamoxifen per kilogram (A115T00404, Sniff) timp de 4 săptămâni, urmată de o perioadă de 3-săptămână cu mâncare standard. Excizia genei TGF-R2 floxate a fost confirmată prin reacția în lanț a polimerazei,
Nefropatie indusă de adenină
indusă de adeninăfibrozăa fost generat la șoareci adulți. După tratamentul cu tamoxifen și următoarea perioadă de odihnă, șoarecii masculi au fost hrăniți cu o dietă care conținea adenină (0,2 la sută) în mod continuu timp de 3 săptămâni. Experimentele au fost efectuate după exact 3 săptămâni (3-săptămâna adenină).
Hibridarea in situ prin RNAscope
Localizarea expresiei ARNm a fost studiată cu kitul RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics ACD) conform instrucțiunilor producătorului. Rinichii au fost fixați prin perfuzie cu soluție tampon neutră de formol 10%, deshidratați într-o serie de etanol și încorporați în parafină. Semnalele de hibridizare au fost detectate pe sediții de țesut 5-μm folosind fluoroforii TSA Plus Cy3 și Cy5 (PerkinElmer). Feliile au fost montate cu ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și vizualizate cu un microscop Axio Observer Z1 (Zeiss). Controalele pozitive și negative au fost incluse în mod obișnuit. Sondele ARNsape sunt enumerate în Tabelul 2
Tabelul 1|Secvențe de primer utilizate pentru genotiparea șoarecilor
REZULTATE
TGF 1(factor transformator de creștere B1)și TGF(factor transformator de creștere)Expresia -R2 în celulele interstițiale este îmbunătățită în timpul bolii renale experimentale
Localizarea exprimării ARNm TGFB1 și TGFB-R2 în rinichi în condiții bazale și în timpul experimentuluifibrozăa fost realizată prin hibridizare in situ RNAscope. În condiții bazale, expresia ARNm TGFB-R2 a fost detectată în celulele tubulointerstițiale PDGFR-B în toate zonele rinichilor și în celulele mezangiale glomerulare (Figura 1, stânga). TGF-R2 a fost de asemenea detectat în tubii proximali; expresia în alte segmente tubulare a fost mai mică (Figurile suplimentare S1 și S2).
Tabelul 2|Sonde RNAscope utilizate pentru hibridizarea in situ
TGFb1(factor transformator de creștere B1)ARNm a fost localizat în celulele interstițiale PDGFR-b+ în toate zonele renale și în celulele mezangiale glomerulare (Figura 1). Tubulii au părut negativi pentru ARNm TGFb1. Aceasta implică celulele PDGFR- plus ca principal site de expresie pentru TGF 1(factor transformator de creștere B1)în rinichi în condiţii bazale.
Tabelul 3|Secvențe de primer utilizate pentru o reacție cantitativă a polimerazei în lanț
După 3 săptămâni cu o dietă cu adenină (AN) sau 5-zi UUO, TGF renal 1(factor transformator de creștere B1)și nivelurile de expresie ARNm TGF -R2 au fost puternic crescute la șoarecii martor (Figura 2).
Expresie crescută a TGF 1(factor transformator de creștere B1)și TGF -R2 după ce AN sau UUO a fost localizat prin RNAscope. Prin colocalizarea markerilor specifici tipului de celule, am putut identifica tipurile de celule renale care prezintă o reglare ascendentă a TGF-R2 în timpul leziunii renale (Figura 3; Figurile suplimentare S2 și S3). În AN, expresia ARNm TGF-R2 a fost puternic crescută în PDGFR- interstițial. plus celule din zonele fibrotice (Figura 3a). Tubulii deteriorați cu o expresie crescută a TGF-R2 au apărut cu epiteliul aplatizat și au fost înconjurați de celule PDGFR- plus cu TGF-R2 și TGF 1 puternic.(factor transformator de creștere B1)Semnale ARNm (Figura 3a și c, săgeți; Figura suplimentară S2). Tubulii cu semnale TGF -R2 crescute au prezentat TGF 1 de novo(factor transformator de creștere B1)Expresia ARNm (Figura 3c; Figura suplimentară S3).
În rinichii UUO, semnalele crescute pentru ARNm TGF -R2 au fost detectate în celulele interstițiale ale medulei exterioare rămase (Figura 3b) și cortex (Figura suplimentară S2). Aceste celule PDGFR- plus au prezentat, de asemenea, semnale crescute pentru TGF 1(factor transformator de creștere B1)(Figura 3d).
În rezumat, aceste constatări au sugerat o activare robustă a TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalizare între celulele interstițiale PDGFR- plus și tubulii deteriorați în timpul leziunii renale experimentale.
Figura 1|Expresia bazală a ARNm a factorului de creștere transformator b (stânga) receptor 2 (TGFb-R2) și (dreapta) a factorului de creștere transformator b1 (TGFb1) pe secțiuni de rinichi ale șoarecilor de tip sălbatic.
Deleția inductibilă a TGF-R2 în celulele PDGFR- plus atenuează expresia genei profibrotice în timpul bolii renale experimentale
Pentru a analiza relevanța TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalând funcția celulelor PDGFR- plus, am examinat șoareci adulți TGF -R2ko. Expresia bazală a TGF 1(factor transformator de creștere B1)a fost neschimbată după ștergerea TGF-R2 în celulele interstițiale ale rinichilor (Figura 2). Expresia ARNm TGF-R2 a fost redusă semnificativ la animalele knockout (Figura 2). Expresia reziduală s-a datorat exprimării tubulare a TGF-R2 (Figura 1). Morfologia rinichilor nu a fost diferită la șoarecii TGF-R2ko timp de până la 8 săptămâni după ștergerea TGF-R2.
Creșterea observată a expresiei TGF-R2 în timpul AN și UUO a fost redusă semnificativ în rinichii TGF-R2ko în comparație cu rinichii de control (Figura 2). TGF 1(factor transformator de creștere B1)expresia a fost redusă semnificativ numai după AN.
Un studiu histologic al SMAD3 fosforilat a arătat o translocare redusă a factorului de transcripție în nucleul celulelor interstițiale a-SMA la animalele TGFb-R2ko, indicând semnalizarea TGFb1 perturbată după ștergerea cu succes a TGFb-R2 mediată de Cre (Figura 4).
Figura 2|Factor de creștere transformator b1 (TGFb1) și receptorul TGFb 2 (TGFb-R2) abundență de ARNm în rinichii de control și rinichii cu ștergere inductibilă de tamoxifen a TGFb-R2 în celulele pozitive ale receptorului b-pozitiv al factorului de creștere derivat din trombocite (TGFb-R2ko) sub bazal si conditii patologice.
Deleția inductibilă a TGFb-R2 în celulele PDGFR-bD atenuează expresia genei profibrotice în timpul bolii renale experimentale
Pe parcursulfibroză, producția de componente ale matricei este îmbunătățită, ceea ce duce la depunerea extinsă de ECM și formarea de cicatrici. Pentru a evalua rolul posibil al TGF 1(factor transformator de creștere B1)semnalizarea în celulele rezidente PDGFR-Bf pentru producția de matrice, am comparat expresia genică a markerilor fibrotici între șoarecii de control și TGF -R2ko.
Hrănirea cu adenină și UUO au dus la o creștere de -25-ori a ARNm de Collal în rinichii de control. În timp ce în rinichii TGF -R2ko, creșterile ARNm de guler au fost reduse cu -50 procente în comparație cu martorii (Figura 5). Hrănirea cu adenină și UUO au condus, de asemenea, la creșteri marcate ale ARNm de colagen 3al și fibronectină. Creșterile ambelor ARNm au fost, de asemenea, semnificativ atenuate în rinichii TGF-R2ko.
CLICK AICI PENTRU PARTEA Ⅱ
REFERINȚE
1. Schimdf C. Duffield JS.Mecanisme alefibroză: roke pericitului. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.
2. Neelisetty S, Aford C Reynalds K, et al. Renalfibrozănu este redusă prin blocarea semnalizării factorului de creștere transformator în celulele interstițiale producătoare de matrice. Rinichi Int. 201588:503-514.
3. Bülow RD, Boor P.Extracellularmatrix infibroza renala: mai mult decât o schelă. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.
4. Humphreys BD.Mechanisms of renal fibrosis.Annu Rey PhysioL201880: 309-326.
5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG, et al. Răspunsul interstițial la celulele asemănătoare fibroblastelor leziunii renale prezintă modificări fenotipice și au un potențial redus de exprimare a genei eritropoietinei. Rinichi Int. 1997;52.715-724.
6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT și colab.Plasticitatea celulelor producătoare de eritropoietină renală guverneazăfibroză. J Am Soc Nephrol,2013;24:1599-1616.
7. Babit 儿L, Lin HY.Mecanismele anemiei în CKD.JAm Soc Nephrol. 2012:23:1631-1634.
8. Eschbach JW, Adamson JW.Anemia of end-stage renal disease (IRST). Rinichi Int. 1985;28:1-5.
9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J, și colab. Diferite subpopulații de celule interstițiale renale produc eritropoietină și factori care susțin oxigenarea țesuturilor ca răspuns la hipoxie în Vivo.Kidney Int. 2020;98:918-931.
10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R și colab. Origini diverse ale miofibroblastului - implicații pentrufibroza renala. Nat Rey Nephrol. 2015;11:233-244.
Notă: cele de mai sus nu reprezintă o listă completă de referințe
