HPLC Fingerprinting and Spectrum-antitumoral Effect Relation for discrimination between Mylabris Phalerata Pallas and Mylabris Cichorii Linnaeus

Contact: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Școala de Farmacie, Universitatea de Medicină Zunyi, Zunyi, China,

2 Laboratorul cheie de farmacologie de bază al Ministerului Educației și Laboratorul Internațional Comun de Cercetare de Etnomedicină al Ministerului Educației, Universitatea de Medicină Zunyi, Zunyi, Guizhou, China.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, China, 4Guizhou Provincial College-based Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, China.

Click aici pentru a obține mai multe informații despre Cistanche antitumoral

Repere

Acest studiu oferă o metodă HPLC aplicabilă, credibilă și mai eficientă pentru discriminarea a două specii de Mylabris. Și, amprentarea HPLC și spectrul-efecte antitumoraleau fost integrați și cei trei markeri diferențiali importanți au fost găsiți pentru un nou marker de Mylabris.

Abstract

Obiectiv: Evaluarea discriminării între două specii de Mylabris pe baza amprentelor HPLC și a spectrului.efect antitumoralrelaţie. Metode: În acest studiu, o metodă simplă și eficientă de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) care se integrează cu analiza chimiometrică și spectrul-efect antitumoralRelația a fost dezvoltată pentru discriminarea între două specii de Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) și Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Rezultate: În analiza amprentei, au fost selectate 14 vârfuri caracteristice pentru a evalua diferențele dintre MP și MC folosind analiza de similitudine și recunoaștere a modelelor folosind PCA și OPLS-DA. Cromatogramele HPLC ale probelor din 10 regiuni ale Chinei au arătat diferențe între MP și MC și s-au găsit 7 markeri chimici caracteristici. În spectru-efect antitumoralanaliza relației, 4 markeri de activitate au jucat un rol vital în scăderea IC50 și ar putea fi componentele antitumorale ale Mylabris prin analiza relațională gri și analiza regresiei liniare multivariată. Analiza chimiometrică în combinație cu rezultatele relației spectru-efect au indicat că vârfurile 2 (citozină), 4 (necunoscută) și 14 (necunoscută) au fost markeri diferențiali importanți pentru distingerea celor două specii de Mylabris.

Concluzie: Metoda este aplicabilă, credibilă și mai eficientă pentru a discrimina MP și MC și va oferi o nouă modalitate de a facilita controlul calității medicamentelor împotriva insectelor.

Cuvinte cheie: HPLC, amprentare, spectru-efect antitumoral, Mylabris, Discriminare

fundal

Mylabris, numit ban mao în China, a fost folosit ca medicină tradițională chineză (TCM) pentru tratarea furunculului, ulcerelor adânci înrădăcinate, a unei mase abdominale și este un importantantitumoralagent. În plus, este utilizat pe scară largă în Europa ca medicină populară [1]. Componenta activă majoră a Mylabris este cantaridina, care este eficientăantitumoralcompus [2]. Studiile farmacologice moderne au demonstrat că Mylabris posedă activități multiple și este foarte apreciat pentru tratamentul tumorilor datorităanti-cancerproprietățile și capacitatea de a crește numărul de leucocite [3-4]. În prezent, Mylabris a fost utilizat pe scară largă în unele prescripții clinice anti-carcinom TCM în China, cum ar fi injectarea Aidi și capsula Compound ban mao.

Conform Farmacopeei Republicii Populare Chineze (versiunea 2015), Mylabris este definit ca un corp uscat de Mylabris phalerata Pallas (MP) și Mylabris cichorii Linnaeus (MC), care diferă prin caracteristicile lor botanice, dinamica populației și ecologie. 5-6]. Mylabris este, de asemenea, un medicament extrem de toxic. Deoarece medicamentele disponibile în China sunt de obicei un amestec de MP și MC, este necesar să se identifice diferențele chimice și de activitate dintre cele două specii.

Deoarece TCM-urile conțin numeroase ingrediente cunoscute și necunoscute, analiza cantitativă a profilului constituenților lor chimici reprezintă o provocare semnificativă. Amprentarea prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) joacă un rol important în controlul calității (QC) al TCM datorită caracteristicilor sale generale ale profilului majorității compușilor dintr-un sistem complex. În plus, analiza amprentelor digitale a MTC-urilor are o bună reproductibilitate și stabilitate pentru autentificarea speciilor și evaluarea calității și este acceptată de Organizația Mondială a Sănătății, Administrația de Stat pentru Alimente și Medicamente din China (SFDA) și Agenția Europeană de Evaluare a Medicamentelor (EMEA). Recent, a fost dezvoltată o analiză chimiometrică care combină amprentarea HPLC pentru QC și discriminarea diferitelor surse naturale complexe [7]. Cu toate acestea, este ineficient să se discrimineze diferențele dintre MTC, deoarece nu poate reflecta diferențele de constituenți activi, ceea ce este mai important pentru utilizarea clinică. Până acum, spectrul-antitumoral efectabordările relaționale au fost utilizate pentru a identifica cu succes constituenții bioactivi ai MTC [8]. Amprentarea HPLC combinată cu analiza chimiometrică și relația spectru-efect antitumoral va elucida mai bine diferența dintre mai multe surse de TCM.

Recent au fost raportate unele metode pentru determinarea conținutului de cantaridină, care poate fi utilizată pentru a determina calitatea Mylabris [9]. Unele amprente cromatografice au fost aplicate și pentru QC [10-11]. Doar un studiu a utilizat o metodă care implică o eluare în gradient a compușilor solubili în apă ai Mylabris pe baza HPLC. Între timp, au fost utilizate doar zece eșantioane și nicio probă de MC [12]. Din câte știm, discriminarea MP și MC pe baza compoziției chimice și a activității nu a fost studiată înainte.

Acest studiu și-a propus să dezvolte o metodă simplă și eficientă de a discrimina două specii de Mylabris folosind amprenta HPLC combinată cu analiza chimiometrică și spectru-antitumoralefectrelație, care va oferi o bază pentru QC-ul Mylabris. Această metodă ar putea fi aplicată și pentru identificarea markerului QC al altor TCM.

Materiale și metode

În total, 20 de loturi de Mylabris phalerata Pallas (MP) și Mylabris cichorii Linnaeus (MC) au fost colectate din diferite provincii ale Chinei (Tabelul 1) și identificate de profesorul nostru Xiao-Fei Li. Exemplarele de voucher au fost depuse în laboratoarele noastre.

Standardul de referință citozină, uridină, guanozină și adenozină au fost achiziționate de la ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Acetonitril și metanol de calitate HPLC au fost achiziționate de la Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, SUA). Apa pură a lui Watson a fost folosită pe tot parcursul studiului. Alte substanțe chimice și solvenți au fost de calitate analitică și obținuți din reactivul Aladdin (Shanghai, China), reactivul Chengdu Kelong (Chengdu, China) și reactivul chimic Sinopharm (Beijing, China)

Aparatură și condiții cromatografice

Analiza HPLC a fost efectuată utilizând un sistem HPLC Agilent 1260 Infinity la 30 grade pe un Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) pentru amprentare. Pentru separare s-a utilizat eluția cu gradient liniar cu eluanții A (apă/acid acetic glaciar, 100:1, v/v) și B (metanol). Programul de gradient a fost dezvoltat după cum urmează: 0-1 min, 3.0-4,6 la sută B; 1-9 min, 4,6-6,8 la sută B; 9-25 min, 6,8-51,0 la sută B; 25-30 min, 51.0-100 la sută . Debitul fazei mobile a fost de 1,0 ml/min. Cromatograma a fost monitorizată la 254 nm. După o perioadă de echilibrare de 15 minute, 10 μL de probe au fost utilizate pentru injecție.

pregătirea unei mostre

Probele uscate au fost zdrobite în pulbere și 2,5 g din fiecare probă sub formă de pulbere au fost extrase de două ori cu 50 ml de etanol 75% prin reflux timp de 1,5 ore de fiecare dată. Proba extrasă a fost amestecată și concentrată sub presiune redusă la 20 ml. Amestecul a fost apoi precipitat cu 80 mL apă timp de 24 de ore la 4 grade. Ulterior, extractul a fost centrifugat la 3000 g min-1 timp de 10 min pentru a separa supernatantul. Supernatantul a fost concentrat sub presiune redusă la 25 ml. În cele din urmă, supernatantul a fost filtrat printr-un film Millipore de 0,22 μm înainte de analiza HPLC.

Validarea metodologiei

Metoda HPLC a fost validată pentru precizie, reproductibilitate și stabilitate (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Validarea a fost estimată pe baza timpului de retenție (RT) și a aria de vârf (PA). În cele din urmă, amprentele chimice ale a 20 de loturi de Mylabris au fost stabilite pentru a identifica caracteristicile chimice integrate ale mai multor compuși. Unele tehnici chimiometrice au fost introduse pe amprenta chimică pentru analiză.

Analiza recunoașterii modelelor

Diferențele dintre două specii din zonele de vârf au fost evaluate pentru semnificația statistică folosind testul t Student nepereche. O valoare p mai mică de 0.05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic. Ca metodă clasică nesupravegheată, analiza componentelor principale (PCA) este aplicată pe scară largă pentru analiza datelor statistice. În loc să folosească multe variabile, PCA ia un număr mic de computere fără a pierde multe informații, iar diagramele de scor sunt apoi vizualizate pentru separarea gratuită a observațiilor. În acest studiu, PCA a fost efectuată pe zonele de vârf normalizate ale fiecărei componente din amprentele digitale HPLC folosind software-ul SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Suedia) pentru a găsi discriminarea între cele două specii de Mylabris.

Pentru o discriminare mai preferată între cele două specii Mylabris, a fost aplicată o metodă supravegheată de analiză discriminantă ortogonală a celor mai mici pătrate parțiale (OPLS-DA) pentru a analiza diferențele dintre zonele de vârf normalizate ale fiecărei componente din amprentele HPLC. Valoarea VIP este o sumă ponderată a pătratelor ponderilor OPLS, care reflectă contribuția relativă a fiecărei variabile X la model. Variabilele cu VIP > 1, împreună cu S-plot au fost considerate a fi influente pentru separarea probelor în diagramele de scor generate din analiza OPLS-DA. Apoi, s-au obținut markerii chimici caracteristici pentru discriminare.

Analiza relației spectru-efect antitumoral

Pentru a exploraantitumoralzona de vârf a efectului pentru probele Mylabris integrate cu datele de amprentă și comparați diferențele dintre cele două specii, corelația dintre vârful de amprentă șianti-tumoraefectele au fost studiate. Două metode care combină analiza relațională gri și analiza de regresie liniară multivariată (MLRA) au fost aplicate de SPSS19.0 (IBM, SUA) și GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, China). Theanti-tumoratestul a fost efectuat prin metodele noastre publicate [12], linia celulară de carcinom hepatocelular uman celulele HepG2 au fost menținute în mediu RPMI1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Celulele au fost crescute într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2 la 37 C. Metoda SRB a fost utilizată pentru evaluarea proliferării ptanti-tumoraActivități, apoi s-a calculat IC50 al celulelor HepG2, în final, IC50 și zonele de vârf normalizate au fost utilizate pentru analiza chimiometrică. Apoi, au fost obținuți markerii de activitate caracteristici Mylabris.

Rezultate si discutii

Optimizarea condițiilor de extracție

Pentru o extracție suficientă a compușilor soluți în apă din Mylabris, sistemul de extracție a fost optimizat. Ultrasunetele și refluxul au arătat că acești compuși ar putea fi extrași în mod optim prin reflux.

Optimizarea metodei HPLC

Pentru a obține vârfuri cromatografice maxime pentru a descrie caracteristica generală a plantei, au fost investigate compoziția coloanei cromatografice, faza mobilă și lungimile de undă de detecție (200, 254, 265 și 278 nm). Rezultatele au arătat că coloana Phenimenex Synergy Polar-RP80, apa (conținând 1% acid acetic glacial) și metanol și 254 nm au fost cele mai bune condiții pentru analiza HPLC Mylabris (Figura 1), structura a 4 substanțe standard este prezentată în Figura 2 .

Validarea metodei

În acest studiu, 14 vârfuri au fost bine separate și utilizate ca „vârfuri comune”. Precizia, repetabilitatea și stabilitatea s-au bazat pe timpul de retenție (RT) și zona de vârf (PA). Valorile RSD ale RT și PA pentru precizie (n=6) nu au depășit 0,2 și, respectiv, 4%; Valorile RSD ale RA și PA pentru repetabilitate (n=6) au fost sub 0.2 și, respectiv, 4%, iar valorile RSD pentru stabilitate (0-24 h) au fost mai mici de 0-24 {10}}.4 și, respectiv, 5 procente, ceea ce a indicat că probele au fost stabile în 24 de ore. Aceste rezultate au demonstrat că calitatea probelor studiate și metoda HPLC au fost stabile și bine controlate.

Evaluarea similitudinii amprentelor digitale

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921, cu excepția eșantioanelor MC (de la Guizhou2 și Guizhou4), ale căror asemănări au fost 0.888 și, respectiv, 0.887. Aceste date au indicat că calitatea Mylabris în cadrul unei specii a fost stabilă. Cu toate acestea, asemănările doar a trei eșantioane MP în comparație cu amprenta digitală HPLC de referință au fost > 0,930; iar asemănările doar a două eșantioane MC în comparație cu amprenta digitală HPLC de referință au fost > 0,921. Aceste rezultate au arătat că cele două specii de Mylabris au avut o variație considerabilă în unele zone de vârf.

Discriminarea MP și MC prin analiza de recunoaștere a modelelor

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, vârfurile 1, 2, 4, 7, 9, 12 și 14 ar putea fi cele mai semnificative variabile în discriminarea între cele două specii (Figura 6). Grupul de vârf (1, 2, 4, 7, 9, 12 și 14) poate juca un rol vital în distingerea între MP și MC ca markeri chimici caracteristici.

Relația spectru-efect prin analiza relațională gri

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Relația spectru-efect de către MLRA

Modelul MLRA este cea mai comună metodă de modelare pentru deducerea complexității relației dintre două sau mai multe variabile și un răspuns care a fost construit prin următoarea formulă

Unde Y este valoarea estimată și reprezintă răspunsul; Xn este o variabilă independentă, b{{0}} este interceptul și bn este coeficientul de regresie pentru Xn. În acest studiu, MLRA a fost aplicat pentru a stabili relația de eficacitate a amprentei dintre valorile zonelor de vârf din amprentele HPLC și IC50 ale anti-HepG2 și apoi găsirea posibilelor componente antitumorale. Colinierea datelor a fost găsită de un model MLRA comun, care nu este adecvat pentru a explora corelația dintre Y (IC50) și X (PA). Un model PCA MLRA a fost folosit pentru a studia relația amprentă-efect, iar primele șase computere cu o rată de contribuție a variației cumulate: 91,068 la sută au fost selectate pentru analiză. În cele din urmă, următoarea ecuație a fost stabilită în funcție de ieșirea SPSS și PC-urile: IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA{1- 699.722PA2 plus 25.7138PA{3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{{ 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA9.{0428PA9}) ×{0.{44}4}) (R a fost 0,682, P <>

Analiza integratoare a două specii de Mylabris

Experimentul a arătat că amprentarea HPLC ar putea fi utilizată pentru reflectarea caracteristicilor chimice ale Mylabris. Algoritmii de similaritate, PCA și OPLS-DA au fost aplicați pentru a găsi diferența dintre MC și MP. Grupul de vârf (1, 2, 4, 7, 9, 12 și 14) a fost definit ca markeri chimici caracteristici.

În plus, atât GRA, cât și MLRA s-au dovedit a fi metode satisfăcătoare pentru discriminarea ulterioară. Integrarea rezultatelor analizei GRA și MLRA, vârfurile 2, 4 și 14 ca markeri de activitate ai Mylabris ar trebui să fie responsabili pentru efectul anti-tumoral, care poate fi baza materialului farmacodinamic al Mylabris.

Markerii diferențiali importanți au fost definiți pentru vârful cu proprietăți chimice caracteristice și marker de activitate. Deci, între MC și MP pe amprentele digitale HPLC după analiza relației spectru-efect, vârfurile 2 (citozină), 4 (necunoscută) și 14 (necunoscută) au fost markeri diferențiali importanți pentru diferențele dintre MP și MC, așa cum se arată în Figura 7.

Concluzie

În mod concludent, în prezenta cercetare, a fost propusă o metodă HPLC pentru amprentarea chimică a MP și MC. Prin combinarea amprentelor HPLC, PCA și analiza relației spectru-efect, cum ar fi GAS și MLRA, proprietățile chimice și farmacologice ale două specii apropiate de Mylabris ar putea fi discriminate. Acest lucru a indicat că compușii din vârfurile 2 (citozină), 4 (necunoscut) și 14 (necunoscut) ca markeri diferențiali importanți au jucat roluri dominante în distingerea între MP și MC. Structura vârfurilor 4 și 14 ar trebui identificată prin altă tehnologie. Metoda de amprentare HPLC combinată cu analiza statistică, chimiometrică și analiza relației spectru-efect s-a demonstrat a fi eficientă în descoperirea componentelor markerului sau pentru promovarea QC aplante medicinale.

Referințe

1 Wang GS. Utilizări medicale ale Mylabris în China antică și studii recente. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP și colab. Determinarea conținutului de cantaridină și efectul său inhibitor asupra celulelor HepG2 de hepatom uman. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ și colab. Acyl-CoA: activități inhibitoare ale colesterolului aciltransferazei ale amidelor de acizi grași izolate din Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Bístere de cantaridină: o tehnică pentru investigarea traficului de leucocite și a producției de citokine la locurile de inflamație la oameni. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studiu privind hrana preferată a adultului Mylabris phalerata în diferite populații geografice. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Caracteristicile biologice ale Meloidae și hrănirea sa artificială. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H și colab. Analiza cantitativă în combinație cu tehnologia amprentelor digitale și analiza chimiometrică aplicată pentru evaluarea a șase specii de Paris sălbatic folosind UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G și colab. Monitorizarea și evaluarea consistenței calității comprimatelor de aluminat de bismut compus printr-o metodă simplă de amprentă a raportului cuantificat combinată cu determinarea simultană a cinci compuși și corelată cu activități antioxidante. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analiza cantaridinei la gândacii blister falși (Coleoptera: Oedemeridae) prin microextracție în fază solidă în spațiul de cap și cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studiu privind amprentele GC ale Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX și Shi XF. Amprentele digitale digitizate ale Mylabris de HPCE. Farmacia Central South (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX și Wang, Z. Studiu privind amprentele digitale HPLC ale Mylabris. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, și colab. Activitatea celulelor HepG 2 de carcinom hepatocelular anti-uman a cantharidinei derivate din provincia Guizhou și regiunile învecinate. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.