Expresia umană Alpha Defensin 5 în rinichiul uman și tractul urinar
Mar 16, 2022
Pentru mai multe informații: ali.ma@wecistanche.com
John David Spencer și colab
Abstract
Fundal:Mecanismele care mențin sterilitatea în tractul urinar sunt incomplet înțelese. Studii recente au implicat importanța peptidelor antimicrobiene (AMP) în protejarea tractului urinar de infecții. Aici, caracterizăm expresia și relevanța alfa-defensinei umane AMP 5 (HD5) la om.rinichiși tractul urinar la subiecții normali și infectați.
Metodologie/ Constatări principale:Folosind ARN izolat de la omrinichi, ureterul și țesutul vezicii urinare, am efectuat PCR cantitativă în timp real pentru a arăta că DEFA5, gena care codifică HD5, este exprimată constitutiv în tot tractul urinar. Cu pielonefrită, expresia DEFA5 a crescut semnificativ înrinichi. Folosind analiza imunoblot, producția de HD5 a crescut și cu pielonefrita. Imunocolorarea localizată HD5 la uroteliul vezicii urinare și ureterului. În rinichi, HD5 a fost produs în principal în nefronul distal și în tubii colectori. Folosind testele imunoblot și ELISA, HD5 nu a fost detectat în mod obișnuit în probele de urină umană neinfectată, în timp ce producția urinară de HD5 a crescut odată cu infecția tractului urinar cu E.coli.
Concluzii/semnificație:DEFA5 este exprimat în tot tractul urinar la subiecții neinfectați. Mai exact, HD5 este exprimat în uroteliul tractului urinar inferior și în tubii colectori ai tractului urinar.rinichi. Odată cu infecția, expresia HD5 crește înrinichi, iar nivelurile devin detectabile în urină. Din cunoștințele noastre, descoperirile noastre reprezintă primele care cuantifică expresia și producția HD5 în rinichiul uman. Mai mult, acesta este primul raport care detectează prezența HD5 în probele de urină infectate. Rezultatele noastre sugerează că HD5 poate avea un rol important în menținerea sterilității tractului urinar.
Introducere
Tractul urinar, în afară de meatul uretral, este de obicei steril în ciuda apropierii sale de flora fecală. Mecanismele precise prin care tractul urinar își menține sterilitatea nu sunt bine înțelese. Mecanismele propuse care contribuie la apărarea tractului urinar includ fluxul de urină, modificări ale pH-ului și osmolarității urinei, golirea regulată a vezicii urinare, componentele chimice de apărare ale uroepiteliului și eliminarea/influxul epitelial al celulelor imune efectoare cu stimulare bacteriană [1]. În plus, peptidele antimicrobiene (AMP) s-a dovedit recent a avea un rol important în menținerea sterilității tractului urinar [2].AMP-urile, care servesc ca antibiotice naturale produse de aproape toate organismele, sunt o componentă omniprezentă a sistemului imunitar înnăscut. AMP-urile sunt molecule cationice exprimate de celulele albe fagocitare și celulele epiteliale. La oameni și la alte mamifere, defensinele sunt o familie majoră de AMP. Defensinele au de obicei activitate antimicrobiană cu spectru larg împotriva bacteriilor gram-pozitive și gram-negative, viruși, ciuperci și protozoare [2,3]. Defensinele sunt inițial sintetizate ca preproproteine și sunt supuse procesării pentru a deveni peptide mature, active biologic [4]. La oameni, defensinele sunt clasificate în una din două familii în funcție de modelul lor de punte disulfură - alfa-defensinele sau beta-defensinele [5].
În tractul urinar, beta-defensinele sunt exprimate pe scară largă în tot uroepiteliul. Celulele epiteliale care căptuşescrinichibucla de Henle, tubul distal și ductul colector exprimă constitutiv beta-defensina 1 umană (hBD1). Deși nivelurile urinare de hBD1 sunt insuficiente pentru a ucide bacteriile invadatoare, hBD1 oferă o acoperire antimicrobiană cu acțiune rapidă a lumenelor tubulare și previne infecția prin inhibarea atașării bacteriene la uroteliu [6]. Studii recente indică faptul că starea redox a hBD1 afectează semnificativ potența antimicrobiană, astfel încât peptida redusă este mult mai puternică decât forma oxidată legată de disulfură [7]. Semnificația acestui lucru la suprafața urotelială nu a fost determinată. O altă defensină, beta-defensina 2 umană (hBD2) nu este exprimată constitutiv în țesutul renal sănătos; cu toate acestea, expresia hBD2 este indusă de infecție [8].
Spre deosebire de beta-defensine, rolul alfa-defensinelor derivate din epitelii nu este bine descris în tractul urinar. Expresia și funcția alfa-defensinelor HD5 și HD6 au fost raportate în cea mai mare parte în intestinul subțire, unde sunt secretate de celulele Paneth în criptele intestinale și contribuie la echilibrul microbiotei intestinale [9]. HD5 a fost, de asemenea, localizat în tractul genital masculin și feminin, cu dovezi care sugerează că este inductibil și important în eradicarea infecției [10,11,12]. HD5 urinar a fost detectat la pacienții care au suferit reconstrucție a neovezicii ileale și deviație urinară a conductei ileale, prin care sursa producției de HD5 a fost creditată în principal celulelor Paneth ileale [13,14]. HD5 are activitate antibacteriană împotriva bacteriilor gram-pozitive uropatogenice comune și bacteriilor gram-negative [15]. HD5 are, de asemenea, activitate antimicrobiană împotriva virusurilor uropatogene, cum ar fi adenovirusul și virusul BK [16,17,18]. În acest studiu, oferim descrierea inițială și cuantificarea expresiei HD5 la omrinichiși definiți în continuare expresia sa în tractul urinar inferior în timpul sterilității și infecției.
Rezultate
ARNm DEFA5 este exprimat constitutiv în vezica urinară, ureter și rinichi uman
PCR cantitativ în timp real demonstrează că toate vezica urinară, ureterul șirinichispecimenele fără infecție exprimate constitutiv DEFA5. Expresia DEFA5 a fost semnificativ mai mare în tractul urinar inferior decât în tractul urinar superior (p= 0.014). În vezică urinară (n=4), expresia medie DEFA5 a fost de 4,656637 transcrieri per 10 ng ARN și în ureter (n=4) expresia medie DEFA5 a fost de 4,1126170 transcripte per 10 ngARN (Figura 1A) . În rinichi (n=6), expresia medie a DEFA5 a fost de 2,9376274 transcrieri per 10 ng ARN. Expresia DEFA5 a fost analizată separat în cortexul renal, medular și pelvis. Expresia DEFA5 nu a variat semnificativ în funcție de regiunea rinichilor (p= 0.45).
Expresia DEFA5 și expresia peptidei HD5 cresc odată cu pielonefrita
Analiza PCR cantitativă în timp real efectuată petesuturi renale cupielonefrita a demonstrat o creștere semnificativă a expresiei DEFA5 în comparație cu țesuturile renale neinfectate. Cu pielonefrită (n= 6), expresia medie a DEFA5 a crescut la 7.82961.052 transcrieri per 10 ng ARN (p= 0.019) (Figura 2A).
Pentru a evalua în continuare această creștere a expresiei cu pielone-frită, am efectuat analiza imunoblot pe acelașirinichițesut utilizat pentru analiza PCR în timp real pentru a evalua creșterile concomitente ale producției de peptide HD5 (Figura 2B, panoul din mijloc). Analiza imunoblot, folosind antiseruri HD5 policlonale, a demonstrat o producție semnificativ mai mare de peptidă HD5 în țesuturile renale cu pielonefrită (n {{5} }) comparativ cu neinfectaterinichițesuturi (n=6). Neinfectatrinichițesuturile au exprimat 300625 ng HD5/gram greutate țesut umed în timp cerinichițesut cu pielonefrită exprimată 600621 ng HD5/gram greutate țesut umed (p,0,0001). Petele au fost re-sondate cu GAPDH pentru a servi drept control de încărcare (Figura 2B, panoul din mijloc) și a fost efectuată, de asemenea, o colorare cu argint pentru a confirma încărcarea egală cu proteine (Figura 2B, panoul superior).
Peptida HD5 este produsă în rinichiul uman și în tractul urinar
Imunocolorarea a fost efectuată pentru a localiza producția de HD5 în tractul urinar. Imunohistochimia (IHC) a arătat că imunoreactivitatea HD5 a fost prezentă în uroteliul ureterului și vezicii urinare a tuturor probelor investigate (n=4, Figura 3). specimene (n= 6, Figura 4). Imunofluorescența (IF) a demonstrat că expresia HD5 a fost cea mai mare în nefronul distal și în tubii colectori (Figura 5). Interstițiul și glomerulii nu au prezentat imunoreactivitate HD5. Imunocolorarea prezentată în figurile 3, 4 și 5 a fost efectuată utilizând un anticorp monoclonal anti-HD5 de șoarece (8C8) care recunoaște propeptida HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Rezultatele au fost similare atunci când s-a utilizat anticorp policlonal anti-HD5 de iepure care recunoaște propeptida HD5 și peptida matură (datele nu sunt prezentate) - sugerând că HD5 este stocat ca propeptidă.
Cu pielonefrită, imunocolorarea HD5 a crescut semnificativ. Imunoreactivitatea HD5 a crescut în nefronul proximal, nefronul distal și tubii colectori (Figura 4 și Figura 5). Ca și în specimenele neinfectate, glomerulii și interstițiul nu au prezentat expresie HD5 cu infecție. Martorii negativi nu au arătat imunoreactivitate HD5.
Urina umană infectată conține concentrații măsurabile de peptidă HD5
Analiza imunoblot, folosind antiser policlonal de iepure care detectează precursorul proHD5 și formele prelucrate în continuare, au identificat niveluri măsurabile de HD5 în 13 din cele 15 probe de urină testate infectate cu E.coli uropatogen (Figura 6A și B). Când sunt prezente, nivelurile de HD5, normalizate la creatinina urinară, au variat între 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr urinară (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), ceea ce corespunde la 11,10–27,67 nmol/L. În probele de urină neinfectate (n=15), HD5 a fost la sau sub limita de detecție de (,50 ng). Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) pe aceleași probe de urină, folosind anticorpul monoclonal de șoarece (8C8) care detectează numai precursorul proHD5, a detectat niveluri măsurabile de proHD5 în 13 din cele 15 probe infectate testate. Concentrațiile urinare de proHD5 au variat între 122,78–490,060,03 ng HD5/mg Cr urinar (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) când este prezent (Figura 7).
Discuţie
În acest studiu, oferim caracterizarea inițială a HD5 la omrinichi, ureterul și vezica urinară. HD5 s-a dovedit a fi un AMP important care previne infecția invazivă în intestin și este reglat în sus în tractul genital în timpul infecției[11,18,19,20,21]. AMP-urile epiteliale, precum HD5, s-au dovedit a fi importante în menținerea sterilității în tractul urinar[8,22,23,24]. Deficiențele acestor apărări înnăscute ale mucoasei pot duce la infecție acută și/sau cronică [25,26].
Rezultatele noastre cantitative PCR în timp real demonstrează că DEFA5 este exprimat constitutiv la omrinichi, uretere și vezică urinară. Expresia DEFA5 crește de la tractul urinar superior la tractul urinar inferior – în urma curgerii fluxului urinar și apropierea tot mai mare de punctul de invazie al microbiotei. Din cunoștințele noastre, acesta este primul studiu care cuantifică expresia DEFA5 în rinichiul și vezica urinară umană. Recent, Townes și colab. au demonstrat că ureterul distal normal poate exprima DEFA5 [14]. Rezultatele noastre sugerează, de asemenea, că DEFA5 este exprimat constitutiv de ureterul distal. Deși expresia DEFA5 în tractul urinar este de aproape 100-ori mai mică decât cea găsită în țesuturile gastrointestinale, expresia uroepitelială bazală a DEFA5 este comparabilă cu expresia amplificatorilor căii urinare descrise anterior, cum ar fi catelicidina, hBD-1, hBD. -2 și ribonucleaza 7[6,8,22,24,27].
Spre deosebire de tractul gastrointestinal matur unde DEFA5 este exprimat la niveluri ridicate în ambele stări de sănătate și infecție/inflamație, datele noastre cantitative PCR în timp real demonstrează că expresia DEFA5 înrinichieste semnificativ supra-reglată cu infecția [27,28,29]. Acest model de exprimare inductibil este analog cu expresia DEFA5 în tractul reproducător feminin, unde expresia DEFA5 crește odată cu salpingita [30]. În tractul urinar, Townes și colab. au arătat o tendință către o mai mare expresie ureterală a DEFA5 la pacienții cu infecții urinare care au suferit o derivație urinară a conductei ileale [14]
Analiza noastră imunoblot completează datele PCR în timp real, demonstrând că producția de peptide HD5 crește odată cu pielonefrita. Acest model inductibil al producției de HD5 este similar cu cel observat la unii membri ai familiei beta-defensinei. hBD2 prezintă un model inductibil de producție cu infecție a tractului urinar și/sau pielonefrită cronică [8,31,32]. S-a demonstrat că producția de HD5peptidă crește în tractul genital superior feminin și în uretra masculină cu inflamație [11,30].
Folosind imunocolorarea, demonstrăm că HD5 este produs uniform în uroteliul ureterului și vezicii urinare. Deoarece marea majoritate a infecțiilor urinare rezultă din flora fecală care urcă în vezică, aceste rezultate sugerează că expresia HD5 este prezentă în locurile în care expunerea microbiană apare cel mai frecvent [33]. Prin urmare, HD5 este poziționat ideal pentru a preveni o infecție microbiană ascendentă. Înrinichi, HD5 este produs în principal în nefronul distal și tubul colector. Aceste descoperiri sugerează că HD5 este produs în locații în care va fi poziționat pentru a avea activitate antimicrobiană optimă. Studiile anterioare au arătat că proprietățile antimicrobiene ale defensinelor sunt dependente de concentrația de sare – cu concentrații mai mari de sare scăzând activitatea antimicrobiană [23,34,35]. Noi speculăm că concentrațiile scăzute de sare ale nefronului distal și ale tubilor colectori oferă un mediu favorabil pentru activitatea antimicrobiană HD5.
Analizele imunoblot și ELISA demonstrează, de asemenea, că HD5 este secretat în urină la niveluri scăzute. Având în vedere dimensiunea (8,1 kDa și 3,7 kDa) și încărcarea pozitivă a proHD5 și a HD5 complet procesat, este posibil ca unele peptide HD5 urinare să provină, cel puțin parțial, din filtratul de plasmă. Cu toate acestea, există puține dovezi care sugerează că HD5 persistă în plasmă [27]. În plus, pentru a apărea în urină, HD5 ar trebui să scape de mecanismele eficiente de absorbție a peptidelor din tubul proximal [6,36]. În cele din urmă, probele de urină utilizate au fost supuse centrifugării înainte de efectuarea testelor, îndepărtând sursele celulare de HD5.
La concentrațiile detectate, HD5 urinar este puțin probabil să fie antimicrobian direct împotriva microorganismelor uropatogene, deoarece HD5 complet procesat are o concentrație inhibitorie minimă (MIC) între 6-10 mg/mL împotriva bacteriilor uropatogenice gram-negative comune [15]. Cu toate acestea, concentrațiile la suprafața mucoasei sunt probabil să fie mai mari. În plus, analiza imunoblot demonstrează că concentrațiile HD5 sunt semnificativ mai mari înrinichi. Aceste rezultate sugerează că HD5 este implicat în apărarea mucoasei a tractului urinar. Un model analog este observat cu hBD1, unde concentrațiile urinare de hBD1 sunt insuficiente pentru a prezenta activitate antimicrobiană, dar concentrații mai mari de peptide sunt detectate în apropierea tubilor renali [6,31].
Deoarece IHC demonstrează că proHD5 este o formă majoră de HD5 înrinichiși pentru că atât maturi cât și proHD5 sunt detectate în urină, speculăm că HD5 este secretat în primul rând o moleculă precursor și apoi suferă procesare proteolitică pentru a genera forme mature - similare cu tractul gastrointestinal și genito-urinar [11,30,37]. În intestinul subțire, celulele Paneth produc tripsina, care scindează propeptida HD5, astfel încât peptida complet procesată este forma predominantă în lumenul intestinal [37]. În uretra masculină, enzimele cheie de procesare și activare pentru HD5 sunt proteazele neutrofile contribuite de neutrofilele recrutate la locul infecției [11]. Contribuțiile tripsinogenului epitelial, tripsinei urinare și/sau proteazelor neutrofile la procesarea HD5 în tractul urinar în timpul infecției rămân de determinat. Mai mult decât atât, efectele modificărilor din mediul urinar asupra funcției HD5 (alterări ale osmolarității, pH-ului și concentrațiilor cationice) rămân, de asemenea, de determinat.
În concluzie, acesta este primul studiu care identifică și cuantifică expresia și producția HD5 în tractul urinar. Rezultatele noastre sugerează că HD5 este un AMP derivat din epitelii care poate juca un rol important în imunitatea înnăscută a uroepitelui uman, prevenind translocarea agenților patogeni invadatori în circulație. Elucidarea factorilor care reglează producția HD5 poate oferi o nouă perspectivă asupra patogenezei ITU la pacienții cu risc de ITU și la pacienții cu infecții cronice.
Metode
Aprobarea studiului
Consimțământul informat scris a fost obținut de la toți pacienții care au participat la acest studiu. Pentru subiecții cu vârsta mai mică de 18 ani, a fost obținut acordul scris al părinților/tutorelor. Consiliul de examinare instituțional al NationwideChildren's Hospital (NCH) a aprobat acest studiu împreună cu procesul de consimțământ și documentele (IRB07-00383).
Probe de țesut uman și urină
Ureterul distal și țesutul vezicii urinare neinfectate (n= 4) au fost obținute de la copii supuși reimplantării ureterului din alte motive decât infecția recurentă. Neinfectatrinichiprobe (n=6) au fost obținute de la pacienți supuși nefrectomiei pentru tumori renale. Probele de țesut nu prezentau semne macroscopice de boală sau inflamație.Rinichițesutul de la pacienții cu pielonefrită cronică a fost furnizat de Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Doi patologi independenți au confirmat diagnosticul histopatologic al pielonefritei. Probele de țesut au fost congelate rapid sau conservate ca secțiuni neutre încorporate în parafină fixate cu formol. Secțiuni de țesut renal neinfectat au fost disecate în cortex, medular sau pelvis renal înainte de depozitare (n=4).
Probele de urină neinfectate și infectate au fost obținute de la copii care se prezentau la secția de urgență NCH sau la clinica de nefrologie. Diagnosticul de ITU a fost pus printr-o urocultură pozitivă conform Ghidurilor Academiei Americane de Pediatrie [39]. Toate probele de urină infectate au avut .106 CFU/mL de E.coli. Valorile pH-ului urinar au variat între 5,5 și 8,5 (urină medie 6,9). Compoziția ionică urinară nu a fost măsurată. Probele de urină au fost centrifugate pentru a îndepărta sedimentul de urină și s-a adăugat cocktail de inhibitor de protează (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA).
Izolarea acidului ribonucleic și transcrierea inversă
ARN-ul total a fost izolat din țesutul congelat folosind sistemul de izolare a ARN-ului PromegaTotal (Promega, Madison, WI, SUA). Sinteza ForcADN, 4-8 mg de ARN total au fost transcrise invers cu transcriptază inversă Superscript III folosind un primer oligo-(dT)12-18 conform protocolului furnizorului (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA).
Clonarea plasmidelor specifice genelor pentru curbele standard
ADNc-ul care codifică DEFA5 și GAPDH a fost donat într-un vector plasmid 4-Topo (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. Plasmidele au fost secvențiate pentru a confirma că sunt corecte
s-au obţinut construcţii. Diluțiile în serie ale plasmidelor specifice genelor au fost cuantificate (prin absorbanță spectrofotometrică la 260°C și electroforeză pe gel de agaroză colorată cu bromură de etidio) și utilizate în PCR în timp real pentru a genera curbe standard pentru fiecare reacție.
PCR cantitativ în timp real
PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând ADNc monocatenar de la omrinichi, ureterul și țesutul vezicii urinare cu perechi de primeri de oligonucleotide specifice utilizând sistemul 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SUA). Au fost proiectați primeri de întindere a joncțiunii exonilor PCR, iar secvențele au fost confirmate folosind DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (primer înainte DEFA5). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 și primer revers DEFA5 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
Pe scurt, cADN-ul corespunzător la 10 ng ARN a servit ca șablon într-o reacție de 25 ml care conține 2,0 mM din fiecare primer și 16 amestec Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Condițiile PCR au fost: denaturarea inițială la 95uC timp de 10 minute, urmată de 40 de cicluri cu fiecare ciclu constând din denaturare la 94uC timp de 30 de secunde, recoacere la 64uC timp de 30 de secunde și extensie la 72uC timp de 30 de secunde. Emisia de fluorescență de la ciclu la ciclu a fost monitorizată la 530 nm și analizată folosind 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Standardele plasmidelor specifice genelor au fost incluse cu fiecare set de reacții. Ca control pozitiv, ARN-ul ileon terminal a fost inclus cu fiecare set de reacții, iar rezultatele au fost comparate cu standardele publicate anterior [27].
Pentru a confirma amplificarea PCR a produsului dorit, o probă reprezentativă a fost analizată prin electroforeză pe un gel de agaroză 1,5%. Produsele au fost vizualizate prin colorare cu bromură de etidio și comparate cu standardele de dimensiune ADN cu dimensiunea confirmată a produsului (nu este prezentată). În plus, a fost determinată o curbă a profilului temperaturii de topire a fiecărei reacții PCR la sfârșitul fiecărei reacții.
Anticorpi HD5
Propeptida HD5 (AA20-94) și formele parțial procesate (AA36-94 și 56–94) au fost identificate utilizând un anticorp monoclonal de șoarece (8C8) anti-HD5 (Abcam) disponibil comercial. Propeptidul HD5 și peptida matură (AA63-94) a fost identificată folosind antiser policlonal de iepure descris anterior[13,40].
Imunoblot
Secțiuni ale aceluiașirinichiProbele utilizate pentru analiza cantitativă PCR în timp real (3-6 mg greutate umedă) au fost pulverizate folosind un mojar și pistil în azot lichid și dizolvate în tampon RIPA cu inhibitori de protează. Proteinele urinare au fost extrase din probe de urină utilizând kitul ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada). Concentrațiile de proteine în rinichi și urină au fost cuantificate utilizând un test Bradford modificat și confirmate folosind o citire anOD280 nm. Concentrații egale de țesut renal sau proteină urinară au fost încărcate pe geluri cu gradient de dodecil sulfat de sodiu cu 18% și supuse electroforezei. Pentru a asigura o încărcare egală cu proteine, a fost efectuată o colorare cu argint.
După separarea electroforetică, proteinele au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză. După fixarea cu 0,05% glutaraldehidă în TBS, membranele au fost blocate în lapte fără grăsimi 5% timp de 30 până la 60 de minute și incubate într-o diluție 1:1,000 de antiser policlonal HD5 de iepure peste noapte . După spălare, anticorpul secundar, un anti-IgG de iepure conjugat cu peroxidază de hrean, diluat 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA), a fost aplicat timp de 1 oră la temperatura camerei. Imunobloturi de larinichițesuturile au fost de asemenea sondate cu anticorp anti-GAPDH (Sigma Aldrich) timp de două ore la temperatura camerei și apoi incubate cu anticorpul secundar descris mai sus. Proteinele au fost vizualizate folosind un sistem de detectare ECL și un film de chemiluminiscență conform instrucțiunilor producătorului (BioExpress, Kaysville, UT, SUA).
HD5 a fost cuantificat prin compararea intensităților benzilor rezultate cu o diluție în serie a proteinei proHD5 standard recombinate (Peptides International, Louisville, KY, SUA).RinichiConcentrațiile HD5 au fost standardizate la greutatea țesutului umed. Concentrațiile UrinaryHD 5 au fost împărțite la creatinina urinară pentru a stabili rapoarte standardizate HD5-de urină la creatinină (mg/mg) pentru a ține cont de diluția urinei. Concentrațiile de creatinine în urină au fost determinate utilizând testul pe microplăci de creatinine Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, SUA).
Imunohistochimie
După deparafinizare, rehidratare și extragerea antigenului, au fost efectuate un bloc de biotină și un bloc proteic fără ser (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, SUA). Lamele au fost incubate peste noapte la 4uC cu anticorp monoclonal de șoarece HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) sau cu antiser policlonal de iepure (1:500), urmat de anticorp biotinilat anti-polivalent adulterat Streptavidin/HRP (laboratoarele ScyTek). Secțiunile au fost dezvoltate folosind tetraclorură de diaminobenzidină 0,1% cu peroxid de hidrogen 0,02% și colorate cu hematoxilină. Secțiunile de control negative au fost incubate cu ser non-imun în locul anticorpului HD5.
Imunofluorescență
Imunofluorescența dublu marcată a fost efectuată pentru a ajuta la localizarea expresiei HD5 înrinichi. Canalul colector a fost dublu marcat pentru celulele principale cu anticorp policlonal de capră anti-acvaporină umană-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) [41]. Ansa lui Henle a fost dublu marcată cu anticorp policlonal anti-uromodulină umană de șoarece (Sigma-Aldrich) și tubul proximal a fost dublu marcat cu acvaporină policlonală antiumană de capră-1 (Santa Cruz) [41,42]. Ca anticorpi secundari au servit drept anticorpi secundari.
Toate secțiunile au fost pregătite așa cum este menționat mai sus. Au fost incubați cu un amestec de antiseruri de șoarece împotriva HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulină (1:500), AQP-1 (1:400) în cameră temperatura timp de 90 de minute. Anticorpul secundar a fost aplicat timp de 90 de minute la temperatura camerei și secțiunile au fost montate folosind medii de montare cu DAPI. Ser non-imun a fost folosit ca martor negativ. Lamele au fost examinate cu microscopul aLeica DM4000B și fotografiate digital folosind camera/software-ul Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, SUA).
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) anticorp monoclonal de șoarece timp de 2 ore la temperatura camerei, s-a adăugat streptavidin-peroxidază de hrean (Biolegend, San Diego CA, SUA) timp de 30 de minute. După incubarea cu soluție de substrat TMB timp de 15 minute (Kem-En-Tec Diagnostics), reacția a fost încheiată cu soluție STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) și citită la o lungime de undă de 450 nm. Concentrațiile HD5 din testul ELISA au fost împărțite la urinacreatinină pentru a stabili rapoarte standardizate HD5-de urină la creatinină (mg/mg) pentru a ține cont de diluția urinei așa cum este descris mai sus.
Referințe
1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Concepte actuale ale mecanismelor moleculare de apărare operative în timpul infecției tractului urinar. Jurnalul european de investigații clinice 38 Suppl 2: 29–38.
2. Zasloff M (2007) Peptide antimicrobiene, imunitatea înnăscută și tractul urinar normal steril. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.
3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensine: peptide antimicrobiene și citotoxice ale celulelor de mamifere. Annu Rev Immunol 11: 105–128.
4. Valore EV, Ganz T (1992) Procesarea posttranslațională a defensinelor în celulele mieloide umane imature. Sânge 79: 1538–1544.
5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Beta-defensina-1 și alfa-defensinele umane sunt codificate de gene adiacente: două familii de peptide cu topologie diferită de disulfură au un ascendent comun. Genomica 43: 316–320.
6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Beta-defensină umană-1: o peptidă antimicrobiană a țesuturilor urogenitale. J Clin Invest 101: 1633–1642.
7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Reducerea legăturilor disulfurice demască activitatea antimicrobiană puternică a beta-defensinei umane 1. Nature 469: 419–423.
8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Exprimarea beta-defensinelor umane 1 și 2 în rinichi cu o infecție bacteriană cronică. BMC Infect Dis 2: 20.
9. Bevins CL (2006) Paneth cell defensins: molecule efectoare cheie ale imunității înnăscute. Tranzacțiile Societății Biochimice 34: 263–266.
10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C și colab. (1998) Expresia genelor, imunolocalizarea și secreția defensinei umane-5 în tractul reproducător feminin uman. Am J Pathol 152: 1247–1258.
11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Profiluri distincte de defensină în Neisseria gonorrhoeae și uretrita Chlamydia trachomatis dezvăluie noi interacțiuni celule epiteliale-neutrofile. Infect Immun 73: 4823–4833.
12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Exprimarea defensinelor antimicrobiene în tractul reproducător masculin al șobolanilor, șoarecilor și oamenilor. Biologia reproducerii 68: 95–104.
13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Izolarea defensinelor intestinale umane din urina neovezicii ileale. FEBS Scrisorile 434: 272–276.
14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Toleranța bacteriuriei după devierea urinară este legată de activitatea peptidelor antimicrobiene. Urologie 77: 509 e501–508.
15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Activitatea antibacteriană și mecanismul alfa defensinei umane recombinate 5 împotriva tulpinilor clinice rezistente la antibiotice. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.
16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Defensinele epiteliale afectează infecția adenovirală: implicație pentru terapia genică mediată de adenovirus. Terapia genetică umană 10: 957–964.
17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mecanism of adenovirus neutralization by Human alpha-defensins. Celulă gazdă și microbi 3: 11–19.
18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) Alfa-defensinele umane inhibă infecția cu virusul BK prin agregarea virionilor și blocarea legării la celulele gazdă. Jurnalul de chimie biologică 283: 31125–31132.
19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF și colab. (2009) Studiul imunității locale a infecțiilor tractului genital inferior. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.
20. Quayle AJ (2002) Răspunsul imun înnăscut și timpuriu la provocarea patogenilor în tractul genital feminin și rolul pivot al celulelor epiteliale. Jurnalul de imunologie reproductivă 57: 61–79.
