HydroZitLa inhibă formarea pietrei de oxalat de calciu la șobolanii nefrolitici și promovează longevitatea la nematodul Caenorhabditis Elegans Partea 2

Glicozidul cistanchei poate crește, de asemenea, activitatea SOD în țesuturile inimii și hepatice și poate reduce semnificativ conținutul de lipofuscină și MDA din fiecare țesut, eliminând eficient diferiți radicali reactivi de oxigen (OH-, H₂O₂ etc.) și protejând împotriva daunelor cauzate de ADN. prin radicalii OH. Glicozidele feniletanoide Cistanche au o capacitate puternică de captare a radicalilor liberi, o capacitate de reducere mai mare decât vitamina C, îmbunătățește activitatea SOD în suspensia de spermă, reduc conținutul de MDA și au un anumit efect protector asupra funcției membranei spermatozoizilor. Polizaharidele Cistanche pot spori activitatea SOD și GSH-Px în eritrocite și țesuturi pulmonare ale șoarecilor senescenți experimental cauzate de D-galactoză, precum și pot reduce conținutul de MDA și colagen în plămâni și plasmă și pot crește conținutul de elastină, au un bun efect de curățare asupra DPPH, prelungește timpul de hipoxie la șoarecii senescenți, îmbunătățește activitatea SOD în ser și întârzie degenerarea fiziologică a plămânilor la șoarecii senescenți experimental. Cu degenerarea morfologică celulară, experimentele au arătat că Cistanche are o bună capacitate antioxidantă. și are potențialul de a fi un medicament pentru prevenirea și tratarea bolilor de îmbătrânire a pielii. În același timp, echinacozidul din Cistanche are o capacitate semnificativă de a elimina radicalii liberi DPPH și are capacitatea de a elimina speciile reactive de oxigen și de a preveni degradarea colagenului indusă de radicalii liberi și, de asemenea, are un bun efect de reparare asupra daunelor anionice a radicalilor liberi de timină.

Faceți clic pe Cistanche Norge

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Pe baza descoperirilor noastre prezente, HydroZitLa a exercitat funcția antipatogenă prin cel puțin două căi. În primul rând, a redus excreția urinară de oxalat, a scăzut capacitatea urinară de cristalizare a CaOx și a furnizat citrat. În al doilea rând, conținea polifenoli din plante care erau capabili să atenueze stresul oxidativ și inflamația, inhibând astfel litogeneza CaOx. În mod fundamental, oxalatul este sintetizat endogen în ficat folosind glioxilatul ca precursor proeminent41. Glioxilatul este sintetizat din glicolat de către enzima glicolat oxidază (GO) și este ulterior transformat în oxalat de către lactat dehidrogenază (LDH). Am descoperit că HydroZitLa a redus semnificativ excreția urinară de oxalat la șobolanii tratați cu EG. Am speculat că HydroZitLa a inhibat calea sintetică a oxalatului în ficat prin reglarea în jos a enzimelor hepatice implicate în metabolismul glioxilatului, în special LDH și GO. Studiul anterior realizat de Kailash și Varalakshmi a demonstrat că extractul de tulpină de banană a redus nivelurile hepatice de GO și LDH la șobolanii hiperoxaluric induși de glicolat de sodiu27. Poonguzhali și Chegu au raportat, de asemenea, că extractul brut din tulpini de banană a redus oxalatul urinar, acidul glicolic și acidul glioxilic la șobolanii hiperoxaluric induși de glicolat30. Recent, Patankar et al. au demonstrat că formula lor pe bază de plante, numită Herbmed Plus (conținând tulpină de banană), a redus nivelul activității LDH în țesuturile hepatice și renale42. Pentru a verifica speculațiile noastre, expresia enzimelor hepatice și renale implicate în sinteza oxalaților la șobolanii EG tratați cu HydroZitLa ar trebui explorată în continuare.

Mai multe linii de dovezi susțin cu tărie că stresul oxidativ, inflamația și leziunea tubulară renală sunt implicate critic în litogeneza CaOx3,4,15,43-45. Stresul oxidativ indus de cristalele de oxalat și/sau CaOx provoacă leziuni tubulare renale care creează locuri pentru nuclearea cristalelor, aderență, retenție, agregare și, în final, o formare de nidus43,46,47. Mai mult, stresul oxidativ activează reacția inflamatorie care, la rândul său, accelerează procesul litogenic4,47,48. Prin urmare, fitomedicina care are proprietăți antioxidante și antiinflamatorii este o măsură promițătoare pentru prevenirea formării pietrelor la rinichi24. Aggarwal și colab. a demonstrat în modelul de șobolan nefrolitic indus de EG că bergenina (compus fenolic bioactiv izolat din Bergenia ligulata) a avut un efect antipatogen puternic pentru a atenua stresul oxidativ, a ameliora disfuncția mitocondrială și a reduce leziunile tubulare și infamația49. Rutina și curcumina (fitochimice indigene bine-cunoscute cu proprietăți antioxidante și antiinflamatorii) au demonstrat că inhibă deteriorarea tubulointerstițială și depunerile de cristale la șobolanii nefrolitici induși de EG50. De asemenea, s-a demonstrat că polifenolii din semințe de struguri inhibă depunerile de cristale intrarenale de CaOx la șobolanii de litiază indusă de EG, în mod plauzibil prin activitatea lor antioxidantă51. S-a demonstrat că o formulă de plante Ayurveda Herbmed reduce leziunile inflamatorii și depunerile de cristale în rinichii șobolanilor nefrolitici induși de EG42. În acest studiu, am arătat că HydroZitLa a scăzut stresul oxidativ intrarenal, inflamația și depozitele de cristale de CaOx, sugerând că HydroZitLa a exercitat acțiuni antioxidante și antiinflamatorii pentru a preveni formarea pietrelor renale de CaOx.

Mai mulți polifenoli vegetali s-au dovedit experimental a fi benefici pentru prelungirea duratei de viață și întârzierea îmbătrânirii52. Resveratrolul este cel mai bine caracterizat compus polifenolic care prelungește durata de viață. Acţionează în primul rând prin activarea sirtuinei şi prin atenuarea stresului oxidativ53. Efectul de longevitate al resveratrolului testat în modelul C. elegans variază între studii, cu o creștere a duratei medii de viață variind de la 10 la 65% 54,55. HydroZitLa a prelungit semnificativ durata de viață a C. elegans de tip sălbatic cu până la 34 la sută, fără semne de toxicitate, sugerând că efectul de extindere a duratei de viață al HydroZitLa a fost comparabil cu cel al resveratrolului. Restricția alimentară este un mecanism cheie cunoscut în longevitate56. Ratele de pompare faringiană în comparație între viermii HydroZitLa și viermii de control au fost comparabile, ceea ce indică faptul că prelungirea duratei de viață a HydroZitLa nu a fost rezultatul restricțiilor alimentare.

HydroZitLa a scăzut semnificativ acumularea de pigment de vârstă autofluorescent lipofuscină în C. elegans, sugerând un efect anti-îmbătrânire. ROS și stresul oxidativ sunt inductori bine cunoscuți ai SIPS, iar stresul oxidativ accelerează scurtarea telomerilor57. Am demonstrat recent că oxalatul, COM și urina de la pacienții cu calculi CaOx au indus senescența prematură, reglarea p16 și uzura telomerilor în celulele tubulare renale prin stresul oxidativ 58. În acest studiu, am arătat că HydroZitLa a inhibat uzura telomerilor, reglarea p16 și senescență prematură în celulele HK-2 expuse la H2O2, oxalat și COM. Deși mecanismul molecular pentru acest efect anti-îmbătrânire nu a fost elaborat, HydroZitLa a fost sugerat pentru a preveni mecanic senescența prematură prin inhibarea scurtării telomerilor și reglarea în jos a expresiei p16.

Deși remediile pe bază de plante și fitomedicamentele devin progresiv populare și acceptate la nivel global, trebuie furnizate dovezi științifice ale eficacității și siguranței și nu ar trebui să fie compromise. Interacțiunea plante-medicament este cu greu prezisă, deoarece este foarte variată între indivizi, în funcție de mai mulți factori, cum ar fi polimorfismele enzimei citocromului P450 și transportatorii de medicamente și afecțiunile medicale existente59. Efectele adverse ale administrării concomitente de plante și medicamente trebuie monitorizate îndeaproape pentru a identifica potențialele interacțiuni plante-medicament. Cele mai cunoscute ierburi care au interacționat serios cu medicamentele includ usturoiul, Baizhi, Danggui, ginseng, ginkgo, lemn dulce, sunătoare, Kava, piper negru și lung, Danshen, Huangqin și ciulinul de lapte59. Din cunoștințele noastre, nu au fost raportate efecte secundare grave sau interacțiuni medicamentoase pentru tulpina de banană, floarea fluturelui de mazăre albastră și lemnul de sapan. În Thailanda, tulpina de banană este consumată ca ingredient alimentar. Consumul excesiv de suc din tulpini de banane poate provoca alergii, dureri abdominale și vărsături, de aceea este recomandat un consum moderat. Floarea albastră de mazăre este folosită în mod obișnuit în alimente ca colorant natural și este, de asemenea, folosită pentru prepararea ceaiului. Efectele adverse ale consumului excesiv de ceai din flori de mazăre albastră fluture, de exemplu, tulburări de stomac, greață și reacții alergice, sunt rareori raportate. Lemnul Sappan este, de asemenea, folosit frecvent ca colorant alimentar natural, iar în comunități (inclusiv comunitățile din Thailanda) este consumat în mod obișnuit ca o băutură sănătoasă. Cu toate acestea, funcția contraceptivă (antifertilitate la bărbați) a extractului de lemn de sapan este demonstrată pe un model de șobolan, deoarece interferează cu spermatogeneza60. Pe de altă parte, duramenul de Caesalpinia sappan L. este folosit ca tratament medicinal pentru simptomele ginecologice, inclusiv oligomenoree și amenoree61. Prin urmare, siguranța consumului pe termen lung de HydroZitLa la om rămâne să fie stabilită în cadrul studiului clinic.

Acest studiu are unele limitări. Compușii activi precisi responsabili pentru funcția inhibitoare a pietrei de CaOx nu au fost identificați și caracterizați. Mecanismele exacte ale HydroZitLa de a inhiba formarea pietrelor de CaOx la șobolani nu au fost investigate pe larg. Efectul antipatogen dependent de doză al HydroZitLa nu a fost investigat. Nu a fost explorată doza de HydroZitLa care ar putea crește semnificativ nivelurile de citrat urinar la șobolanii nefrolitici. Profilul fenolic al HydroZitLa ar trebui investigat în continuare. Mecanismul de promovare a longevității de către HydroZitLa la C. elegans nu a fost explorat intens. În cele din urmă, compușii specifici din HydroZitLa responsabili pentru longevitate și anti-îmbătrânire nu au fost identificați și caracterizați.

În concluzie, HydroZitLa a fost dezvoltat pentru a normaliza simultan factorii de risc ai formării pietrelor de CaOx prin furnizarea de lichid, citrat și antioxidanți naturali. Experimental, HydroZitLa a inhibat depozitul intrarenal de CaOx la șobolanii nefrolitici. Eficacitatea inhibitoare a pietrei de CaOx a HydroZitLa a fost echivalentă cu citratul de potasiu utilizat în prezent (Uralyt-U). HydroZitLa a atenuat eficient stresul oxidativ atât in vitro, cât și in vivo. În mod remarcabil, HydroZitLa a prelungit durata de viață și a întârziat debutul îmbătrânirii la C. elegans. În plus, HydroZitLa a inhibat semnificativ scurtarea telomerilor, expresia p16 și senescența prematură în celulele renale umane. Aceste descoperiri preclinice au sugerat că HydroZitLa a fost o alternativă promițătoare din punct de vedere clinic pentru tratamentul nefrolitiazei CaOx, însoțită de promovarea longevității și de beneficii anti-îmbătrânire. Sunt necesare studii clinice pentru a garanta eficacitatea terapeutică a HydroZitLa la om.

Materiale și metode

Producția HydroZitLa, conținutul de antioxidanți și faptele nutriționale. HydroZitLa este un concentrat de băuturi derivate din plante medicinale, disponibil local în Tailand32. Băutura se prepară prin diluarea concentratului HydroZitLa (55 ml într-o pungă sigilată) cu apă de băut (până la volumul final de 500 ml). Are o culoare roz-violet cu un gust acru și dulce delicios. Principalele ingrediente ale HydroZitLa au fost extract de apă din tulpina de banană (Musa sapientum L.) și acid citric (16 mEq/pungă). Ca coloranți naturali s-au folosit plante medicinale tradiționale Tai, inclusiv Clitoria ternatea L. (pulbere de flori de mazăre albastră de fluture) și Caesalpinia sappan L. (pulbere de lemn de sappan). Stevia și sucraloza erau îndulcitori. Produsul a fost aprobat de Tai FDA pe 10 aprilie 2019, în categoria băuturi într-un recipient sigilat (Food nr. de serie 10–1-02,244–5-0005).

Capacitatea antioxidantă totală (TAC) a HydroZitLa a fost de 21,87 ± 7,96 mg capacitate antioxidantă echivalentă cu vitamina C per pungă (Figura 8 suplimentară). Conținutul total de fenolici (TPC) a fost de 19,99 ±0,83 mg echivalent acid galic/100 g. Conținutul total de favonoide (TFC) a fost de 4,59 ± 0,31 mg echivalent catechină/100 g. Pentru controlul calității, TAC, TPC și TFC au fost utilizați ca parametri de control al calității. Nivelurile de TAC, TPC și TFC din tulpina de banană, floarea de mazăre albastră fluture și extractele de lemn de sapan între loturi și momentele de depozitare nu au fost semnificativ diferite. În producția de HydroZitLa, valorile TAC, TPC, TFC și brix (17±2) au fost utilizate ca parametri de control al calității pentru a menține consistența între loturi.

Energia totală a HydroZitLa pe plic (porție) a fost de 25 kcal. Nu au fost detectate conținuturi de proteine, grăsimi și colesterol. Carbohidrații totale a fost de 6 g, zahăr a fost<1 g, and sodium was 10 mg. The potassium content was 240 mg/100 g. Soluble and insoluble dietary fibers were 0.74 and 0.43 g/100 g, respectively. Te pH of  HydroZitLa was 3.4.

Evaluarea toxicității.Prezența Escherichia coli, Clostridium spp., Salmonella spp. și Staphylococcus aureus în HydroZitLa a fost analizată de Biroul pentru Calitatea și Siguranța Alimentelor, Ministerul Sănătății Publice, Thailanda. Profilul metalic al HydroZitLa a fost analizat de ICP-OES.

Toxicitatea acută in vivo a HydroZitLa la șoareci a fost testată de Institutul de Cercetare a Plantelor Medicinale, Ministerul Sănătății Publice, Thailanda. HydroZitLa sau apă (martor) a fost administrată oral la șoareci la o doză de 20 ml/kg (n=10 per grup). Șoarecii au fost observați timp de 14 zile înainte de necropsie. Leziunile macroscopice în organele viscerale au fost examinate și comparate între grupurile HydroZitLa și de control.

Testul de agregare a CaOx.Cristalele de semințe COM au fost preparate62 și diluate la 50 mg/mL în 0.05 M Tris/0.15 NaCl, pH 6,5. HydroZitLa, sau BSA, sau apă distilată (martor) (200 uL) a fost adăugată la suspensia COM de semințe de lucru proaspăt preparată (2 mL). După amestecare, absorbanța la 620 nm a fost măsurată ca linie de bază (AT0). După incubare la 37 de grade timp de 10 minute, absorbanța la 620 nm a fost măsurată din nou (AT10). Coeficientul de agregare (AC) a fost calculat după cum urmează: AC=((AT0− AT10)/10)×1000. O valoare AC mai mare indică o agregare COM mai mare.

Linia celulară, citotoxicitatea și determinarea ROS intracelular.Celulele HK{{0}} (ATCC, VA, SUA) au fost menținute în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin și 1% Pen-Strep sub 37 de grade, 5% CO2 și 95% umiditate. Citotoxicitatea HydroZitLa în celulele HK-2 a fost evaluată prin testul MTT63. Celulele HK-2 au fost însămânțate (200 celule/godeu), crescute peste noapte într-o placă de 96-godeuri și tratate cu concentrații variate de HydroZitLa (0 ca martor, 1,25 la sută, 2,5 la sută, 5 la sută, 10 la sută, 20 la sută, 40 la sută, 50 la sută, 80 la sută și 100 la sută v/v) timp de 24 de ore. După spălare, soluția MTT a fost adăugată, incubată timp de 1 oră și apoi aruncată. S-a adăugat dimetil sulfoxid pentru a solubiliza cristalele de formazan. A fost măsurată absorbția la 570 nm. Viabilitatea celulară (procent) a fost calculată utilizând celule netratate ca martor (viabilitate 100%).

Inhibarea producției intracelulare de ROS de către HydroZitLa a fost determinată prin testul diacetat de dicloro-dihidro-fluoresceină (DCFH-DA) într-o placă de godeuri 96-64,65. Celulele HK-2 au fost combinate cu soluție de 0,1 M DCFH-DA și incubate la 37 de grade timp de 30 min. După spălare, celulele au fost provocate cu H2O2 sau COM (cu și fără 10 procente v/v HydroZitLa). Intensitatea fluorescentă (excitată la 485 nm și emisă la 535 nm) a fost măsurată la început (T0) și 60 min (T60). Unitatea fluorescentă arbitrară (AFU), care a indicat nivelul de generare a ROS, a fost calculată după cum urmează: AFU= T60/T0.

Măsurarea carbonilării proteinelor.Conținutul de proteine ​​​​carbonil, ca indicator al oxidării proteinelor, a fost măsurat conform rapoartelor noastre anterioare64-66. Celulele HK-2 tratate (în vasul de 100-mm) au fost lizate prin tampon de testare de radioimunoprecipitare care conține un cocktail inhibitor de protează. Concentrația totală de proteine ​​a fost măsurată prin testul Bradford. Lizatul celular a fost incubat cu soluție de dinitrofenilhidrazină (DNPH) 10 mM sau HCI 2 N timp de 1 oră la întuneric. S-a adăugat acid tricloracetic 20% rece și s-a incubat timp de 10 minute pe gheață. Peletele au fost colectate prin centrifugare, spălate cu acetat de etil: etanol (1:1) şi re-dizolvate cu 6 M guanidină HCI. A fost măsurată absorbanța (A) la 375 nm. Conținutul de protein carbonil normalizat prin concentrația totală de proteine ​​a fost calculat după cum urmează: ((ADNPH – AHCl)×45,45)/concentrație de proteine.

Model de șobolan pentru nefrolitiaza CaOx.EG (1 la sută v/v) suplimentat în apă de băut (acces liber ad libitum, timp de 35 de zile) a fost utilizat pentru inducerea nefrolitiază CaOx la șobolani. Șobolanii masculi Wistar (6–8 săptămâni, 180–300 g) au fost împărțiți în patru grupe, și anume, EG (n=6), EG plus HydroZitLa (n{=6), EG plus Uralyt-U (n=6) și grupuri de control normal (n=2). Toți șobolanii au fost găzduiți în cuști din oțel inoxidabil la 25 de grade sub un ciclu lumină-întuneric de 12:12 h. Doi șobolani martor au fost utilizați în mod intenționat numai pentru compararea depozitelor de CaOx în rinichii de șobolan și imunohistochimia, nu pentru chimia urinei. HydroZitLa și Uralyt-U au fost hrănite forțat de două ori pe zi (dimineața și seara) cu o doză totală de citrat de 2 mEq pe zi. Această doză de citrat administrată a fost echivalentă cu 60,8 mEq citrat la om calculată pe baza conversiei dozei propuse de Reagan-Shaw et al.67. 24-h probe de urină au fost colectate la sfârșitul intervenției (ziua 35) folosind timol ca conservant. Șobolanii au fost anesteziați cu izofluran și sacrificați. Ambii rinichi au fost îndepărtați, tăiați și fixați în tampon de formol neutru 10% pentru studiul histologic.

Toți șobolanii au fost achiziționați de la Centrul Național de Animale de Laborator, Salaya Campus Mahidol University, Nakhonpathom, Thailanda. Procedurile experimentale au fost efectuate conform ghidurilor pentru animale de experiment de către Consiliul Național de Cercetare din Thailanda și aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor, Facultatea de Medicină, Universitatea Chulalongkorn (Nr. 022/2560). Studiul nostru a fost realizat în conformitate cu ghidurile ARRIVE.

Depunerea de CaOx în secțiuni renale prin microscopie polarizată.Secțiunile de rinichi de șobolan fixate în formalină încorporate în parafină au fost preparate de un procesor de țesut automat. Colorarea H&E a fost efectuată conform procedurii standard. Depunerile de cristale de CaOx birefringente în secțiunile colorate cu H&E au fost vizualizate folosind un microscop cu lumină polarizată (OLYMPUS BX50, Japonia).

Colorație Yasue pentru histochimia CaOx.Secțiunile de țesut renal au fost deparafinate, rehidratate, scufundate în acid acetic 5% timp de 30 de minute pentru a îndepărta fosfatul de calciu și carbonatul de calciu și spălate cu apă distilată 68. Secțiunile au fost incubate cu 5% AgNO3 timp de 12 minute, spălate și incubate cu rubenic saturat. acid în 10% amoniu timp de 1 min. Secțiunile colorate au fost clătite cu 50% etanol, spălate cu apă distilată, deshidratate, curățate și montate. Precipitate de CaOx negru au fost vizualizate la microscop cu lumină69.

Colorație imunohistochimică.După deparafinizare și rehidratare, extragerea antigenului a fost efectuată prin fierbere în tampon citrat de sodiu folosind un cuptor cu microunde. H2O2 endogen a fost inactivat prin incubare cu 0,3% H2O2 timp de 30 min. Legarea nespecifică a fost blocată prin incubarea cu ser normal de cal timp de 20 de minute. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorp primar 1:1,000 4-HNE (ab46545, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) sau caspază scindată-3 (5A1E, Cell Signaling Technology, MA, SUA) la 4 grade peste noapte, urmată de incubare cu anticorp secundar la 37 de grade timp de 30 min. După spălare, secțiunile au fost incubate cu reactiv ABC (kit VECTASTAIN® ABC) timp de 30 de minute, înmuiate în reactiv de colorare cu diaminobenzidină 1% timp de 5 minute și contracolorate cu hematoxilină timp de 5 minute. În cele din urmă, secțiunile au fost deshidratate, curățate, montate și vizualizate la microscop cu lumină.

Măsurătorile de citrat urinar, oxalat, acid uric și iCOCI. Nivelul urinar de citrat a fost determinat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (Varian Medical Systems, CA, SUA) utilizând coloana ROAorganic Acid H plus (300×7,8 mm) (Phenomenex, CA, SUA) și eluat cu 5 mM H2S04 la un debit de 0,5 mL/min. Nivelurile de oxalat urinar și acid uric au fost măsurate prin electroforeză capilară (Beckman Coulter, CA, SUA) separate la 25 de grade cu o tensiune de -20 kV. Testul iCOCI urinar a fost efectuat conform raportului nostru anterior 38.

C. elegans tulpina si intretinerea.Tulpina Bristol N2 de tip sălbatic C. elegans și sursa sa de hrană de laborator E. coli OP50 au fost obținute de la Centrul de Genetică Caenorhabditis, Universitatea din Minnesota, SUA. Au fost cultivate și menținute în plăci de agar mediu de creștere a nematodelor cu un gazon de E. coli OP50 la 20 grade 70. Toate experimentele au fost efectuate pe viermi tineri adulți sincronizați cu vârsta.

Testul duratei de viață.Analiza duratei de viață a fost efectuată în medii lichide71. Pe scurt, 10 nematozi adulți tineri sincronizați în funcție de vârstă au fost transferați într-o placă de 24-godeuri cu tampon M9 împreună cu E. coli OP50 și 5-fuoro-2′-deoxiuridină pentru prevenirea producției de descendenți. S-au adăugat diferite concentrații de HydroZitLa folosind apă distilată ca vehicul de control. Nematozii vii au fost numărați la fiecare 24 de ore. Nematozii au fost considerați morți atunci când nu au răspuns la împingerea blândă folosind bucla de platină.

Test de pompare faringiană.Pomparea faringiană (un indicator al capacității de aport de alimente) a fost măsurată la nematozi adulți tineri (~10) în comparație între control și suplimentarea cu HydroZitLa, prin monitorizarea contracției faringiene timp de 30 s la fiecare 24 de ore sub stereomicroscop (SMZ{ {3}}, Motic, China) în zilele 0 (înainte de suplimentare), 5, 10 și 1572.

Testul lipofuscinei.A fost monitorizată acumularea de lipofuscină în nematozii de tip sălbatic după suplimentarea cu diferite concentrații de HydroZitLa (20%, 30%, 40% v/v) timp de 5 zile. Viermii hrăniți cu E. coli OP50-au fost utilizați ca martor. După intervenție, viermii au fost spălați folosind tampon M9 de mai multe ori și plasați pe o lamă de sticlă într-o picătură de azidă de sodiu. Imagistica fluorescentă a fost efectuată folosind microscopul confocal ZEISS LSM 700. Imaginile au fost analizate în continuare folosind software-ul Image J, iar intensitatea fluorescenței a fost prezentată ca unități arbitrare (AU)72.

Măsurarea lungimii relative a telomerilor. Lungimea relativă a telomerilor (RTL) a fost măsurată în celule HK-2 tratate cu H2O2 (25 µM), oxalat de sodiu (NaOx, 900 µM) și COM (25 µg/cm2) cu sau fără HydroZitLa (10% v /v). RTL a fost determinat prin reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qPCR)73. Se calculează pe baza raportului dintre numărul de copii ale repetărilor telomerice și numărul de copii ale unei gene cu o singură copie (genă 36B4) care este proporțional cu lungimea medie a telomerilor. Primerii utilizați au fost următorii: Telomer (înainte) 5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGGTT-3′, Telomer (invers) 5′-GGC TTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT{-3′′, 34B}-GTCAAGCC-3′′ (înainte) }}′ și 36B4 (invers) 5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′. PCR a fost amplificată la 95 de grade timp de 10 minute, urmată de 40 de cicluri de 95 de grade timp de 15 s și 54 de grade timp de 1 min.

Dublă colorare a SA‑‑gal și p16.Celulele HK{{0}} crescute pe lame de acoperire au fost tratate cu H2O2, NaOx și COM cu și fără 10% v/v HydroZitLa timp de 72 de ore pentru inducerea SIPS. După tratament, celulele au fost fixate și colorate cu soluție X-gal proaspăt preparată (Vivantis, Malaezia) timp de 12-16 ore, spălate, permeabilizate cu 0,1% Triton X-100 (Amresco, TX, SUA) timp de 3 minute și blocat pentru legarea nespecifică cu 1% ser normal de cal (Gibco, MA, SUA) la 37 de grade timp de 1 oră. Celulele au fost apoi incubate cu 1:10,000 anticorp primar p16 (ab108349, Abcam) la 4 grade peste noapte, urmat de 1:10,000 Alexa Fluor® 488-anticorp secundar conjugat ( Tehnologia de semnalizare celulară) la 37 de grade timp de 30 de minute. Lama de acoperire colorată a fost montată cu mediu de montare Fluoroshield cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Abcam). Celulele senescente SA- -gal-pozitive (albastre) și celulele care exprimă p16-(verde) au fost vizualizate și fotografiate folosind sistemul de imagistică EVOS FL Auto 2 (Thermo Fisher Scientific, MA, SUA).

Analize statistice.Toate datele au fost prezentate ca medie ± abatere standard sau mediană (interval intercuartil), după caz. Testul t cu două probe sau testul Mann-Whitney a fost efectuat pentru a testa diferența dintre cele două grupuri. Analiza unidirecțională a varianței sau testul Kruskal-Wallis, urmată de testul de comparație multiplă, a fost utilizată pentru a testa diferența între trei sau mai multe grupuri. GraphPad Prism Software versiunea 9 (GraphPad Sofware Inc., CA, SUA) a fost folosită pentru calcul și grafice. P<0.05 was considered significant.

Referințe

1. Michell, AR Urolithiaza–aspecte istorice, comparative și fiziopatologice: o revizuire. JR Soc. Med. 82, 669–672 (1989).

2. Shah, J. & Whitfield, HN Urolitiaza de-a lungul veacurilor. BJU Int. 89, 801–810 (2002).

3. Boonla, C. şi colab. Expresia ARN mesager a proteinei chemoatractante de monocite-1 și interleukinei-6 în rinichii care conțin calculi. BJU Int. 101, 1170–1177 (2008).

4. Boonla, C. şi colab. Fibroză și dovezi pentru tranziția epitelial-mezenchimală în rinichi la pacienții cu calculi de cerb. BJU Int. 108, 1336–1345 (2011).

5. Chuang, TF și colab. Riscul de boală cronică de rinichi la pacienții cu pietre la rinichi - un studiu de cohortă la nivel național. BMC Nephrol. 21, 292 (2020).

6. Dhondup, T. şi colab. Risc de BRST și mortalitate la formatorii de pietre la rinichi și la vezica urinară. A.m. J. Rinichi Dis. 72, 790–797 (2018).

7. Kum, F. şi colab. Pietrele mai ucid? O analiză a morții cauzate de boala pietrei 1999-2013 în Anglia și Țara Galilor. BJU Int. 118, 140–144 (2016).

8. Geraghty, RM, Cook, P., Walker, V. & Somani, BK Evaluarea poverii economice a bolii de pietre la rinichi în Marea Britanie: Un studiu de cohortă retrospectiv cu o urmărire medie de 19 ani. BJU Int. 125, 586–594 (2020).

9. C. Türk (Președinte), AN, A. Petrik, C. Seitz, A. Skolarikos (Vicepreședinte), K. Tomas & Guidelines Associates: NF Davis, JFD, R. Lombardo, N. Grivas, Y. Ruhayel. Ghidul Asociației Europene de Urologie (EAU) privind Urolitiaza.

10. Jendle-Bengten, C. & Tiselius, HG Urmărirea pe termen lung a formatorilor de calculi tratați cu o doză mică de citrat de sodiu și potasiu. Scand. J. Urol. Nefrol. 34, 36–41 (2000).

11. Schwille, PO, Herrmann, U., Wolf, C., Berger, I. & Meister, R. Citrat și urolitiază de calciu idiopatică recurentă. Un studiu pilot longitudinal privind efectele metabolice ale citratului de potasiu pe cale orală, administrat în timpul medicației pe termen scurt, mediu și lung la pacienții de sex masculin cu pietre. Urol. Res. 20, 145–155 (1992).

12. Tracy, CR & Pearle, MS Actualizare cu privire la managementul medical al bolii de pietre. Curr. Opinează. Urol. 19, 200–204 (2009).

13. Mechlin, C., Kalorin, C., Asplin, J. & White, M. Splenda (R) îmbunătățește toleranța suplimentelor orale de citrat de potasiu pentru prevenirea formării pietrelor: Rezultatele unui studiu randomizat dublu-orb. J. Endourol. 25, 1541–1545 (2011).

14. Boonla, C. Oxidative Stress in Urolithiasis, Reactive Oxygen Species (ROS) in Living Cells, Cristiana Filip si Elena Albu, IntechOpen.

15. Boonla, C., Wunsuwan, R., Tungsanga, K. & Tosukhowong, P. Urinary 8-hidroxideoxiguanozina este crescută la pacienții cu nefrolitiază. Urol. Res. 35, 185–191 (2007).

16. Khan, SR Stresul oxidativ indus de hiperoxalurie și antioxidanți pentru protecția renală. Urol. Res. 33, 349–357 (2005).

17. Khan, SR Specii reactive de oxigen ca modulatori moleculari ai formării pietrelor la rinichi de oxalat de calciu: Dovezi din investigații clinice și experimentale. J. Urol. 189, 803–811 (2013).

18. Kittikowit, W. et al. Creșterea leziunii oxidative ADN observată în biopsiile renale adiacente calculilor la pacienții cu nefrolitiază. Urolithiazis 42, 387–394 (2014).

19. Yasui, T. et al. Tratamentul pe bază de fiziopatologie al urolitiazelor. Int. J. Urol. 24, 32–38 (2017).

20. Huang, HS, Ma, MC & Chen, J. Dieta cu conținut scăzut de vitamina E exacerbează formarea de cristale de oxalat de calciu prin creșterea stresului oxidativ în rinichiul hiperoxaluric de șobolan. A.m. J. Physiol. Renal. Physiol. 296, F34-45 (2009).

21. Huang, HS, Chen, J., Chen, CF & Ma, MC Vitamina E atenuează formarea de cristale în rinichii de șobolan: Rolurile morții celulelor tubulare renale și inhibitorii de cristalizare. Rinichi Int. 70, 699–710 (2006).

22. Tamilselvan, S. & Menon, M. Terapia cu vitamina E previne depunerea cristalelor de oxalat de calciu induse de hiperoxalurie în rinichi prin îmbunătățirea statusului antioxidant al țesutului renal. BJU Int. 96, 117–126 (2005).

23. Tamilselvan, S. & Selvam, R. Efectul vitaminei E și al manitolului asupra retenției renale de oxalat de calciu în nefrolitiaza experimentală. Indian J. Biochem. Biophys. 34, 319–323 (1997).

24. Butterweck, V. & Khan, SR Medicamente din plante în managementul urolitiazelor: alternativă sau complementară? Planta Med. 75, 1095–1103 (2009).

25. Kasote, DM, Jagtap, SD, Tapa, D., Khyade, MS & Russell, WR Remedii pe bază de plante pentru pietrele urinare utilizate în India și China: O revizuire. J. Etnofarmacol. 203, 55–68 (2017).

26. Abu Zarin, M., Tan, JS, Murugan, P. & Ahmad, R. Investigarea activității potențiale anti-urolitiază din diferite tipuri de extracte de pseudo-tulpini Musa în inhibarea cristalizării oxalatului de calciu. BMC Complement Med. Ter. 20, 317 (2020).

27. Kailash, P. & Varalakshmi, P. Efectul sucului de tulpină de banane asupra modificărilor biochimice în ficatul șobolanilor normali și hiperoxaluric. Indian J. Exp. Biol. 30, 440–442 (1992).

28. Prasad, KV, Bharathi, K. & Srinivasan, KK Evaluarea lui Musa (paradisiacal Linn. cultivar) – suc de tulpină „Puttubale” pentru activitate antilitiatică la șobolani albinoși. Indian J. Physiol. Pharmacol. 37, 337–341 (1993).

29. Panigrahi, PN, Dey, S., Sahoo, M. & Dan, A. Eficacitatea antiurolitiatică și antioxidantă a pseudostemului Musa paradisiaca asupra nefrolitiază indusă de etilenglicol la șobolan. Indian J. Pharmacol. 49, 77–83 (2017).

30. Poonguzhali, PK & Chegu, H. Te influența extractului de tulpină de banană asupra factorilor de risc urinar pentru calculi la șobolani normali și hiperoxaluric. Br. J. Urol. 74, 23–25 (1994).

31. Pillai, RG Miezul pseudotulpinii lui Musa în tratamentul calculilor urinari. Anc Sci Life. 15, 2–6 (1995).

32. Lordumrongkiat, N., Chotechuang, N., Madared, N., Jindatip, D. & Boonla, C. Total fenolici, flavonoid total și capacitatea antioxidantă totală a băuturii derivate din plante medicinale: HydroZitLa. Chula Med. J. 64, 381–388 (2020).

33. Sakhaee, K. Farmacologia bolii pietrei. Adv. Dis. renală cronică. 16, 30–38 (2009).

34. Baumann, JM & Afolter, B. Rolul paradoxal al macromoleculelor urinare în agregarea oxalatului de calciu: O altă cerere pentru creșterea diurezei în metafilaxia pietrei. Urolithiaza 44, 311–317 (2016).

35. Reddy, AJ et al. Efectele anticonvulsivante și antioxidante ale extractului de tulpină de Musa sapientum asupra modelelor experimentale acute și cronice de epilepsie. Pharmacogn. Res. 10, 49–54 (2018).

36. Jaafar, NF, Ramli, ME & Mohd Salleh, R. Condiție optimă de extracție a Clitorea ternatea pentru activitățile antioxidante, conținutul total de fenolici, flavonoide totale și conținutul total de antociani. Trop. Life Sci. Res. 31, 1–17 (2020).

37. Nirmal, NP, Rajput, MS, Prasad, RG & Ahmad, M. Brazilin din duramen Caesalpinia sappan și activitățile sale farmacologice: o revizuire. Pac asiatic. J. Trop. Med. 8, 421–430 (2015).

38. More-Krong, P. et al. Validarea clinică a testului indicelui de cristalizare a oxalatului de calciu cu reacție la indol urinar (iCOCI) pentru diagnosticarea urolitiază de oxalat de calciu. Sci. Rep. 10, 8334 (2020).

39. Yasui, T. et al. Efectele citratului asupra formării calculilor renali și asupra expresiei osteopontinei într-un model de urolitiază de șobolan. Urol. Res. 29, 50–56 (2001).

40. Ghaeni, FA, Amin, B., Hariri, AT, Meybodi, NT & Hosseinzadeh, H. Efectele antilitiatice ale crocinei asupra litiază indusă de etilenglicol la șobolani. Urolithiazis 42, 549–558 (2014).

41. Holmes, RP & Assimos, DG Sinteza glioxilatului și modularea și influența acestuia asupra sintezei oxalaților. J. Urol. 160, 1617–1624 (1998).

42. Patankar, S., Fanthome, B. & Bhalerao, SS Eficacitatea plantelor plus la șobolanii urolitici: un studiu experimental. J. Ayurveda Integr. Med. 11, 250–255 (2020).

43. Chaiyarit, S. & Tongboonkerd, V. Disfuncția mitocondrială și boala de pietre la rinichi. Front Physiol. 11, 566506 (2020).

44. Holoch, PA & Tracy, CR Antioxidanții și istoricul auto-raportat al pietrelor la rinichi: Sondajul național de examinare a sănătății și nutriției. J. Endourol. 25, 1903–1908 (2011).

45. Khan, SR Este stresul oxidativ, o legătură între nefrolitiază și obezitate, hipertensiune arterială, diabet, boală cronică de rinichi, sindrom metabolic? Urol. Res. 40, 95–112 (2012).

46. ​​Hirose, M. şi colab. Leziunea celulelor epiteliale tubulare renale și stresul oxidativ induc formarea de cristale de oxalat de calciu în rinichii de șoarece. Int. J. Urol. 17, 83–92 (2010).

47. Khan, SR Specii reactive de oxigen, inflamație și nefrolitiază cu oxalat de calciu. Transl. Androl. Urol. 3, 256–276 (2014).

48. Boonla, C. şi colab. Proteinele inflamatorii și fibrotice aliate proteomice identificate ca constituenți cheie ai proteinelor în urină și matricea pietrelor la pacienții cu calculi renali. Clin. Chim. Acta 429, 81–89 (2014).

49. Aggarwal, D., Gautam, D., Sharma, M. & Singla, SK Bergenina atenuează leziunea renală prin inversarea disfuncției mitocondriale în modelul de șobolan hiperoxaluric indus de etilenglicol. EURO. J. Pharmacol. 791, 611–621 (2016).

50. Ghodasara, J., Pawar, A., Deshmukh, C. & Kuchekar, B. Efectul inhibitor al rutinei și curcuminei asupra urolitiază de oxalat de calciu indusă experimental la șobolani. Pharmacogn. Res. 2, 388–392 (2010).

51. Grases, F. et al. Efectele polifenolilor din semințele de struguri asupra litiazelor renale. Oxid. Med. Celulă. Longev. 2015, 813737 (2015).

52. Cherniack, EP Influența potențială a polifenolilor din plante asupra procesului de îmbătrânire. Forsch Komplementmed. 17, 181–187 (2010).

53. Wood, JG şi colab. Activatorii de sirtuină imită restricția calorică și întârzie îmbătrânirea la metazoare. Nature 430, 686–689 (2004).

54. Bonkowski, MS & Sinclair, DA Încetinirea îmbătrânirii prin proiectare: creșterea NAD( plus ) și a compușilor care activează sirtuina. Nat. Pr. Mol. Celulă. Biol. 17, 679–690 (2016).

55. Bhullar, KS & Hubbard, BP Extinderea duratei de viață și a duratei de sănătate prin resveratrol. Biochim. Biophys. Acta. 1852, 1209–1218 (2015).

56. von Frieling, J. & Roeder, T. Factorii care afectează traducerea restricției alimentare într-o viață mai lungă. IUBMB Life 72, 814–824 (2020).

57. von Zglinicki, T. Stresul oxidativ scurtează telomerii. Trends Biochem Sci. 27, 339–344 (2002).

58. Chuenwisad, K. și colab. Senescența prematură și scurtarea telomerilor induse de stresul oxidativ de la oxalat, oxalat de calciu monohidrat și urina de la pacienții cu nefrolitiază cu oxalat de calciu. Față. Imunol. 12, 696486 (2021).

59. Hu, Z. şi colab. Interacțiuni plante medicinale: o revizuire a literaturii. Drugs 65, 1239–1282 (2005).

60. Susanti, S. & Imannura, P. Efectul extractului de lemn de Secang (Ceasalpinia Sappan L.) asupra morfologiei spermatozoizilor și a procesului reversibil la șobolani masculi. În continuarea celei de-a doua conferințe internaționale comune. ISBN: 978-602-5842-03-0 (2018).

61. Kim, BS şi colab. Caesalpinia sappan induce moartea celulelor apoptotice în celulele endometriale ectopice 12Z prin suprimarea expresiei piruvat dehidrogenazei kinazei 1. Exp. Ter. Med. 21, 357 (2021).

62. Boonla, C., Youngjermchan, P., Pumpaisanchai, S., Tungsanga, K. & Tosukhowong, P. Activitatea litogenă și relevanța clinică a lipidelor extrase din urine și pietre ale pacienților cu nefrolitiază. Urol. Res. 39, 9–19 (2011).

63. Kloypan, C., Srisa-art, M., Mutirangura, A. & Boonla, C. LINE-1 hipometilarea indusă de speciile reactive de oxigen este mediată prin epuizarea S-adenosilmetioninei. Biochimie celulară. Funct. 33, 375–385 (2015).

64. Whongsiri, P., Phoyen, S. & Boonla, C. Stresul oxidativ în carcinogeneza urotelială: Măsurări ale carbonilării proteinelor și producției intracelulare a speciilor reactive de oxigen. Metode Mol. Biol. 1655, 109–117 (2018).

65. Whongsiri, P. et al. Stresul oxidativ și reactivarea LINE-1 în cancerul vezicii urinare sunt legate epigenetic prin formarea activă a cromatinei. Radic liber. Biol. Med. 134, 419–428 (2019).

66. Whongsiri, P. et al. Proteina LINE-1 ORF1 este reglată în sus de speciile reactive de oxigen și asociată cu progresia carcinomului urotelial al vezicii urinare. Genomul cancerului. Proteom. 15, 143–151 (2018).

67. Reagan-Shaw, S., Nihal, M. & Ahmad, N. Translatarea dozei de la studiile pe animale la cele umane revizuite. FASEB J. 22, 659–661 (2008).

68. Yasue, T. Identificarea histochimică a oxalatului de calciu. Acta Histochem. Citochimia. 2, 83–95 (1969).

69. Evan, AP și colab. Placa lui Randall a pacienților cu nefrolitiază începe în membranele bazale ale buclelor subțiri ale Henle. J. Clin. Investi. 111, 607–616 (2003).

70. Prasanth, MI, Santoshram, GS, Bhaskar, JP și Balamurugan, K. Ultraviolet-A declanșează fotoîmbătrânirea în nematodul model Caenorhabditis elegans într-o cale dependentă de DAF-16. Vârsta (Dordr) 38, 27 (2016).

71. Brimson, JM, Prasanth, MI, Plaingam, W. & Tencomnao, T. Bacopa monnieri (L.) wettst. Extractul protejează împotriva toxicității glutamatului și crește longevitatea Caenorhabditis elegans. J. Tradit. Complex. Med. 10, 460–470 (2020).

72. Prasanth, MI, Brimson, JM, Chuchawankul, S., Sukprasansap, M. & Tencomnao, T. Antiaging, stress resistance, and neuroprotective efficacies of Cleistocalyx nervosum var. extracte de fructe panaceu folosind modelul Caenorhabditis elegans. Oxid. Med. Celulă. Longev. 2019, 7024785 (2019).

73. Cawthon, RM Măsurarea telomerilor prin PCR cantitativă. Acizi nucleici Res. 30, e47 (2002).

Mulțumiri

Studiul a fost susținut financiar de Fondul pentru Gap de Cercetare de la Ministerul Științei și Tehnologiei, Agenția Națională de Dezvoltare a Științei și Tehnologiei (NSTDA) și Universitatea Chulalongkorn (GB-rgf_60_2905_0003 la CB) și de Thailanda Science Research și Inovare, Divizia Industrie (RDG6150088 la CB) și Facultatea de Medicină, Universitatea Chulalongkorn (Fond de potrivire). NL a primit cea de-a 90-a aniversare a Fondului Universității Chulalongkorn (Fondul de dotare Ratchadaphiseksomphot). Autorii recunosc cu recunoștință sprijinul pentru cercetare și inovare oferit de Centrul tehnologic al Universității Chulalongkorn și Fondul de cercetare și inovare în știință din Thailanda (TSRI) (CU_FRB{640001_01_2). Mulțumim domnișoarei Natcha Madared pentru asistența excelentă. Fii recunoscător personalului de la unitatea de animale a Facultății de Medicină, Universitatea Chulalongkorn. Mulțumesc Prof. Asistent Dr. Sitthichai Ukritchon și Prof. Dr. Manathip Osiri pentru sprijinul acordat utilizării microscopiei polarizate.

Contribuții ale autorului

NL: A efectuat experimente cu celule și șobolani și a colectat date. NC: A colectat date și a ajutat la conceperea ideii de cercetare și a analizei datelor. MP: A conceput și efectuat experimentul C. elegans și a efectuat analiza datelor C. elegans. DJ: A ajutat în experimente de imunohistochimie și imagistică. CM: Ajutat la secţionarea ţesuturilor. KC: A efectuat experimente de scurtare și senescență a telomerilor. AL: Am reușit să acceseze o unitate de animale pentru experimentul cu șobolani. TT: A ajutat la conceperea și proiectarea experimentului C. elegans. CB: A conceput și proiectat studiul, a efectuat analize statistice și a scris manuscrisul. Toți autorii au revizuit manuscrisul.

Interese concurente

CB, NC și NL sunt inventatorii HydroZitLa. Universitatea Chulalongkorn și inventatorii dețin proprietatea intelectuală pentru HydroZitLa. Niciunul dintre ceilalți autori nu are niciun conflict de interese de declarat cu privire la lucrarea de față.

Informații suplimentare

Informatie suplimentaraVersiunea online conține materiale suplimentare disponibile pe site.

Corespondenţăiar cererile de materiale trebuie adresate CB

Retipăriri și informații despre permisiunieste disponibil pe site.

Nota editoruluiSpringer Nature rămâne neutră în ceea ce privește revendicările jurisdicționale în hărțile publicate și afilierile instituționale.

【Pentru mai multe informații:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】