Hiperglicemia induce imunitatea antrenată la macrofage și precursorii lor și promovează ateroscleroza

FUNDAL:

Riscul cardiovascular în diabet rămâne crescut în ciuda terapiilor de scădere a glicemiei. Am emis ipoteza că hiperglicemia induce imunitate antrenată la macrofage, promovând caracteristicile proaterogene persistente.

În plus, în diverse tipuri de literatură, am mai aflat că o plantă numită Cistanche are un efect mare asupra îmbunătățirii imunității. Cistanche este un medicament tradițional chinezesc cu o gamă largă de funcții de reglare imunitară. Eliberarea de factori, îmbunătățirea funcției organelor imunitare și alte modalități de a spori imunitatea corpului uman. Prin urmare, în viața de zi cu zi, oamenii își pot spori imunitatea mâncând Cistanche deserticola cu moderație, pentru a preveni și trata diverse boli.

Click cistanche deserticola supliment produs

METODE:

Macrofagele derivate din măduva osoasă de la șoareci martor și șoareci cu diabet au fost crescute în glucoză fiziologică (5 mmol/L) și supuse secvențierii ARN (n=6), test pentru secvențierea cromatinei accesibile transpozazei (n=6 ), și secvențierea imunoprecipitării cromatinei (n=6) pentru determinarea imunității antrenate induse de hiperglicemie. Transplantul de măduvă osoasă de la șoareci cu (n=9) sau fără (n=6) diabet la șoareci (normoglicemici) Ldlr -/- a fost utilizat pentru a evalua semnificația sa funcțională in vivo. S-au căutat dovezi ale imunității antrenate induse de hiperglicemie în celulele mononucleare din sângele periferic uman de la pacienții cu diabet zaharat (n=8) ​​în comparație cu subiecții de control (n{=16) și la macrofagele plăcii aterosclerotice umane excizate prin microdisecție cu captură cu laser. .

REZULTATE:

La macrofage, glucoza extracelulară ridicată a promovat expresia genelor proinflamatorii și caracteristicile funcționale proaterogene prin mecanisme dependente de glicoliză. Macrofagele derivate din măduva osoasă de la șoareci diabetici au păstrat aceste caracteristici, chiar și atunci când au fost cultivate în glucoză fiziologică, indicând imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie. Transplantul de măduvă osoasă de la șoareci diabetici în șoareci Ldlr -/- (normoglicemici) a crescut ateroscleroza rădăcinii aortice, confirmând o formă relevantă și persistentă de imunitate înnăscută antrenată. Testul integrat pentru cromatina accesibilă transpozazei, imunoprecipitarea cromatinei și analizele de secvențiere a ARN ale celulelor stem hematopoietice și macrofagelor derivate din măduva osoasă au dezvăluit un efect de amorsare proinflamator în diabet. Modelul cromatinei deschise a implicat factorul de transcripție factorul de transcripție 1 legat de Runt (Runx1). În mod similar, transcriptoamele macrofagelor plăcii aterosclerotice și ale leucocitelor periferice la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 au fost îmbogățite pentru ținte Runx1, în concordanță cu un rol potențial în boala umană. Inhibarea farmacologică a Runx1 in vitro a inhibat fenotipul antrenat.

CONCLUZII:

Imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie poate explica de ce țintirea glucozei crescute este ineficientă în reducerea riscului macrovascular în diabet și sugerează noi ținte pentru prevenirea și terapia bolilor.

Cuvinte cheie:

diabet zaharat ◼ epigenetică ◼ glucoză ◼ inflamație ◼ macrofage

Diabetul este asociat cu un risc ridicat de ateroscleroză și cu complicațiile sale, inclusiv infarctul miocardic.1 Hiperglicemia este o caracteristică cardinală atât în ​​diabetul de tip 1, cât și în diabetul de tip 2, iar tratamentele s-au concentrat în mare măsură pe scăderea glicemiei. Terapia intensivă de scădere a glicemiei este eficientă în scăderea riscului vascular la pacienții cu diabet zaharat de tip 1, dar efectul este amânat pentru câțiva ani2 și deconectat temporar de la controlul glicemiei. un efect modest asupra rezultatelor vasculare legate de ateroscleroză, cum ar fi infarctul miocardic acut.4–6 Riscul persistent de complicații cardiovasculare, chiar și după scăderea glicemiei, a fost numit efect moștenire sau memorie metabolică,4,7, dar mecanismele de bază rămân obscure.

Ateroscleroza este o boală inflamatorie cronică caracterizată prin depunerea și reținerea de lipoproteine ​​modificate și acumularea de celule imunitare în pereții arterelor mari. Macrofagele sunt esențiale în toate etapele aterosclerozei și sunt considerate pe scară largă ca ținte terapeutice.8 Sunt eterogene și răspund funcțional la indicii de micromediu. Macrofagele au fost subtipizate în fenotipuri opuse, și anume proinflamatorii (M1), ca răspuns la lipopolizaharidul receptorului Toll-like (LPS) și interferon- (IFN) sau reparatori tisulare (M2), de exemplu, ca răspuns la interleukină (IL). )-4, deși in vivo domeniul lor funcțional este, fără îndoială, mai complex.9

Hiperglicemia exacerbează progresia aterosclerozei și întârzie regresia plăcii,10 cu o expresie crescută a genelor proinflamatorii și rezistență la inducerea expresiei genelor asociate cu M2-.10,11 În monocite și macrofage, căile energetice celulare sunt guvernate de o interacțiune între celulele stimuli intrinseci și de mediu, care, la rândul lor, afectează semnificativ funcția imună și expresia genelor.12 Ca răspuns la IL-4, macrofagele M2 metabolizează în primul rând acizii grași și se bazează pe fosforilarea oxidativă.13 În schimb, macrofagele M1 necesită glucoză și o trecere la glicoliză aerobă, similar cu efectul Warburg în cancer.14,15 Aceste modificări metabolice apar ca o consecință a stimulării citokinelor, dar pot determina și funcția macrofagelor.16 În plus, rapoarte recente indică faptul că modificările metabolismului monocitelor și macrofagelor , inclusiv glicoliza aerobă sau activarea căii mevalonatului,17,18 induc memoria celulelor imune înnăscute pe termen lung (numită imunitate antrenată) prin modificări epigenetice și modificări ale structurii cromatinei.19 Persistența pe termen lung a monocitelor antrenate circulante este determinată de reprogramare. a progenitorilor lor de măduvă osoasă (BM).20

Am emis ipoteza că imunitatea antrenată ca răspuns la creșterea nivelului de glucoză reprezintă memoria hiperglicemică diabetică despre ateroscleroză. În consecință, am căutat să determinăm dacă hiperglicemia a indus modificări relevante pentru boala în funcția monocitelor și macrofagelor și dacă aceste modificări au persistat după restabilirea glucozei normale, implicând o reprogramare fundamentală. Am combinat studiile privind funcția celulară, metabolomica, transcriptomica și epigenomica pentru a defini modul în care hiperglicemia modifică metabolismul pentru a modula activarea pe termen lung prin modificări epigenetice. Am explorat modul în care aceste modificări pot apărea la nivelul celulelor stem hematopoietice (HSC) și în macrofagele diferențiate. Semnificația funcțională este testată prin transplantul BM într-un model de șoarece de ateroscleroză, iar constatările sunt validate prin interogarea macrofagelor extrase din sângele periferic uman și plăcile aterosclerotice prin microdisecție cu captură cu laser (LCM). Descoperirile noastre pot explica rezistența complicațiilor macrovasculare ale diabetului la tratamentele convenționale de scădere a glicemiei.

METODE

Resurse de date

Datele generate în acest studiu au fost depozitate în Centrul Național pentru Informații Biotehnologice Gene Expression Omnibus și sunt accesibile prin numărul de acces GSE176068.

Animale

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/L au fost eutanasiați și țesutul a fost colectat.

Linii telefonice

Toate liniile celulare au fost crescute la 37 de grade și 5% CO2. Celulele L929 au fost crescute în mediu Roswell Park Memorial Institute suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 2% penicilină-streptomicină și 2 mmol/L glutamina. Celulele L929 au fost crescute până la confluență completă timp de 7 până la 8 zile, iar mediul condiționat a fost îndepărtat, împărțit în părți alicote și depozitat la -20 de grade până când este necesar. Celulele endoteliale de șoarece derivate din piele au fost cultivate în 25 mmol/L glucoză DMEM cu 10% FBS, 2% penicilină-streptomicină și 2 mmol/L glutamina.

Macrofage derivate din BM

Macrofagele derivate din BM (BMDM) utilizate în acest studiu au fost generate prin spălarea BM din femururile și tibiile murine și placarea pe cutii Petri netratate cu cultură de țesut în DMEM complet de glucoză de 5 mmol/L (suplimentat cu 10% FBS, 2% penicilină -streptomicina și 2 mmol/L glutamina) plus 20% mediu L929 condiționat de celule pentru diferențiere. După diferențiere timp de 7 zile, BMDM-urile au fost selectate pozitiv, placate la o densitate de 2 x 105 celule/mL și stimulate în DMEM complet de glucoză de 5 mmol/L (dacă nu se specifică altfel) fie cu 10 ng/mL interferon murin recombinant (IFN). - ; R&D Systems, Marea Britanie) plus 100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich, Marea Britanie), 10 ng/mL IL de șoarece recombinat-4 (R&D Systems, Marea Britanie) sau control numai pentru medii timp de 16 ore înainte de utilizare . BMDM au fost, de asemenea, cultivate simultan în diferite condiții glicemice (5 mmol/L glucoză DMEM cu adăugarea de glucoză pentru a obține o concentrație finală de 11 sau 20 mmol/L glucoză) sau o stare de control osmotic (manitol; 5 mmol/L glucoză DMEM). plus 15 mmol/L manitol). Studiile metabolice au fost efectuate în absența sau prezența a 10 mmol/L dicloracetați (Sigma-Aldrich, Marea Britanie) sau 1 mmol/L 2-deoxi-d-glucoză (Sigma-Aldrich, Marea Britanie).

Izolarea HSC

HSC-urile au fost izolate cu kit-ul MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit (ThermoFisher Scientific, Marea Britanie) prin spălarea BM din femururile și tibiile murine și incubarea cu markeri pentru a elimina celulele implicate în linie (CD3, CD4, B220, Ter119 și Gr1) și îmbogățirea pt. HSC-uri. HSC-urile au fost cultivate în tuburi de sortare a celulelor activate cu fluorescență de 5 ml în DMEM complet de 5 mmol/L (sau 20 mmol/L glucoză sau manitol pentru stimulările de tip sălbatic indicat) cu adăugarea a 100 ng/mL LPS plus 10 ng/mL IFN - sau 10 ng/mL IL-1 recombinat de șoarece (R&D Systems, Marea Britanie) timp de 16 ore pentru analiza Western blot sau 2 ore pentru analiza de secvențiere a cromatinei accesibile transpozazei (ATAC-seq).

Model de memorie BMDM in vitro

BM de șoarece a fost diferențiat în BMDM așa cum este descris mai sus în glucoză de 5 sau 20 mmol/L timp de 1, 2, 4 sau 7 zile. BMDM-urile au fost selectate pozitiv prin aderență, replatate în DMEM complet de 5 mmol/L și lăsate să se incubeze timp de 48 de ore pentru a permite o perioadă de normalizare a glucozei. BMDM-urile au fost apoi stimulate pentru utilizare cu 10 ng/mL IFN- plus 100 ng/mL LPS sau mediu de control timp de 16 ore în absența sau prezența a 0,25, 0,5, 1, 5 sau 10 µmol/L Ro 5-3335 (Merck Millipore, Regatul Unit) înainte de utilizare pentru analiza expresiei genelor.

Izolarea monocitelor de șoarece

Monocitele murine au fost izolate din sângele periferic cu Kit-ul de izolare a monocitelor EasySep Mouse (Stemcell Technologies, Canada) conform protocolului producătorului. Celulele au fost utilizate imediat pentru testarea adeziunii statice.

Kit de testare a ratei ATP în timp real Seahorse XFe 96

Analiza fluxului extracelular a fost efectuată cu kitul XFp RealTime ATP Rate Assay pe BMDM (8 × 104 celule per godeu; 5 godeuri replicate per animal și stare), conform instrucțiunilor producătorului. Au fost efectuate trei măsurători ale ratei consumului de oxigen de bază și ale vitezei de acidificare extracelulară înainte de a fi injectat mediu de testare cu diferite concentrații de glucoză (5 sau 20 mmol/L) sau martor (manitol; portul de injectare A). După alte 7 măsurători, compuși oligomicină (2 µmol/L; portul de injectare B) și antimicină combinată A (0,5 µmol/L) și rotenonă (0,5 µmol/L; portul de injectare C), din testul XFp Real-Time ATP Rate Assay kit, au fost injectate secvenţial cu 3 măsurători ulterioare. Cantitatea de ATP produsă prin glicoliză și indicele ratei ATP (rata de producție de mitoATP/rata de producție de ATP glicolitic) au fost calculate automat cu Wave (versiunea 2.6, Agilent).

Test de aderență statică

Celulele endoteliale de șoarece derivate din piele au fost crescute până la confluența pe lamele de sticlă în plăci de godeuri 12-și activate cu factor de necroză tumorală de șoarece recombinant 10 ng/mL - (R&D Systems, Marea Britanie) timp de 16 ore. Monocitele din sângele periferic nestimulate sau stimulate cu IFN-plus LPS (sau BMDM-uri de la șoareci diabetici cu streptozotocină cultivați în glucoză 5 mmol/L) au fost marcate cu fluorescent verde cu kitul de linker de celule fluorescente PKH67 (Sigma-Aldrich, Marea Britanie) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele marcate au fost adăugate la celulele endoteliale la o densitate de 5 x 104 celule per lamelă timp de 1 oră înainte ca mediul și celulele neatașate să fie îndepărtate, spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și fixate în paraformaldehidă 4%. Au fost obținute patru imagini pentru fiecare lamelă; s-a numărat numărul de celule adere, marcate; iar imaginile pe lamelă au fost mediate. Imaginile afișate au fost ajustate la fel de luminozitate pe ImageJ.

Analiza celulelor spumei

BMDM nestimulate sau stimulate (LPS plus IFN-) au fost crescute pe lamele de sticlă în plăci de godeuri și incubate cu 25 pg/mL lipoproteină de joasă densitate acetilată cu Dil (LDL; Bioquote, US) timp de 48 de ore. Mediile și LDL-acetilate cu Dil rămase au fost îndepărtate și celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS și fixate în paraformaldehidă 4%. Lipida a fost colorată cu Oil Red O și lamelele au fost montate DAPI. Imaginile cu contrast de fază ale colorării Oil Red O și imaginile fluorescente ale nucleelor ​​au fost luate (4 imagini per lamelă) și utilizate pentru a cuantifica cantitatea de lipide sau, respectiv, numărul de celule, cu software-ul ImageJ. Suprafața lipidică per imagine a fost apoi normalizată la numărul de celule per imagine, iar rezultatele sunt exprimate ca schimbare de ori peste probe de control de glucoză de 5 mmol/L (pentru experimentele cu glucoză BMDM) și probe de control (pentru experimentele BMDM pentru diabetici). Imaginile afișate au fost ajustate uniform pentru luminozitate.

Experiment de transplant de BM pentru diabetici

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/L și șoareci CD68-GFP de control de aceeași vârstă au fost utilizați ca donatori de BM. BM a fost colectat de la șoareci donatori și 5×106 celule viabile au fost injectate intravenos în șoareci LdLr-/- primitori B6.129S7- Ldlr-tm1Her/J iradiați letal (2×500 rads) (Nr. stoc JAX 002207) ). După grefare, toate animalele primitoare au fost plasate pe o dietă occidentală (Open Source Diets D12079B; 1% grăsime, 40% kcal) timp de 12 săptămâni. S-a recoltat sânge integral la 4, 8 și 12 săptămâni după grefare pentru analiza citometrică în flux a celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) și pentru a monitoriza nivelurile de grefare și pentru a evalua numărul populației de leucocite. Grefarea, evaluată la fiecare 4 săptămâni după grefare, a fost monitorizată prin colorarea celulelor cu antiCD45 și evaluarea proporției relative de celule CD45 plus GFP plus în populația totală de CD45 plus. La 12 săptămâni, șoarecii au fost eutanasiați, sângele integral a fost colectat și serurile au fost procesate pentru măsurători de trigliceride, acizi grași neesterificați, LDL și colesterol cu ​​lipoproteine ​​de înaltă densitate. Șoarecii au fost perfuzați cu PBS, urmat de perfuzie și fixare cu 4% paraformaldehidă peste noapte. Inima și aorta au fost disecate și introduse în etanol 70% până la procesare.

Analiza plăcii radiculare aortice și imunofluorescență

Pentru a cuantifica încărcarea plăcii, rădăcinile aortice fixate cu paraformaldehidă au fost plasate într-un mediu de tăiere optim și secționate pe un plan paralel cu atriile. Pentru a cuantifica volumul plăcii, conținutul de lipide ale plăcii21 și conținutul de colagen, 5 secțiuni, distribuite uniform prin rădăcina aortică, au fost colorate cu tricrom Masson-Goldner (Merck, Marea Britanie). Pe scurt, secțiunile au fost refixate în soluție Bouin la temperatura camerei timp de 1 oră, spălate în apă curentă timp de 5 minute și apoi trecute prin protocolul kit-ului de colorare Masson-Goldner din a doua incubare cu etanol de 70 procente conform indicațiilor producătorului. timpii de protocol. Lamele umede cu xilen au fost apoi montate cu Neo-Mount și etanșate cu sticlă de acoperire. Caracteristicile plăcii au fost cuantificate pe versiunea software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silverspring, MD), iar datele au fost afișate ca medie a tuturor secțiunilor.

Imunofluorescența a fost apoi efectuată pe 6 secțiuni adiacente. Secțiunile au fost colorate pentru conținutul de macrofage cu GFP (iepure anti-GFP, A6455, Invitrogen) sau cu marker de macrofage galectin-3 (capră anti-galectină 3, AF1197, R&D Systems), pentru conținutul de celule musculare netede cu -actină ( actina de iepure anti-mușchi neted, ab32575, Abcam PLC), și pentru mărcile epigenetice H3K4me3 (policlonal de iepure la histonă H3 [trimetil K4], Ab8580, Abcam PLC) și H3K27ac (policlonal de iepure la histonă H3 [acetil K27], Ab4729), PLC Abcam). Pentru colorarea prin imunofluorescență, secțiunile au fost rehidratate cu PBS timp de 5 minute la temperatura camerei și blocate timp de 1 oră cu tampon de blocare DAKO (Agilent, Marea Britanie). Anticorpul primar a fost diluat la 1 pg/mL în DAKO şi adăugat la secţiuni peste noapte la 4 grade. Anticorpii secundari au fost diluați 1:200 în DAKO și adăugați timp de 1 oră la temperatura camerei (măgar anti-iepure [A488], A21206, Life Technologies; măgar anticapră [A594], A11058, ThermoFisher Scientific). Secțiunile au fost în cele din urmă montate DAPI (mediu de montare cu glicerol cu ​​DAPI și DABCO, Abcam, Marea Britanie). Imaginile fluorescente au fost analizate cu software-ul Image J.

Expresia genelor

ARN-ul total a fost izolat cu un kit RNeasy Plus Mini (Qiagen, Marea Britanie) și cuantificat cu un spectrofotometru UV-vizibil Nanodrop 2000. Sinteza ADNc a fost efectuată cu 0,2 până la 2 pg ARN într-o reacție în lanț a polimerazei (PCR) cu kit de transcripție inversă QuantiTect (Qiagen, Marea Britanie), conform instrucțiunilor producătorului. PCR cantitativă în timp real a fost efectuată pe 5 ng/µL ADNc cu sonde Taqman specifice pentru B2m (Mm00437762), Il-6 (Mm00446190), Il-1 (Mm{00462531_ m1), iNos (Mm00440502), Ym1 (Mm00657009) și Fizz1 (Mm00556208). PCR cantitativă a fost efectuată cu TaqMan universal master mix II cu UNG pe QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher). Toate datele PCR au fost normalizate la expresia genei interne (B2m) și analizate prin metoda 2-ΔCT pentru a calcula expresia relativă a ARNm.

Analiza Western Blot

Celulele au fost spălate în PBS rece cu gheață și lizate în tampon de liză pentru testul radioimunoprecipitării (150 mmol/L NaCl, 1,0 procente IGEPAL CA-630, 0,5 procent deoxicolat de sodiu, 0,1 procente SDS, 50 mmol/L Tris, pH 8,0) suplimentat cu inhibitori de protează și fosfatază. Concentrația de proteine ​​a fost determinată prin testul acidului bicinconinic (Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific, UK) conform instrucțiunilor de analiză. Concentrații egale de proteine ​​au fost încărcate și rulate pe un gel SDS-PAGE (4% până la 12% Bis-Tris Gel, Life Technologies, Marea Britanie) pentru a se separa. Proteinele au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Bio-Rad, Marea Britanie) și testate cu anticorpi specifici, așa cum este indicat cu -actină (anti- -actină de șoarece [15G5A11/E2], Invitrogen) ca menaj și control al încărcării. Au fost dezvoltate membrane (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific, Marea Britanie) și detectate prin chemiluminiscență pe o stație de imagine Biorad.

Probele umane și Izolarea LCM a macrofagelor în placă

Toate investigațiile clinice au fost efectuate prin Declarația de la Helsinki, iar probele au fost depozitate în conformitate cu Legea privind țesuturile umane din Regatul Unit (2004). Studiul a fost aprobat de comisia relevantă de evaluare a eticii și toți subiecții au furnizat consimțământul informat în scris. Pacienții care așteptau o endarterectomie carotidiană au fost recrutați, iar plăcile carotidiene au fost colectate proaspăt în momentul intervenției chirurgicale (caracteristicile pacientului rezumate în Fișierul Excel I din Suplimentul de date). Plăcile carotide explantate au fost spălate în PBS steril rece cu gheață, congelate rapid în mediu de tăiere optim și depozitate la -80 de grade până la procesare.

LCM a fost efectuat cu un sistem PALM Microbeam LCM (Carl Zeiss GmbH, Germania) utilizând o abordare adaptată de „lame de ghidare”.22,23 Probele de placă carotidă au fost proaspăt secţionate la 15 um. Diapozitivele de ghidare au constat din 3 secțiuni consecutive: prima secțiune a fost colorată cu protocolul kit-ului de colorare Masson-Goldner pentru a ajuta la determinarea locațiilor microanatomice, iar următoarele 2 au fost imunocolorate pentru oricare dintre macrofage (CD68 antiuman de șoarece [clona KP{{7} }], Dako, Cambridge Marea Britanie) sau celulele musculare netede (actina antiumană de șoarece [clona 1A4], Dako, Cambridge Marea Britanie). Secțiunile ulterioare (până la 15) au fost tăiate pe lame cu membrană LCM (ThermoFisher Scientific, Marea Britanie) și colorate cu violet de cresil gata pentru procesare imediată. Grupurile de celule de macrofage au fost identificate manual pe baza colorării ghidajului folosind PALM RoboSoftware (versiunea 4.5, Carl Zeiss GmbH, Germania). O zonă de interes combinată totală între 3 și 5 x 106 µm2 a fost capturată cu laser pe un capac adeziv Zeiss PALM (Carl Zeiss GmbH, Germania). Celulele au fost imediat lizate, congelate rapid pe gheață uscată și depozitate la -80 de grade până când ARN-ul a fost extras cu microkit-ul RNEasy (Qiagen, Marea Britanie), conform protocolului producătorului.

Microarray de macrofage cu plăci umane

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5 au fost duși înainte pentru amplificarea ARN, biotinilare și analiza microarray a expresiei genelor. Aceste probe au fost trimise la Cambridge Genomic Services (Departamentul de Patologie, Universitatea din Cambridge, Marea Britanie) pentru prelucrare ulterioară. Amplificarea și biotinilarea au fost efectuate cu kitul Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc, SUA), apoi hibridizarea a fost variată în ordine aleatorie pe 2 Illumina Human HT12 v4.0 BeadChips (Illumina, SUA) pentru a minimiza lotul /varianta chip. Illumina BeadArrays au fost procesate cu pachetul Bioconductor Bead Array (versiunea 2.24.0)24,25 folosind normalizarea exponențială normală. Seturile de sonde au fost prăbușite pe genă pe baza intervalului maxim interquartil pentru a evita valorile extreme, dar a captura variabilitatea în toate probele. Seturile de sonde neadnotate și de control au fost excluse din analiza ulterioară. Expresia diferențială (DE) a listei finale de 21036 de gene a fost evaluată cu pachetul Bioconductor limma (versiunea 3.30.13)26 pentru a compara diabetul cu cel de control, ajustând pentru starea simptomatică/asimptomatică. Având în vedere disponibilitatea seturilor de date ortogonale și a 8 eșantioane per grup, am folosit o valoare ajustată relativ îngăduitoare a lui P<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

Izolarea monocitelor umane

Sângele venos periferic (15-20 ml) a fost obținut de la donatori sănătoși în tuburi acoperite cu K2-EDTA (BD Vacutainer, New Jersey) și procesat în decurs de 1 oră. Plasma și o fracțiune îmbogățită cu celule mononucleare au fost obținute prin centrifugarea sângelui integral pe coloane Accuspin Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Fracția îmbogățită cu celulă mononucleară a fost preluată pentru izolarea monocitelor cu un kit de izolare cu selecție negativă (kit de îmbogățire a monocitelor umane EasySep fără epuizare CD16, StemCell Technologies, Canada), urmând protocolul descris de producător.

Izolarea și stimularea celulelor mononucleare din sângele periferic uman

Pacienții cu diabet zaharat și pacienții de control au fost recrutați pentru studii clinice după aprobarea etică locală și regională de la Institutul Karolinska, Stockholm (2011/1002-31/1 și 2009/1881-31/1). PBMC-urile au fost izolate din probe de sânge periferic colectate după post peste noapte cu SepMate (StemCell Technologies) și Lymphoprep (StemCell Technologies) conform instrucțiunilor producătorului. PBMC izolate au fost congelate și depozitate în 90% FBS și 10% dimetil sulfoxid.

PBMC-urile stocate au fost dezghețate și spălate în PBS prin centrifugare (500 g timp de 10 minute), celulele viabile au fost numărate și placate în godeuri individuale ale unei plăci de cultură de țesut 12-godeuri în DMEM fiziologic (scăzut) de glucoză, 10% FBS, 2 mmol/L l-glutamină și 1% penicilină și streptomicina. PBMC-urile au fost odihnite peste noapte și tratate cu vehicul PBS sau 100 ng/mL LPS și 10 ng/ml de IFN- recombinant (Sisteme R&D) timp de 6 ore. După stimulare, PBMC-urile au fost lizate în RLT (QIAGEN), congelate rapid și depozitate la -80 de grade. ARN-ul a fost izolat și supus secvenței ARN (ARNseq) așa cum este descris.

Metabolomica și măsurătorile metaboliților

Monocitele umane izolate au fost cultivate la o densitate de 3,5×105 celule per probă în DMEM complet de glucoză de 5 mmol/L, mediu suplimentat cu glucoză pentru a obține o concentrație finală de 20 mmol/L glucoză , sau mediu cu 15 mmol/L manitol în tuburi de sortare celulare activate cu fluorescență de 5 mL timp de 12 ore. Lizatele celulare au fost preparate prin extracție cu metanol rece ca gheață timp de 20 de minute pe gheață carbonică și congelate rapid în azot lichid. În ziua analizei, probele au fost agitate în vortex și apoi centrifugate la 10,000g timp de 10 minute la 4 grade. O probă de control al calității reunită a fost preparată prin amestecarea a 60 uL fiecare extract de probă și analizată periodic pe parcursul întregului ciclu analitic pentru a confirma performanța metodei. Probele au fost filtrate cu un filtru centrifugal Ultrafree-MC de 0,1-µm (5000 g, 3 minute) și apoi transferate în fiole de cromatografie lichidă-spectrometrie de masă. Analizele metabolomice nețintite au fost efectuate așa cum s-a descris anterior.27 Pe scurt, probele au fost analizate pe o cromatografie lichidă de ultraînaltă performanță Thermo Ultimate 3000 cuplată la un Q-Exactive Orbitrap utilizând achiziție cu comutare de polaritate (pozitiv-negativ) care funcționează la o putere de rezoluție a masei de 70000. latimi intregi la jumatate de maxim. Compușii hidrofili au fost separați cromatografic pe o coloană Merck Sequant ZIC-HILIC (150×4,6 mm, dimensiunea particulei 5-µm) și compușii hidrofobi folosind o coloană Thermo Accucore aQ RP C18 (150×2,1 mm, 2.{38). }}µm dimensiunea particulei). Metaboliții au fost identificați folosind o bază de date internă.27 Îmbogățirea setului de metaboliți și analiza căii metabolice au fost efectuate pe toate măsurătorile metaboliților folosind MetaboAnalyst (versiunea 4.0).

Pentru măsurătorile metaboliților BMDM și HSC, celulele au fost cultivate așa cum s-a descris anterior la o densitate de 5 × 105 per godeu, iar supernatanții de cultură au fost rulați pe ABX Pentra 400 (Horiba) pentru a măsura glucoza (ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, Marea Britanie) și nivelurile de lactat (ABX Pentra Lactic Acid). Măsurătorile au fost normalizate la concentrațiile de glucoză și lactat prezente în mediul de cultură celular complet martor care a fost incubat în aceleași condiții, dar nu în prezența celulelor. Lizatele celulare BMDM au fost utilizate pentru a măsura nivelurile de succinat (Succinate Assay Kit, Abcam, UK) conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 bp. Concentrațiile de ADN au fost măsurate cu un fluorometru Qubit (Life Technologies) și distribuția dimensiunii bibliotecii a fost evaluată cu Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip (Agilent, Marea Britanie). Amplificarea bibliotecii a fost efectuată cu primeri personalizați Nextera.28 Bibliotecile au fost secvențiate de Biomedical Sequencing Facility de la CeMM folosind platforma Illumina HiSeq 3000/4000 și configurația cu citire unică 50-bp.

Citirile au fost controlate pentru calitate și tăiate de orice adaptoare rămase. Citirile au fost apoi aliniate la genomul șoarecelui (Mm10) cu Bowtie (versiunea 2.2.6) în modul „local sensibil”. Citirile aliniate au fost filtrate pentru a elimina potrivirile de calitate scăzută (calitate de cartografiere Mai mică sau egală cu 10) sau cartografierea citirilor la secvențele mitocondriale. Pozițiile de început de aliniere au fost deplasate într-o manieră conștientă de fir (4 bp, -5bp, 28) înainte de apelarea de vârf cu MACS2 (versiunea 2.1.129). Regiunile legate diferențial au fost identificate cu DiffBind (versiunea 2.4.830) cu centrarea vârfurilor (summits=100) și edgeR.31

Analiza căii a fost apoi efectuată pe vârfuri îmbogățite în probe de diabet (rata de descoperire falsă [FDR] Mai mică sau egală cu {{0}}.1) prin introducerea locației de vârf a cromozomului în Instrumentul de îmbogățire a adnotărilor în regiunile genomice ( versiunea 3.0).32 Regiunile de vârf diferențiale au fost apoi analizate cu imunoprecipitare MEME-cromatină (ChIP; versiunea 4.12.0),33 care efectuează o analiză cuprinzătoare a motivelor pentru a identifica orice motive de legare cunoscute sau necunoscute care sunt îmbogățite (îmbogățite). motivele E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

Identificarea țintei factorului 1 de transcripție legat de runt

MEME-ChIP al regiunilor ATAC-seq a identificat factorul de transcripție 1 legat de Runt (RUNX1) ca un potențial regulator atât în ​​IL-1, cât și în HSC diabetice nestimulate. MEME GOMo (versiunea 4.12.0)33 a fost utilizată pentru a scana promotorii de șoarece și umani (-1000, plus 200) pentru motivul RUNX1 consens (MA002.2). Pe lângă analiza de îmbogățire a Ontologiei genelor, GOMo returnează o listă de gene identificate ca ținte. Aceste lovituri au fost limitate la promotori conservați legați atât la șoareci, cât și la oameni, cu valori empirice P<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

Analiza ARN-seq

BMDM-urile de control sau diabetice (n=6), cultivate în 5 mmol/L și stimulate cu LPS plus IFN- timp de 6 ore sau celule de control nestimulate, au fost utilizate pentru analiza ARN-seq. Pe scurt, ARN-ul a fost izolat cu kitul de izolare mirVana mRNA/miRNA (ThermoFisher Scientific, Marea Britanie), conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea de ARN total a fost cuantificată cu sistemul de cuantificare fluorometrică Qubit (Life Technologies), iar numărul de integritate a ARN a fost determinat cu sistemul de electroforeză automatizată Experion (Bio-Rad). Bibliotecile ARN-seq au fost preparate cu trusa de preparare a probei TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, Marea Britanie) folosind atât robotica de manipulare a lichidelor Sciclone, cât și Zephyr (PerkinElmer, Marea Britanie). Concentrațiile bibliotecii au fost cuantificate cu sistemul de cuantificare fluorometrică Qubit (Life Technologies, Marea Britanie), iar distribuția dimensiunilor a fost evaluată cu sistemul de electroforeză automatizată Experion (Bio-Rad, SUA).

Pentru secvențiere, probele au fost diluate și reunite în cantități echimolare și secvențiate pe instrumente Illumina HiSeq 3000/4000 în configurație cu citire unică de 50-bp de către Biomedical Sequencing Facility de la CeMM. Apelurile de bază furnizate de software-ul Illumina Real-Time Analysis au fost ulterior convertite în format de hartă de aliniere binară (Illumina2bam) înainte de demultiplexare (BamIndexDecoder) în fișiere individuale de hărți de aliniere binare specifice eșantionului prin instrumentele Illumina2bam (1.17.3). Bibliotecile au fost pregătite și secvențiate de către Biomedical Sequencing Facility de la CeMM.

Citirile au fost aliniate la genomul șoarecelui (GRCm38/ mm10) folosind STAR (versiunea 2.5.3a34) în modul de numărare a genelor (quantMode GeneCounts) cu adnotări Gencode (versiunea M16) (din care mega transcriere Gm20388 a fost eliminată pentru a evita suprapunerea genelor intermediare). Numărările au fost încărcate în R (versiunea 3.3.3) și analizate cu edgeR (versiunea 3.16.535) după eliminarea transcrierilor cu<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1,5 au fost considerate a fi DE. Tabelele DE și listele de gene sunt incluse ca fișier Excel II în suplimentul de date (nestimulat) și fișierul Excel III în suplimentul de date (stimulat cu LPS plus IFN). Funcția edgeR cpm a fost utilizată pentru a normaliza numărul de log (Fișier Excel IV din Suplimentul de date) pentru hărțile termice și alte diagrame. Hărțile termice au fost generate cu pachetul R (versiunea 1.0.836). Suprareprezentarea analizei genelor țintă RUNX1 printre genele DE la diabetici în comparație cu probele de control LPS plus IFN-a fost efectuată așa cum s-a descris anterior pentru datele matricei umane.

Secvențierea Chip

Un total de 1 x 106 celule/mL au fost fixate cu 1% formaldehidă la temperatura camerei timp de 10 minute, spălate cu PBS și depozitate la -80 de grade. Celulele au fost forfecate cu Chromatin EasyShear Kit–Low SDS (Diagenode, Belgia) și sonicate cu un dispozitiv de sonicare Bioruptor Pico (nr. catalog B01080010, Diagenode, Belgia) conform recomandărilor producătorului. Sistemul de imunoprecipitare a cromatinei MAGnify (Thermo Scientific) a fost utilizat pentru a selecta fragmente de cromatina folosind anti-histone H3 (trimetil K4; ab8580) sau anti-histone H3 (acetil K27; ab4729). Bibliotecile de secvențiere au fost pregătite cu kit-ul de pregătire pentru bibliotecă NEBNext Ultra II DNA conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, ChIP purificat sau ADN-ul de intrare a fost reparat la capăt și coadă A urmat de ligatura adaptorului. ADN-ul legat de adaptor a fost selectat cu dimensiunea cu perle SPRI Ampure XP (Agencourt) și îmbogățit cu primeri de secvențiere compatibili cu Illumina. Bibliotecile finale au fost purificate cu perle SPRI Ampure XP pentru a elimina dimerii adaptorului și secvențiate de Biomedical Sequencing Facility de la CeMM folosind platforma Illumina HiSeq 3000/4000 și configurația de citire unică 50-bp.

Bioinformatica

Pentru a examina relația dintre deschiderea cromatinei și expresia genelor în BMDM nestimulate, diabetul versus vârfurile ATAC-seq de control (modificări log2 ori) și nivelul mARN al genelor apropiate (modificări log2 ori) au fost comparate prin corelația liniară Pearson.

Citirile din experimentele ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-sequencing (ChIPseq) și H3K27ac ChIP-seq au fost vizualizate în probe reprezentative utilizând Integrative Genome Browser, cu înălțimi ale pistelor scalate pe experiment și tip de celulă pentru a ține seama de diferențele sistematice în adâncimea citirii.

Analize statistice

Toate analizele statistice ale datelor fără secvențiere au fost efectuate în software-ul GraphPad Prism. Datele au fost analizate pentru distribuția normală prin testul de normalitate Shapiro-Wilk. Comparațiile între două grupuri au fost calculate prin 2-testele t Student cu coadă sau testele U Mann-Whitney pentru date distribuite normal sau, respectiv, nenormal. Comparațiile între mai multe grupuri au fost calculate prin analiza ANOVA 1-mod sau 2-mod cu corecție post-hoc Bonferroni. Datele sunt raportate ca medie ± SD pentru datele cu distribuție normală sau mediană ± interval intercuartil pentru datele cu distribuție nenormală. Mai multe replici și alte detalii statistice pot fi găsite în legendele figurilor. Atât pentru experimentele in vivo, cât și pentru cele in vitro, n este numărul de animale individuale sau voluntari sau pacienți individuali sănătoși. Modificările de pliere sunt calculate ca valoarea medie a condiției de testare împărțită la valoarea medie de control.

REZULTATE

Hiperglicemia diabetică modifică metabolismul celular, stimulând expresia și funcția genelor proinflamatorii

Glicoliza aerobă crește expresia genei proinflamatorii (M1)37, iar hiperglicemia promovează, de asemenea, expresia genei asociate cu M1-.10,11 Prin urmare, am emis ipoteza că glucoza extracelulară ridicată determină glicoliza crescută, ceea ce duce la polarizarea sporită a macrofagelor către un fenotip M1. .

Analiza metabolomului monocitelor umane primare a indicat că glucoza extracelulară ridicată (20 mmol/L) a schimbat profilul metabolic în comparație cu condițiile de glucoză fiziologică osmotic (5 mmol/L). Analiza căii (Figura 1A) a arătat că glucoza ridicată a determinat modificări semnificative în ciclul acidului tricarboxilic (FDR, 0.{002) și metabolismul piruvatului (FDR, 0,005), notat prin creșterea succinatului, malat ( Figura 1B), nivelurile de lactat și, respectiv, piruvat (Figura 1C), cu analiza de îmbogățire a setului de metaboliți (Figura 1D) evidențiind efectul Warburg (FDR, 0,04).

Figura 1. Glucoza ridicată modifică metabolismul celular. O analiză a căii metabolice. Măsurătorile individuale pentru (B) succinat, malat, (C) lactat și piruvat și (D) analiza de îmbogățire a setului de metaboliți (Metaboanalyst) pentru probele metabolomice de lizat de celule monocite umane (n=5). Analiza fluxului extracelular pe macrofage derivate din măduva osoasă de șoarece (bioanalyzer Seahorse; n=6 animale individuale) a măsurat (E) rata de acidificare extracelulară (ECAR) și (F) rata consumului de oxigen (OCR) ca răspuns la diferite glucoze extracelulare, control osmotic (manitol) și injecții cu inhibitori metabolici. Glucoza ridicată (G) a crescut producția de ATP glicolitic (glicoATP) și (H) a scăzut indicele ratei ATP (rata de producție de ATP mitocondrială/rata de producție de glicoATP), indicând o schimbare la un fenotip mai glicolitic. Datele au fost analizate prin (B și C) 2-mod ANOVA sau (E–H) 1-mod ANOVA plus testul post-hoc Bonferroni. Toate datele afișate sunt medii ± SD. AU indică unități arbitrare; FDR, rata de descoperire falsă; și TCA, acid tricarboxilic. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Un fenotip mai glicolitic (și mai puțin oxidativ) ca răspuns la glucoză ridicată (20 mmol/L) a fost confirmat în BMDM de șoarece, care a arătat o creștere a ratei de acidificare extracelulară, a crescut producția de ATP glicolitic (2-ori; P;<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

Această creștere a ratei glicolitice a fost prevenită de inhibitorul dicloroacetatului de glicoliză (Figura Ia și Ib din suplimentul de date).

În BMDM, glucoza ridicată a promovat ambele expresii proinflamatorii M1-asociate Il-6 (de 2,7-ori; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

Figura 2. Glucoza ridicată modifică expresia și funcția genei macrofagelor. M1 (lipopolizaharidă [LPS] plus interferon [IFN-] stimulat) macrofage derivat din măduva osoasă (BMDM) (A) Il-6 și (B) este expresia genei în prezența sau absența dicloracetatului (DCA). M2 (interleukin-4 stimulat) BMDM (C) Ym1 și (D) expresia genei Fizz1. A până la D, Datele cantitative ale reacției în lanț a polimerazei sunt normalizate la expresia B2m; n=7 la 10. E, Cuantificarea imaginii adeziunii monocitelor de șoarece la celulele endoteliale (n=5). F, Cuantificarea imaginii a absorbției de lipoproteine ​​de densitate joasă acetilate de către BMDM, normalizată prin numărul de celule per imagine. Imagini reprezentative (G) de aderență statică ale monocitelor de șoarece marcate fluorescent cu PKH67-la celulele endoteliale și imagini cu celule de spumă colorate cu (H) Oil Red O (ORO) și DAPI. Toate datele (A–H) sunt afișate ca medie ± SD; (A–D) 1-mod ANOVA sau (E și F) 2-mod ANOVA cu analiză post-hoc Bonferroni. Fiecare punct reprezintă un animal individual (media de 4 imagini pentru aderența statică și formarea celulelor de spumă). AU indică unități arbitrare; NS este nesemnificativ. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Având în vedere efectele sale asupra promovării inflamației, am testat apoi dacă glucoza extracelulară ridicată a modificat funcțiile monocitelor și macrofagelor relevante pentru aterogeneză.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

Celulele derivate din BM de la șoareci diabetici prezintă imunitate antrenată indusă de hiperglicemie

Apoi am folosit un model de șoarece de diabet pentru a testa dacă hiperglicemie a indus modificări proinflamatorii persistente în macrofage, chiar și după normalizarea glucozei. Am obținut BM de la șoareci martor nediabetici, potriviți în funcție de vârstă și de la șoareci diabetici singenici la care hiperglicemia a fost indusă de streptozotocină și menținută timp de 6 săptămâni in vivo (Figura IIIa-IIId din suplimentul de date). Celulele au fost diferențiate în BMDM-uri sub glucoză fiziologică (5 mmol/L; Figura 3A). După stimulare, BMDM de origine la șoarece diabetic au afișat o expresie îmbunătățită a genei Il1-asociată M{-6 (4,1-ori; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

Figura 3. Macrofagele derivate din măduva osoasă (BM) (BMDM) de la șoarecii diabetici manifestă memorie hiperglicemică în expresia genelor. A, Schema protocolului BMDM pentru diabetici și control (n=10–12). Analiza expresiei genei M1 a (B) Il-6 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

În plus, a existat o aderență crescută la endoteliul activat (de 6,3-ori; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

Figura 4. Macrofagele derivate din măduva osoasă (BMDM) de la șoarecii diabetici prezintă funcții modificate în ciuda normalizării glucozei. BMDM-urile de la șoarecii diabetici au fost diferențiate în 5 mmol/L (n=5-8). A, Cuantificarea imaginii adeziunii BMDM la celulele endoteliale (n=8). B, Cuantificarea imaginii a absorbției de lipoproteine ​​de densitate joasă acetilate de către BMDM, normalizată prin numărul de celule per imagine. Imagini reprezentative (C) de aderență statică ale BMDM-urilor marcate fluorescent (PKH67) la celulele endoteliale și (D) imagini cu celule de spumă colorate cu Oil Red O (ORO) și DAPI. Toate datele sunt afișate ca medie ± SD și fiecare punct reprezintă un animal individual (media de 4 imagini pentru aderența statică și formarea celulelor de spumă). Datele au fost analizate prin 2-mod ANOVA cu testul post-hoc Bonferroni. IFN- indică interferon-; şi LPS, lipopolizaharidă. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie stimulează ateroscleroza

Prin urmare, pentru a testa semnificația funcțională a imunității antrenate induse de hiperglicemie în ateroscleroză, am transplantat BM de la control normoglicemic sau șoareci donatori diabetici induși de streptozotocină (glucoză din sânge, 33,9 ± 6,9 mmol/L) în Ldl predispus la ateroscleroză (normoglicemic/) − șoareci receptori (Figura 5A). În fiecare caz, șoarecii donatori au fost transgenici pentru GFP sub controlul promotorului uman CD68.40 Grefarea eficientă și echivalentă a fost demonstrată prin analiza citometrică în flux a PBMC, confirmând prezența CD45 plus GFP plus celule pozitive fie pentru CD11b, fie pentru Ly6C ( Figura IVa și IVb din suplimentul de date). După 12 săptămâni cu o dietă de tip occidental, nu au existat diferențe în măsurătorile lipidelor din sânge (Figura IVc și IVd din suplimentul de date) sau subseturile de leucocite, așa cum au fost evaluate prin citometrie în flux (Figura IVe din suplimentul de date).

Șoarecii care au primit BM diabetic au prezentat o ateroscleroză semnificativ crescută, majoritatea având mai mult decât cea mai mare sarcină de ateroscleroză la primitorii non-diabetici (zonele mediane ale plăcii, 44461 µm2 [interval interquartil, 18368–59597 µm2] față de 79809 [47474745 µm2] ; Mann-Whitney, P=0.036). Acești șoareci au prezentat, de asemenea, o creștere a conținutului de macrofage al plăcilor (P=0.052; Figura V din suplimentul de date), zona centrală necrotică bogată în lipide (de 2,8-ori, P{{18). }}.0076; Figura VIa din suplimentul de date) și proporția miezului necrotic bogat în lipide (de 2,4-ori, P{=0.046; Figura VIb din suplimentul de date), dar fără diferențe de conținut de colagen (procentul de placă; Figura VIc și VId din suplimentul de date) sau celulele musculare netede (procentul de placă; figura VIe și VIf din suplimentul de date).

Imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie în HSC este determinată de modificări ale metabolismului care duc la reprogramarea epigenetică

Având în vedere demonstrația că BM de la șoareci hiperglicemici a promovat ateroscleroza, împreună cu expresia persistentă a genei proinflamatorii și răspunsurile funcționale găsite în BMDM in vitro, am motivat că această memorie a fost o manifestare a imunității antrenate în celulele derivate din BM. Imunitatea antrenată a fost asociată cu modificări ale metabolismului celular care induc semne epigenetice de lungă durată, care modifică cromatina, cum ar fi H3K4me3 și H3K27ac.17,18,41. , celule B, celule natural killer, celule dendritice, monocite, granulocite, celule eritroide: CD3−, CD4−, B220−, Ter119, Gr1− cultivate în condiții de glucoză extracelulară ridicată au prezentat, de asemenea, absorbție crescută de glucoză și producție de lactat, indicând glicoliză dereglată (P<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

În plăcile de rădăcină aortică, proporția de nuclee asociate cu macrofage colorate pozitiv pentru H3K4me3 a fost mai mare la șoarecii care au primit BM de la donatori diabetici (1.8-ori, P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

Figura 5. Măduva osoasă diabetică (BM) conduce ateroscleroza în ciuda normalizării prelungite a glucozei. A, Schema experimentului de transplant BM. B, Analiza citometrică în flux a populațiilor de leucocite periferice la șoareci după 12 săptămâni de transplant de măduvă osoasă. C, Imagini reprezentative ale rădăcinii aortice de la șoareci Ldlr-/- care au primit fie un donator diabetic, fie un donator de control CD68- GFP BM. Colorat cu tricrom Masson (stânga) și colorare cu imunofluorescență pentru macrofagele derivate din transplantul BM (verdele indică proteina fluorescentă verde [GFP]) sau toate macrofagele (roșul indică galectina-3 [GAL3]). Cuantificarea imaginii a volumului plăcii (D) (P=0.036). Datele prezentate ca medie±SD, analizate prin 1-mod ANOVA cu testul post hoc Bonferroni (B), sau median±interquartil interval, analizate prin testul Mann-Whitney U (D); control n=6, diabetic n=9. E, Imagini reprezentative ale rădăcinii aortice de la șoareci Ldlr-/- care au primit transplant BM fie diabetic, fie control. F, Cuantificarea procentului de nuclee colorate pozitiv pentru H3K4me3 sau H3K27ac în regiunea pozitivă a macrofagelor GAL3. Fiecare punct de date reprezintă un animal individual (medie, 6 secțiuni; n= 7 la 10). Afișat ca medie±SD. Analiză ANOVA unidirecțională. BMDM indică macrofage derivate din BM; HSC, celulă stem hematopoietică; IFN-, interferon-; şi LPS, lipopolizaharidă. *P<0.05.

Pentru a explora relevanța biologică a acestui set de regiuni genomice necodificatoare (cu accent pe funcția cis-reglatoare presupusă), regiunile cromatinei cu accesibilitate crescută în celulele diabetice au fost atribuite celor mai apropiate 2 gene (în termen de 10{{ 11}}0 kb) și analizate cu Instrumentul de îmbogățire a adnotărilor în regiunile genomice.33 Această analiză a căii a evidențiat creșterea mai multor căi legate de inflamație, inclusiv activarea leucocitelor (de 3 ori; FDR, 0,0005) ), și gene asociate cu tolerarea LPS în macrofage (de 2,7-ori; FDR, 0,0009). Pentru a înțelege dacă glucoza ridicată izolată ar putea induce și modificarea cromatinei, am folosit ATAC-seq pentru a analiza HSC-urile de la șoarecii de control și diabetici în absența stimulării IL-1. HSC-urile nestimulate au prezentat 357 de vârfuri diferențiale (FDR mai mică sau egală cu 0,2), dintre care 51 la sută au avut o accesibilitate crescută în celulele de origine diabetică, comparativ cu controlul, majoritatea în regiunile intrronice (48 la sută) sau intergenice (21 la sută).

Având în vedere aceste constatări în HSC, am examinat apoi accesibilitatea cromatinei și expresia genelor în BMDM-urile lor derivate. Am efectuat ATAC-seq și ARN-seq pe BMDM-uri de la șoareci de control și diabetici în condiții nestimulate sau stimulate proinflamator (LPS plus IFN-). BMDM-urile de la șoareci diabetici au arătat o accesibilitate diferențială a cromatinei în condiții nestimulate, cu 1047 de regiuni diferențiale (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). Luate împreună, datele ATAC-seq și RNAseq sugerează că diabetul a pregătit macrofagele pentru un răspuns exagerat la stimulul proinflamator.

Figura 6. Diabetul modifică nivelurile de H3K4me3 și H3K27ac și accesibilitatea cromatinei. Graficul MA a tuturor testelor pentru cromatina de secvențiere a cromatinei accesibile transpozazei citește în (A) macrofage derivate din măduva osoasă (BMDM) nestimulate sau (B) stimulate, unde vârfuri cu accesibilitate diferențială (rata de descoperire falsă)<0.05, fold change >1.5) sunt evidențiate cu roz (1047 nestimulat, 40 stimulat, n=6). C, regiuni variabile ale H3K4me3 și H3K27ac cuantificate prin secvențierea imunoprecipitării cromatinei în celulele stem hematopoietice (HSC) și BMDM de la șoareci martor față de șoareci diabetici (n=6 per grup). D, Histograma acoperirii medii a H3K27ac și K3K4me3 în HSC-uri, BMDM nestimulate și BMDM-uri stimulate proinflamator (lipopolizaharidă [LPS] plus interferon-[IFN]) la locurile de începere a transcripției ± 1 kb de gene care codifică proteine ​​din apropierea regiunilor de creștere accesibilitatea în BMDM-uri nestimulate (vs. controale; n=405) și comparată cu nivelurile de fundal din regiunile neselectate.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 pentru fiecare), am comparat modificarea plierii pentru vârful diferențial ATAC-seq versus modificarea plierii pentru DE. Examinate ca variabile continue, a existat o corelație puternică între modificările cromatinei și expresia genelor apropiate (R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 kb de la site-urile de începere a transcripției adnotate. Ne-am concentrat asupra genelor din apropierea acestor amplificatori, deoarece regiunile lor promotoare ale genelor (situurile de începere a transcripției ± 1 kb) reprezintă cele mai probabile ținte de reglementare. ATAC-seq a identificat 405 regiuni de cromatina deschisă diferențial (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

Figura 6. Diabetul modifică nivelurile de H3K4me3 și H3K27ac și accesibilitatea cromatinei. Graficul MA a tuturor testelor pentru cromatina de secvențiere a cromatinei accesibile transpozazei citește în (A) macrofage derivate din măduva osoasă (BMDM) nestimulate sau (B) stimulate, unde vârfuri cu accesibilitate diferențială (rata de descoperire falsă)<0.05, fold change >1.5) sunt evidențiate cu roz (1047 nestimulat, 40 stimulat, n=6). C, regiuni variabile ale H3K4me3 și H3K27ac cuantificate prin secvențierea imunoprecipitării cromatinei în celulele stem hematopoietice (HSC) și BMDM de la șoareci martor față de șoareci diabetici (n=6 per grup). D, Histograma acoperirii medii a H3K27ac și K3K4me3 în HSC-uri, BMDM nestimulate și BMDM-uri stimulate proinflamator (lipopolizaharidă [LPS] plus interferon-[IFN]) la locurile de începere a transcripției ± 1 kb de gene care codifică proteine ​​din apropierea regiunilor de creștere accesibilitatea în BMDM-uri nestimulate (vs. controale; n=405) și comparată cu nivelurile de fundal din regiunile neselectate.

Aceste diferențe s-au diminuat în BMDM (Figura 6D), în parte din cauza creșterii H3K27ac în celulele de origine nondiabetică după diferențiere. Cu toate acestea, marca H3K4me3 a fost crescută la acești promotori în HSC, diferențele identificabile persistând în macrofagele diferențiate, inclusiv după stimularea cu citokine (Figura 6D). Acest model de semne tranzitorii H3K27ac și H3K4me3 persistente este în concordanță cu constatările noastre atât în ​​cultura de țesut (Figura VIII din suplimentul de date), cât și în imunohistochimia în macrofagele plăcilor de șoarece (Figura 5E și 5F).

Zonele de cromatina deschisă diferențial identificate de ATAC-seq au fost asociate în mod semnificativ cu modificări ale transcripției genelor apropiate. Mai mult, cuantificarea diferenței de accesibilitate a cromatinei (diabet versus control) și compararea directă cu modificarea nivelurilor de expresie a ARNm ale genei apropiate au fost foarte corelate (R=0.5; P=6.2e) -15; Figura 7A). Pentru a examina aceste efecte la loci genomici relevanți, am combinat datele ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-seq și H3K27ac ChIP-seq la promotorii a 2 gene implicate anterior în imunitatea antrenată indusă de glicoliză și cu produse implicate în declanșarea inflamației (Il -6) și metabolismul glucozei (Hk1). Aceste gene au prezentat regiuni de cromatină accesibilă la locurile de pornire a transcripției, cu vârfuri asociate H3K4me3 și H3K27ac la acești loci genomici (Figura 7B).

Pentru a obține o perspectivă asupra factorilor de transcripție care ar putea fi implicați ca mediatori ai acestui model de imunitate antrenată indusă de hiperglicemie, Motif Enrichment Analysis33 a fost efectuată pe regiuni ale cromatinei cu accesibilitate crescută în condiții de diabet. Motivele factorului de transcripție îmbogățite semnificativ au inclus în special RUNX1 (FDR, 0.{0001), care a fost asociat anterior cu memoria imunologică46, precum și PU.1 (FDR, 0,04) și legarea CCCTC. factor (FDR, 1,8×10−7; Figura 8A). După ce am implicat factorul de transcripție RUNX147 pe baza accesibilității motivelor de legare, am investigat dacă genele țintă RUNX1 au fost semnificativ suprareprezentate printre genele DE în LPS plus BMDM-uri stimulate cu IFN. Această analiză a identificat 95 din 1348 de gene DE ca ținte RUNX1 (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

Pentru a stabili dacă profilul funcțional al macrofagului plăcii umane se potrivește cu cel al macrofagelor de șoarece, l-am comparat cu setul de 39 de gene M1 și M2 cu o expresie care a fost măsurată în BMDM-uri stimulate de la șoareci diabetici versus control (Figura 3G). Acestea au fost rezumate prin modificarea log-fold pozitivă sau negativă (diabetic versus control) și comparate cu modificările echivalente în macrofagele plăcii umane ale pacienților cu diabet zaharat de tip 2 (versus control). Un test exact Fisher a arătat o relație semnificativă între BMDM de șoarece și seturile de date de macrofage ale plăcii umane pentru gene reglate în sens în sus sau în jos la subiecții diabetici față de subiecții de control (P=0.0155; raportul de șanse, 6,83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 de gene comparativ cu martorii nondiabetici potriviți. Analiza de îmbogățire a setului de gene a genelor modificate a arătat o îmbogățire pozitivă în PBMC diabetici stimulate (versus controale) pentru căile Hallmark, inclusiv răspunsul inflamator (P=1.70×10−5) și semnalizarea IL{-6 JAK STAT3 ( P=0.0221) și căile Reactome, inclusiv speciile reactive de oxigen și producția de specii reactive de azot (P=0.0049), semnalizarea IL-/IL- (P=0.0110) și cascadă de receptor 1/2 de tip Toll (P=0.0033). Aceste căi demonstrează că aceste celule periferice au prezentat, de asemenea, caracteristici de amorsare similare cu cele pe care le raportăm în BMDM de la șoarecii diabetici (Figura 3G).

În sfârșit, pentru a explora în continuare un posibil rol cauzal pentru RUNX1 în răspunsurile imunității antrenate induse de hiperglicemie, BMDM care au fost diferențiate anterior în glucoză fiziologică sau ridicată au fost restabilite la 5 mmol/L glucoză și apoi stimulate în absența sau prezența RUNX farmacologic. 1-inhibitorul specific Ro5-333551 (Figura 8D). Celulele diferențiate în glucoză ridicată au prezentat o expresie crescută a Il-6 (2-ori, P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

Figura 8. Un rol pentru imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie RUNX1. Cele mai importante 3 motive ale factorilor de transcripție identificate într-un test pentru secvențierea cromatinei accesibile transpozazei (ATAC-seq) vârfuri îmbogățite diferențial (A) HSC diabetic nestimulat (n=3) în comparație cu celulele stem hematopoietice de control nestimulate (HSC; n{{6); }}). Agruparea ierarhică nesupravegheată a genelor exprimate diferențial din analiza de secvențiere a ARN (ARN-seq) a macrofagelor (BMDM) derivate din măduva osoasă (BM) (B) diabetici (n=6) ​​sau control (n=6) stimulat cu lipopolizaharidă (LPS) plus interferon- (IFN-). Agruparea ierarhică nesupravegheată a genelor exprimate diferențial din probele de macrofage din placă carotidă umană microdisecate cu laser pentru diabetici (n=8) sau control (n=16). B și C, genele țintă ale factorului de transcripție 1 (Runx1) legate de Runt (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

DISCUŢIE

Rate mari de complicații cardiovasculare persistă la pacienții cu diabet zaharat în ciuda controlului intens al glicemiei.52 Aici, oferim dovezi că hiperglicemia induce imunitate antrenată în HSC și macrofage și că acest lucru exacerbează semnificativ ateroscleroza. Arătăm că hiperglicemia induce modificări persistente în BM HSC prin conducerea glicolizei aerobe, ceea ce duce la modele particulare de accesibilitate a cromatinei, cu dovezi pentru o stare de amorsare proinflamatoare care persistă în macrofage diferențiate. Descoperirile noastre implică factori de transcripție, în special RUNX1, ca mediatori ai imunității antrenate. Inhibarea farmacologică a RUNX1 a eliminat aceste manifestări ale imunității antrenate induse de hiperglicemie in vitro.

Modificările în metabolismul celular pot induce imunitate antrenată, un termen care denotă memoria imună înnăscută care se poate dezvolta după o scurtă stimulare cu produse microbiene sau substanțe aterogene endogene, inclusiv LDL oxidat și lipoproteina(a).53 De exemplu, imunitatea antrenată indusă de -glucan. , o componentă a peretelui celular al Candida albicans, este mediată prin activarea căii dectinei-1–Akt–mTOR–HIF-1, care determină trecerea de la fosforilarea oxidativă la glicoliza aerobă (efectul Warburg). 18 Într-adevăr, mai mulți metaboliți din glicoliză și din ciclul acidului tricarboxilic acționează ca cofactori pentru enzimele modificatoare de histonă, care la rândul lor determină accesibilitatea cromatinei; de exemplu, histone acetiltransferaza și deacetilazele necesită acetil-CoA și NAD plus, în timp ce demetilazele precum Tet și JmjC folosesc -ketoglutaratul ca cofactor.19,54 Recent, reglarea metabolică a expresiei genei inflamatorii macrofage a fost direct legată de modificarea histonelor. acetilarea derivată din creșterea nivelului de lactat.55

Legăturile directe dintre metabolismul glucozei și modificările epigenetice, cuplate cu observații care sugerează memoria hiperglicemică la pacienții cu diabet, ne-au condus la ipoteza că hiperglicemia în sine poate conduce la modificări ale metabolismului celular, ducând la memoria imună înnăscută în diabet. În cazul -glucanului, glicoliza aerobă crescută în macrofage a dus la creșterea trimetilării histonei 3 Lys4 (H3K4me3) și a acetilării histonei 3 Lys27 (H3K27ac). Ambii acești markeri de modificare a cromatinei au fost măriți în contextul glicolizei conduse de glucoză ridicată. După cum sa demonstrat aici și în studiile anterioare, a existat o îmbogățire a H3K4me3 pe promotorii genelor legate de inflamație (de exemplu, Il-6) și metabolismul glucozei (de exemplu, Hk1).16,17 Intermediarii ciclului acidului tricarboxilic succinat și fumaratul este raportat că acționează ca antagoniști ai histonelor și ADN demetilazelor54 și, în concordanță cu aceasta, am constatat, de asemenea, că metaboliții ciclului acidului tricarboxilic succinat și malat sunt crescuti în celulele hiperglicemice.

Metropolis și colab.20 au arătat că, în contextul imunității înnăscute induse de glucan la progenitorii celulelor mieloide, citokinele pot media imunitatea antrenată. Mai exact, inhibarea IL-1 cu antagonistul receptorului anakinra a inhibat imunitatea antrenată indusă de glucan. S-a demonstrat, de asemenea, că dieta occidentală induce reprogramarea epigenetică în celulele progenitoare BM, conducând la o imunitate antrenată mediată de inflamazom, implicând căile de semnalizare IL-1 în imunitatea antrenată.56 Având în vedere că IL-1 mediază procese patologice multiple. în diabet,44 am examinat dacă IL-1 ar spori efectele glucozei ridicate în dezvoltarea imunității antrenate. Deși diabetul singur a arătat efecte asupra accesibilității cromatinei (cu analiza motivelor care implică PU.1, RUNX1 și factorul de legare CCCTC), efectele IL-1, în contextul celulelor care au fost amorsate de diabet, au fost și mai pronunțate ( și a implicat ERG, ZNF263 [zinc finger protein 263] și RUNX1). Acest lucru sugerează o relație ierarhică în care macrofagele au fost inițiate de hiperglicemie, dar manifestă modificări mai intense ca răspuns la un al doilea stimul.43 Într-adevăr, este bine recunoscut că modificările stărilor cromatinei la promotori pot sta la baza interacțiunilor funcționale complexe între diferiți stimuli de activare a macrofagelor. De exemplu, deși IFN- este incapabil să activeze multe gene inductibile de LPS, acesta poate induce acetilarea histonelor și remodelarea cromatinei la promotorii lor, prin urmare, pregătind celula pentru activarea viitoare ca răspuns la LPS.57

Analiza motivelor la locurile de cromatina deschisă a detectat o îmbogățire în situsurile de legare RUNX1. Dintr-o perspectivă funcțională, RUNX1 este necesar pentru generarea și întreținerea HSC-urilor și diferențierea diverselor linii.58 În monocite și macrofage, RUNX1 cooperează cu PU.1 (de asemenea implicat aici) pentru a regla factorul de stimulare a coloniilor de macrofage (factor de stimulare a coloniilor). -1), care este esențial pentru supraviețuirea, diferențierea și extinderea macrofagelor.59 Relevant pentru efectele de memorie funcțională pe care le-am observat în adeziunea monocitelor, RUNX1 este, de asemenea, un control important al interacțiunilor monocite-endoteliu prin intermediul reglarea antigenului 1/CD11a asociat funcției limfocitelor.31 În cele din urmă, inflamația mediată de receptorul Toll-like 4 și supraexprimarea RUNX1 cresc producția de IL-6 și IL-1 induse de receptorul Toll-like 4 prin RUNX1 se leagă de factorul nuclear-kB subunitatea p50, făcând sinergie ca un coactivator transcripțional.60 Luate împreună, există dovezi pentru o convergență puternică a funcției RUNX1 în macrofage către procesele de reglare care sunt importante în aterogeneză.

Prin urmare, am încrucișat genele sub control presupus al RUNX1 cu profilele transcripționale ale celulelor derivate din BMDM-uri de șoarece și în macrofage dintr-un cadru uman relevant in vivo. Macrofagele plăcii aterosclerotice umane și BMDM, în prezența diabetului, au arătat DE ale genelor reglate RUNX1-, inclusiv câteva legate anterior de inflamație și ateroscleroză.49,50 Lucrarea noastră o extinde pe cea a lui Alrdahe și colegii,61 care au arătat recent că macrofagele umane derivate din diabet cultivate timp de 6 zile in vitro mențin amorsarea proinflamatoare și hiperpolarizează la un fenotip proinflamator atunci când sunt stimulate cu LPS și IFN- sau factor de necroză tumorală-.

Interesant, unele dintre aceste gene țintă RUNX1 prezintă o expresie crescută în macrofagele plăcii de la pacienții cu diabet zaharat, și anume CRNKL1 și PLA2G5, în timp ce altele, cum ar fi ZNF32 (proteina degetului de zinc 32) și NUP214 (nucleoporină 214), au afișat o expresie mai scăzută la diabetici față de cei nediabetici. macrofage cu plăci. Deși acest lucru poate părea superficial inconsecvent, s-a demonstrat că RUNX1 promovează atât expresia genelor, cât și acționează ca un represor transcripțional.62 Acest lucru se întâmplă în primul rând prin recrutarea de histon deacetilaze precum HDAC1 și HDAC663 și histon metiltransferaze.62 Mai mult, interacțiunile fizice ale RUNX1. cu cromatina poate contribui la identitatea descendenței celulare. De exemplu, întreruperea interacțiunii RUNX1 în timpul mitozei duce la tranziția epitelială la mezenchimală.64 Inhibarea farmacologică a RUNX1 cu Ro5-3335 a normalizat expresia alterată a genei inflamatorii asociată cu imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie in vitro. Intervenția vizată împotriva RUNX1 oferă dovezi suplimentare ale implicării lui RUNX1 în efectele din aval ale imunității antrenate induse de hiperglicemie la macrofage.

Inducerea imunității antrenate indusă de hiperglicemie numai în macrofagele periferice ar fi putut conduce la progresia bolii, dar având în vedere efectele pe termen lung ale imunității antrenate și durata de viață relativ scurtă a celulelor mieloide periferice, ne-am gândit că, de asemenea, este posibil ca imunitatea antrenată să fi fost indusă. la nivelul HSC-urilor, așa cum s-a demonstrat recent pentru -glucan și dieta de tip occidental.20 Deși studiile anterioare au corelat de obicei schimbările epigenetice ale imunității antrenate cu un fenotip in vitro (de exemplu, producția de citokine), arătăm modul în care imunitatea antrenată în mod direct conduce la progresia aterosclerozei, o patologie importantă cu o componentă inflamatorie integrală. Transplantarea BM de la șoareci diabetici la șoareci predispuși la ateroscleroză normoglicemică a avut efecte marcate asupra progresiei leziunilor și a fost asociată cu creșterea miezului necrotic bogat în lipide, în concordanță cu forma agresivă de ateroscleroză observată în diabetul la om.65

Acest studiu este construit în jurul unei examinări a efectelor glucozei ridicate/hiperglicemiei. Pentru a ne permite să caracterizăm efectele pe termen lung ale hiperglicemiei, trăsăturile cardinale ale diabetului, am folosit modelul de șoarece cu streptozotocină pentru diabet, mai degrabă decât un model de șoarece cu diabet de tip 2, care ar fi putut încorpora caracteristici mai nuanțate ale acestui sindrom, dar ar confunda în mod eficient. studii asupra efectelor glucozei. Există diferențe semnificative între diabetul de tip 1 și de tip 2. Cu toate acestea, hiperglicemia este comună pentru diagnosticul lor, conduce riscul cardiovascular în fiecare și a fost ținta principală a tratamentelor și monitorizării pentru ambele tipuri de diabet de mulți ani. Ne așteptăm ca imunitatea antrenată indusă de hiperglicemie recent identificată raportată aici să fie elaborată în viitor pentru a lua în considerare modularea mai specifică despre multe alte influențe potențiale (de exemplu, zahărul alimentar,66 modele de creștere a glucozei,67 hiperlipidemie concomitentă57).

Descoperirile noastre au implicații importante pentru gestionarea complicațiilor aterosclerotice ale diabetului. Cel mai important, caracteristicile proaterogene ale celulelor mieloide și ale precursorilor BM persistă după normalizarea glicemiei. Acest lucru poate ajuta la explicarea lipsei de eficacitate a tratamentelor convenționale și provoacă fundamental abordarea managementului riscului vascular și complicațiilor diabetului. Identificarea factorilor determinanți metabolici și a modificărilor epigenetice particulare recomandă, de asemenea, potențiale noi ținte terapeutice.

INFORMAȚII ARTICOLULUI

Primit 27 februarie 2020; acceptat 23 iunie 2021.

Afilieri

Divizia de Medicină Cardiovasculară, Departamentul de Medicină Radcliffe, Universitatea Oxford, Marea Britanie (LE, NA, ATB, JB, JTC, MA, KZ, RA, TJC, MJC, KMC, RC, RPC). Centrul de Cercetare CeMM pentru Medicină Moleculară al Academiei Austriace de Științe, Viena, Austria (TK, AFR, CB). Divizia de Chimie Fiziologică II, Departamentul de Biochimie Medicală și Biofizică, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia (HG-A., CEW). Departamentul de Medicină Respiratorie și Alergie (HG-A., CEW) și Departamentul de Medicină (H7) (JL, MR), Spitalul Universitar Karolinska, Stockholm, Suedia. Institutul Kennedy de Reumatologie, Universitatea din Oxford, Marea Britanie (ALC, TEK, IAU). Institutul de Inteligență Artificială și Asistență pentru Decizie, Centrul pentru Statistică Medicală, Informatică și Sisteme Inteligente, Universitatea de Medicină din Viena, Austria (CB). Bioinfo, Plantagenet, ON, Canada (MEL). Departamentul de Medicină Internă, Centrul Medical al Universității Radboud, Nijmegen, Țările de Jos (NPR., MGN). Departamentul pentru Genomică și Imunoreglare, Institutul de Științe Medicale și Vieții (LIMES), Universitatea din Bonn, Germania (MGN).

Mulțumiri

Autorii le mulțumesc Lisei Heather, Maria da Luz Sousa Fiahlo și Thomas Milne pentru asistență. RPC, NA și LE au conceput studiul. LE a efectuat toate experimentele in vitro, analizele expresiei genelor și imunoblotajul descrise. MA a contribuit la studiile pe probe umane. CEW și HG-A. a efectuat metabolomica bazata pe spectrometrie de masa. JTC a efectuat lucrări LCM de macrofage cu plăci umane și pregătirea matricei. LE a efectuat experimente cu Seahorse Bioanalyser sub îndrumarea lui JB și sub supravegherea MJCALC și a efectuat analize de sortare a celulelor. LE a pregătit probe de ARN-seq. LE a pregătit mostre ATAC-seq sub îndrumarea TEK și sub supravegherea IAU. NA a efectuat toate preparatele de celule de secvențiere ChIP. Secvențierea a fost efectuată de TK și AFR sub supravegherea CB. MEL și ATB au efectuat secvențierea alinierii datelor, normalizării și controlului calității, cu LE efectuând analize în aval. MEL și ATB au efectuat analize ale datelor de matrice și secvențiere. KZ, RA și RC au condus investigații pe animale. LE, NA, TJC, NPR și MGN au participat la proiectarea și execuția experimentală. RPC, LE, NA și MEL au pregătit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat trimiterea finală a manuscrisului.

Surse de finanțare

Această lucrare a fost susținută de Centrul de Excelență în Cercetare a Fundației Britanice pentru Inimă Oxford (RE/13/1/30181), Grantul de proiect al Fundației Britanice pentru Inimă (Dr. Akbar și Choudhury: PG/18/53/33895), Institutul Național pentru Cercetare în Sănătate Centrul de Cercetare Biomedicală Oxford, Consorțiul Tripartit de Imunometabolism – Fundația Novo Nordisk (grant NNF15CC0018486; Drs Choudhury, Udalova, Rydén, Channon și Wheelock), Inflamația legată de metaboliți în bolile cu spectrul diabetului zaharat: noi ținte dincolo de Fundația NordisMekRIADlucoo , grant 0064142; doctorii Choudhury, Udalova, Rydén și Channon) și un doctorat de 4-an British Heart Foundation. studenție și Doris Field Trust (Dr. Edgar). Grupul de genomică de mare capacitate de la Wellcome Trust Center for Human Genetics a fost finanțat de referința de grant Wellcome Trust 090532/Z/09/Z și de grantul MRC Hub G0900747 91070. Facilitatea de secvențiere biomedicală de la Centrul de Cercetare CeMM pentru Medicină Moleculară al Academiei Austriace de Științe din Viena, Austria. Dr. Riksen și Netea au primit finanțare din programul de cercetare și inovare Orizont 2020 al Uniunii Europene în baza acordului de grant 667837. Dr. Netea a fost susținut de un Grant ERC Consolidator (nr. 310372) și Organizația Olandeză pentru Cercetare Științifică.

Dezvăluiri

Nici unul.

Materiale suplimentare

Supliment de date Figurile I–XI

Supliment de date Fișiere Excel I–VII

REFERINȚE

1. Asociația Americană de Diabet. Bolile cardiovasculare și managementul riscului. Îngrijirea diabetului. 2015;38:S49–S57. doi: 10.2337/dc15-S011

2. Nathan DM, Cleary PA, Backlund JY, Genuth SM, Lachin JM, Orchard TJ, Raskin P, Zinman B; Controlul diabetului și Complicațiile Trial/Epidemiologia intervențiilor și complicațiilor diabetului (DCCT/EDIC) Grupul de cercetare. Tratament intensiv diabet zaharat și boli cardiovasculare la pacienții cu diabet zaharat de tip 1. N Engl J Med. 2005;353:2643–2653. doi: 10.1056/NEJMoa052187

3. Nathan DM, Genuth S, Lachin J, Cleary P, Crofford O, Davis M, Rand L, Siebert C, Diabet Control and Complications Trial Research Group. Efectul tratamentului intensiv al diabetului zaharat asupra dezvoltării și progresiei complicațiilor pe termen lung în diabetul zaharat insulino-dependent. N Engl J Med. 1993;329:977–986. doi: 10.1056/NEJM199309303291401

4. ACCORD, Gerstein HC, Miller ME, Genuth S, Ismail-Beigi F, Buse JB, Goff DC Jr, Probstfield JL, Cushman WC, Ginsberg HN, Bigger JT și colab. Efectele pe termen lung ale scăderii intensive a glicemiei asupra rezultatelor cardiovasculare. N Engl J Med. 2011;364:818–828. doi: 10.1056/NEJMoa1006524

5. Zinman B, Wanner C, Lachin JM, Fitchett D, Bluhmki E, Hantel S, Mattheus M, Devins T, Johansen OE, Woerle HJ, et al; EMPA-REG REZULTAT Investigatorii. Empagliflozin, rezultate cardiovasculare și mortalitate în diabetul de tip 2. N Engl J Med. 2015;373:2117–2128. doi: 10.1056/NEJMoa1504720

6. Newman JD, Vani AK, Aleman JO, Weintraub HS, Berger JS, Schwartzbard AZ. Peisajul în schimbare al terapiei diabetului pentru reducerea riscului cardiovascular: revizuire de ultimă generație JACC. J Am Coll Cardiol. 2018;72:1856– 1869. doi: 10.1016/j.jacc.2018.07.071

7. Chalmers J, Cooper ME. UKPDS și efectul moștenire. N Engl J Med. 2008;359:1618–1620. doi: 10.1056/NEJMe0807625

8. Moore KJ, Sheedy FJ, Fisher EA. Macrofage în ateroscleroză: un echilibru dinamic. Nat Rev Immunol. 2013;13:709–721. doi: 10.1038/nri3520

9. Martinez FO, Gordon S. Paradigma M1 și M2 a activării macrofagelor: timpul pentru reevaluare. F1000Prime Rep. 2014;6:13. doi: 10.12703/P6-13

10. Parathath S, Grauer L, Huang LS, Sanson M, Distel E, Goldberg IJ, Fisher EA. Diabetul afectează negativ macrofagele în timpul regresiei plăcii aterosclerotice la șoareci. Diabet. 2011;60:1759–1769. doi: 10,2337/db10-0778

11. Shanmugam N, Reddy MA, Guha M, Natarajan R. Expresia indusă de glucoză ridicată a genelor de citokine și chemokine proinflamatorii în celulele monocitare. Diabet. 2003;52:1256–1264. doi: 10.2337/diabetes.52.5.1256

12. O'Neill LA, Pearce EJ. Imunometabolismul guvernează funcția celulelor dendritice și a macrofagelor. J Exp Med. 2016;213:15–23. doi: 10.1084/jem.20151570

13. Vats D, Mukundan L, Odegaard JI, Zhang L, Smith KL, Morel CR, Wagner RA, Greaves DR, Murray PJ, Chawla A. Metabolismul oxidativ și PGC-1beta atenuează inflamația mediată de macrofage. Cell Metab. 2006;4:13– 24. doi: 10.1016/j.cmet.2006.05.011

14. Tannahill GM, Curtis AM, Adamik J, Palsson-McDermott EM, McGettrick AF, Goel G, Frezza C, Bernard NJ, Kelly B, Foley NH și colab. Succinatul este un semnal inflamator care induce IL-1 prin HIF-1. Natură. 2013;496:238–242. doi: 10.1038/nature11986

15. Renner K, Singer K, Koehl GE, Geissler EK, Peter K, Siska PJ, Kreutz M. Semnele distinctive metabolice ale celulelor tumorale și imune în micromediul tumoral. Front Immunol. 2017;8:248. doi: 10.3389/fimmu.2017.00248

16. Stienstra R, Netea-Maier RT, Riksen NP, Joosten LAB, Netea MG. Reprogramarea specifică și complexă a metabolismului celular în celulele mieloide în timpul răspunsurilor imune înnăscute. Cell Metab. 2017;26:142–156. doi: 10.1016/j.cmet.2017.06.001

17. Bekkering S, Arts RJW, Novakovic B, Kourtzelis I, van der Heijden CDCC, Li Y, Popa CD, Ter Horst R, van Tuijl J, Netea-Maier RT, et al. Inducerea metabolică a imunității antrenate prin calea mevalonatului. Celulă. 2018;172:135–146.e9. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.025

18. Cheng SC, Quintin J, Cramer RA, Shepardson KM, Saeed S, Kumar V, Giamarellos-Bourboulis EJ, Martens JH, Rao NA, Aghajanirefah A, et al. Glicoliza aerobă mediată de mTOR și HIF-1 -ca bază metabolică pentru imunitatea antrenată. Ştiinţă. 2014;345:1250684. doi: 10.1126/ science.1250684

19. Donohoe DR, Bultman SJ. Metaboloepogenetica: interrelații între metabolismul energetic și controlul epigenetic al expresiei genelor. J Cell Physiol. 2012;227:3169–3177. doi: 10.1002/jcp.24054

20. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzybek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, et al. Modularea progenitorilor mielopoiezei este o componentă integrală a imunității antrenate. Celulă. 2018;172:147– 161.e12. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.03421. Choudhury RP, Rong JX, Trogan E, Elmalem VI, Dansky HM, Breslow JL, Witztum JL, Fallon JT, Fisher EA. Lipoproteinele de înaltă densitate întârzie progresia aterosclerozei și remodelează favorabil leziunile fără a suprima indicii de inflamație sau oxidare. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2004;24:1904–1909. doi: 10.1161/01.ATV.0000142808.34602.25

22. Feig JE, Vengrenyuk Y, Reiser V, Wu C, Statnikov A, Aliferis CF, Garabedian MJ, Fisher EA, Puig O. Regresia aterosclerozei este caracterizată prin modificări largi ale transcriptomului macrofagului plăcii. Plus unu. 2012;7:e39790. doi: 10.1371/journal.pone.0039790

23. Trogan E, Choudhury RP, Danssky HM, Rong JX, Breslow JL, Fisher EA. Analiza prin microdisecție cu captură cu laser a expresiei genelor la macrofage de la leziunile aterosclerotice ale șoarecilor cu deficit de apolipoproteină E. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:2234–2239. doi: 10.1073/pnas.042683999

24. Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, Bravo HC, Davis S, Gatto L, Girke T și colab. Orchestrarea analizei genomice de mare performanță cu Bioconductor. Metode Nat. 2015;12:115–121. doi: 10.1038/nmeth.3252

25. Dunning MJ, Smith ML, Ritchie ME, Tavaré S. Beadarray: clase R și metode pentru datele bazate pe mărgele Illumina. Bioinformatica. 2007;23:2183– 2184. doi: 10.1093/bioinformatics/btm311

26. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. Limma alimentează analizele de expresie diferențială pentru studiile de secvențiere a ARN și microarray. Acizi nucleici Res. 2015;43:e47. doi: 10.1093/nar/gkv007

27. Kamleh MA, Snowden SG, Grapov D, Blackburn GJ, Watson DG, Xu N, Ståhle M, Wheelock CE. Metabolomica LC-MS la pacienții cu psoriazis dezvăluie creșteri dependente de severitatea bolii ale aminoacizilor circulanți, care sunt ameliorate prin tratamentul anti-TNF. J Proteome Res. 2015;14:557–566. doi: 10.1021/pr500782g

28. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: o metodă de testare a accesibilității cromatinei la nivelul întregului genom. Curr Protoc Mol Biol. 2015;109:21.29.1–21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109

29. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W și colab. Analiza bazată pe model a ChIPSeq (MACS). Genom Biol. 2008;9:R137. doi: 10.1186/gb-2008-9-9-r137

30. Ross-Innes CS, Stark R, Teschendorff AE, Holmes KA, Ali HR, Dunning MJ, Brown GD, Gojis O, Ellis IO, Green AR și colab. Legarea diferențială a receptorilor de estrogen este asociată cu rezultatele clinice în cancerul de sân. Natură. 2012;481:389–393. doi: 10.1038/nature10730

31. Puig-Kröger A, Sanchez-Elsner T, Ruiz N, Andreu EJ, Prosper F, Jensen UB, Gil J, Erickson P, Drabkin H, Groner Y, et al. Factorii RUNX/AML și C/EBP reglează expresia integrinei CD11a în celulele mieloide prin elemente de reglementare suprapuse. Sânge. 2003;102:3252–3261. doi: 10.1182/ sânge-2003-02-0618

32. McLean CY, Bristor D, Hiller M, Clarke SL, Schaar BT, Lowe CB, Wenger AM, Bejerano G. GREAT îmbunătățește interpretarea funcțională a regiunilor de reglare cis. Nat Biotechnol. 2010;28:495–501. doi: 10.1038/not.1630

33. Machanick P, Bailey TL. MEME-ChIP: analiza motivelor unor seturi mari de date ADN. Bioinformatica. 2011;27:1696–1697. doi: 10.1093/bioinformatics/btr189

34. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, ​​Chaisson M, Gingeras TR. STAR: alinier universal ultrarapid ARN-seq. Bioinformatica. 2013;29:15–21. doi: 10.1093/bioinformatics/bts635

35. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Analiza expresiei diferențiale a experimentelor multifactor ARN-Seq privind variația biologică. Acizi nucleici Res. 2012;40:4288–4297. doi: 10.1093/nar/gks042

36. Kolde R. Pretty Heatmap. 2015. Accesat 24 iunie 2021. https://rdrr.io/ can/heatmap/

37. Freemerman AJ, Johnson AR, Sacks GN, Milner JJ, Kirk EL, Troester MA, Macintyre AN, Goraksha-Hicks P, Rathmell JC, Makowski L. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives un fenotip proinflamator. J Biol Chem. 2014;289:7884–7896. doi: 10.1074/jbc.M113.522037

38. Herbin O, Regelmann AG, Ramkhelawon B, Weinstein EG, Moore KJ, Alexandropoulos K. Adeziunea monocitelor și recrutarea plăcii în timpul dezvoltării aterosclerozei este reglată de proteina adaptor ChatH/SHEP1. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2016;36:1791–1801. doi: 10.1161/ATVBAHA.116.308014

39. Luo Y, Duan H, Qian Y, Feng L, Wu Z, Wang F, Feng J, Yang D, Qin Z, Yan X. CD146 macrofagic promovează formarea și retenția celulelor spumoase în timpul aterosclerozei. Cell Res. 2017;27:352–372. doi: 10.1038/cr.2017.8

40. Iqbal AJ, McNeill E, Kapellos TS, Regan-Komito D, Norman S, Burd S, Smart N, Machemer DE, Stylianou E, McShane H, et al. Șoarecii transgenici GFP promotor CD68 uman permit o analiză a diferențierii monocite-la-macrofage in vivo. Sânge. 2014;124:e33–e44. doi: 10.1182/sânge-2014-04-568691

41. Arts RJW, Carvalho A, La Rocca C, Palma C, Rodrigues F, Silvestre R, Kleinnijenhuis J, Lachmandas E, Gonçalves LG, Belinha A, et al. Căi imunometabolice în imunitatea antrenată indusă de BCG. Cell Rep. 2016;17:2562–2571. doi: 10.1016/j.celrep.2016.11.011

42. Moorlag SJCFM, Röring RJ, Joosten LAB, Netea MG. Rolul familiei interleukine-1 în imunitatea antrenată. Immunol Rev. 2018;281:28–39. doi: 10.1111/or.12617

43. Herder C, Dalmas E, Böni-Schnetzler M, Donath MY. Calea IL-1 în diabetul de tip 2 și complicațiile cardiovasculare. Tendințe Endocrinol Metab. 2015;26:551–563. doi: 10.1016/j.tem.2015.08.001

44. Engelbertsen D, Rattik S, Wigren M, Vallejo J, Marinkovic G, Schiopu A, Björkbacka H, ​​Nilsson J, Bengtsson E. IL-1R și semnalizarea MyD88 în celulele CD4 plus T promovează imunitatea Th17 și ateroscleroza . Cardiovasc Res. 2018;114:180–187. doi: 10.1093/cvr/cvx196

45. Nagareddy PR, Kraakman M, Masters SL, Stirzaker RA, Gorman DJ, Grant RW, Dragoljevic D, Hong ES, Abdel-Latif A, Smyth SS și colab. Macrofagele țesutului adipos promovează mielopoieza și monocitoza în obezitate. Cell Metab. 2014;19:821–835. doi: 10.1016/j.cmet.2014.03.029

46. ​​Bevington SL, Cauchy P, Piper J, Bertrand E, Lalli N, Jarvis RC, Gilding LN, Ott S, Bonifer C, Cockerill PN. Amorsarea cromatinei inductibile este asociată cu stabilirea memoriei imunologice în celulele T. EMBO J. 2016;35:515–535. doi: 10.15252/bj.201592534

47. Buske FA, Bodén M, Bauer DC, Bailey TL. Atribuirea de roluri motivelor de reglare a ADN-ului folosind genomica comparativă. Bioinformatica. 2010;26:860–866. doi: 10.1093/bioinformatics/btq049

48. Puig O, Yuan J, Stepaniants S, Zieba R, Zycband E, Morris M, Coulter S, Yu X, Menke J, Woods J și colab. O semnătură a expresiei genei care clasifică placa aterosclerotică umană în funcție de starea relativă a inflamației. Circ Cardiovasc Genet. 2011;4:595–604. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.111.960773

49. Turner RJ, Bushnell CD, Register TC, Sharp FR. Corelații dependente de gen ale grosimii carotidei intime-media cu expresia genelor în sânge. Transl Stroke Res. 2011;2:171–178. doi: 10.1007/s12975-011-0066-4

50. Webb NR, Bostrom MA, Szilvassy SJ, van der Westhuyzen DR, Daugherty A, de Beer FC. Fosfolipaza A2 secretorie a grupului IIA exprimat de macrofage crește formarea de leziuni aterosclerotice la șoarecii cu deficit de receptori LDL. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2003;23:263–268. doi: 10.1161/01.atv.0000051701.90972.e5

51. Cunningham L, Finckbeiner S, Hyde RK, Southall N, Marugan J, Yedavalli VR, Dehdashti SJ, Reinhold WC, Alemu L, Zhao L și colab. Identificarea benzodiazepinei Ro5-3335 ca inhibitor al leucemiei CBF prin screening cantitativ cu randament ridicat împotriva interacțiunii RUNX1-CBF. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:14592–14597. doi: 10.1073/pnas.1200037109

52. Reaven PD, Emanuele NV, Wiitala WL, Bahn GD, Reda DJ, McCarren M, Duckworth WC, Hayward RA; Anchetatorii VADT. Control intensiv al glicemiei la pacienții cu diabet zaharat de tip 2: urmărire 15-anală. N Engl J Med. 2019;380:2215–2224. doi: 10.1056/NEJMoa1806802

53. Arts RJ, Joosten LA, Netea MG. Circuite imunometabolice în imunitatea antrenată. Semin Immunol. 2016;28:425–430. doi: 10.1016/j.smim.2016.09.00254. Quintin J, Saeed S, Martens JHA, Giamarellos-Bourboulis EJ, Ifrim DC, Logie C, Jacobs L, Jansen T, Kullberg BJ, Wijmenga C și colab. Infecția cu Candida albicans oferă protecție împotriva reinfectării prin reprogramarea funcțională a monocitelor. Microbul gazdă celulară. 2012;12:223–232. doi: 10.1016/j. com.2012.06.006

55. Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, Liu W, Kim S, Lee S, Perez-Neut M și colab. Reglarea metabolică a expresiei genelor prin acetilarea histonelor. Natură. 2019;574:575–580. doi: 10.1038/s41586-019-1678-1

56. Christ A, Günther P, Lauterbach MAR, Duewell P, Biswas D, Pelka K, Scholz CJ, Oosting M, Haendler K, Baßler K și colab. Dieta occidentală declanșează o reprogramare imunitară înnăscută dependentă de NLRP3-. Celulă. 2018;172:162–175.e14. doi: 10.1016/j.cell.2017.12.013

57. Glass CK, Natoli G. Controlul molecular al activării și amorsării în macrofage. Nat Immunol. 2016;17:26–33. doi: 10.1038/ni.3306

58. Voon DC, Hor YT, Ito Y. Complexul RUNX: depășirea hematopoiezei în imunitate. Imunologie. 2015;146:523–536. doi: 10.1111/imm.12535

59. Himes SR, Cronau S, Mulford C, Hume DA. Factorul de transcripție Runx1 controlează creșterea și supraviețuirea macrofagelor dependente și independente de LCR-1-. Oncogene. 2005;24:5278–5286. doi: 10.1038/SJ. onc.1208657

60. Zhang S, Yu M, Guo Q, Li R, Li G, Tan S, Li X, Wei Y, Wu M. Anexina A2 se leagă de endozomi și reglează negativ răspunsurile inflamatorii declanșate de TLR4-prin TRAM- calea TRIF. Sci Rep. 2015;5:15859. doi: 10.1038/srep15859

61. Alrdahe S, Al Sadoun H, Torbica T, McKenzie EA, Bowling FL, Boulton AJM, Mace KA. Dereglarea dezvoltării macrofagelor și a fenotipului la macrofagele umane diabetice poate fi salvată prin transducția proteinei Hoxa3. Plus unu. 2019;14:e0223980. doi: 10.1371/journal.pone.0223980

62. Durst KL, Hiebert SW. Rolul membrilor familiei RUNX în represiunea transcripțională și atenuarea genelor. Oncogene. 2004;23:4220–4224. doi: 10.1038/sj.onc.1207122

63. Amann JM, Nip J, Strom DK, Lutterbach B, Harada H, Lenny N, Downing JR, Meyers S, Hiebert SW. ETO, o țintă a t (8; 21) în leucemia acută, face contacte distincte cu multiple histon deacetilaze și leagă mSin3A prin domeniul său de oligomerizare. Mol Cell Biol. 2001;21:6470–6483. doi: 10.1128/MCB.21.19.6470-6483.2001

64. Rose JT, Moskovitz E, Boyd JR, Gordon JA, Bouffard NA, Fritz AJ, Illendula A, Bushweller JH, Lian JB, Stein JL și colab. Inhibarea complexului factor de transcripție RUNX1-CBF compromite identitatea celulelor epiteliale mamare: un fenotip potențial stabilizat prin marcarea genei mitotice. Oncotarget. 2020;11:2512–2530. doi: 10.18632/oncotarget.27637

65. Moreno PR, Murcia AM, Palacios IF, Leon MN, Bernardi VH, Fuster V, Fallon JT. Compoziția coronariană și infiltrarea macrofagelor în specimenele de aterectomie de la pacienți cu diabet zaharat. Circulaţie. 2000;102:2180– 2184. doi: 10.1161/01.cir.102.18.2180

66. Perazza LR, Mitchell PL, Jensen BAH, Daniel N, Boyer M, Varin TV, Bouchareb R, Nachbar RT, Bouchard M, Blais M, et al. Zaharoza alimentară induce inflamația metabolică și bolile cardiovasculare aterosclerotice mai mult decât grăsimile alimentare la șoarecii LDLr-/-ApoB100/100. Ateroscleroza. 2020;304:9–21. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2020.05.002

67. Flynn MC, Kraakman MJ, Tikellis C, Lee MKS, Hanssen NMJ, Kammoun HL, Pickering RJ, Dragoljevic D, Al-Sharea A, Barrett TJ și colab. Hiperglicemia intermitentă tranzitorie accelerează ateroscleroza prin promovarea mielopoiezei. Circ Res. 2020;127:877–892. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.120. 316653

Laurence Edgar, DPhil*; Naveed Akbar, Ph.D.*; Adam T. Braithwaite, Ph.D.; Thomas Krausgruber, Ph.D.; dr. Héctor Gallart-Ayala; Jade Bailey, DPhil; Alastair L. Corbin, DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; Joshua T. Chai, DPhil; Mohammad Alkhalil, DPhil; dr. André F. Rendeiro; Klemen Ziberna, DPhil; Ritu Arya, MRes; Thomas J. Cahill, DPhil; Christoph Bock, Ph.D.; Jurga Laurencikiene, Ph.D.; Mark J. Crabtree, Ph.D.; Madeleine E. Lemieux, Ph.D.; Niels P. Riksen, MD, Ph.D.; dr. Mihai G. Netea; Craig E. Wheelock, Ph.D.; Keith M. Channon, MD; Mikael Rydén, MD, Ph.D.; dr. Irina A. Udalova; dr. Ricardo Carnicer; Robin P. Choudhury, DM.

For more information:1950477648nn@gmail.com