Hipotermia indusă de oxcarbazepină după ce ischemia tranzitorie a creierului anterior exercită o neuroprotecție terapeutică prin potențialul de receptori tranzitori de tip vaniloid 1 și 4 la gerbili, partea 3

4. Materiale și Metode

4.1. Animale experimentale

Gerbilii masculi (număr total=252) au fost utilizați la vârsta de 6 luni (greutate corporală, 63–78 g). Gerbilii au fost crescuți în Centrul pentru animale experimentale al Universității Naționale Kangwon (Chuncheon, Coreea).

Gerbilii sunt animale mici foarte drăguțe. Ei trăiesc în zone deșertice, sunt buni la săpat peșteri și au instincte puternice pentru depozitarea și localizarea alimentelor. Printre acești băieți, gerbilii masculi au o memorie deosebit de bună, ceea ce îi face pe oameni să-și dorească să-și cunoască secretele.

În primul rând, când gerbilii masculi caută hrană, folosesc o serie de semnale, cum ar fi repere și teren, pentru a determina direcția. Prin observare și practică pe termen lung, aceștia și-au stabilit propriul „sistem de informații geografice”. În schimb, femelele gerbile au o memorie mai proastă pentru aceste semnale, mai ales într-un mediu în continuă schimbare.

În al doilea rând, gerbilii de sex masculin arată, de asemenea, o amintire puternică atunci când luptă cu dușmanii naturali. Potrivit oamenilor de știință, când gerbilii vor fi amenințați, vor intra rapid în groapă și vor încerca să scape. Dar atunci când se confruntă cu aceeași amenințare, masculii gerbili își vor aminti modul de atac al inamicilor naturali și îi vor evita, sporindu-și șansele de supraviețuire.

În cele din urmă, amintirea gerbililor masculi se află și în comportamentul lor social unul cu celălalt. Fiecare gerbil are mirosul său unic. Când întâlnesc alți gerbili, își vor folosi simțul mirosului pentru a-și identifica identitatea și statutul reciproc. Această capacitate de memorie nu numai că permite gerbililor să stabilească o conexiune socială relativ stabilă, dar este și o garanție importantă pentru reproducerea lor.

Pe scurt, relația dintre gerbilii masculi și memorie este inseparabilă. În procesul de căutare a supraviețuirii și reproducerii în natură, ei se bazează pe memoria lor puternică pentru a se adapta în mod constant la mediul înconjurător și a se îmbunătăți. Ca oameni, ar trebui să învățăm de la acești băieți și să ne perfecționăm în mod constant memoria pentru a ne adapta mai bine la această lume în continuă schimbare. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelului de acetilcolină și a factorilor de creștere, care sunt foarte importanți pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul obține suficientă nutriție și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe Know pentru a crește puterea memoriei

Pentru acest studiu, a fost aprobat protocolul experimental (nr. Aprobare. KW -200113-1; data aprobării, 18 februarie 2020) de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor.

Protocolul de cercetare a aderat la liniile directoare sugerate în „Legile și politicile internaționale actuale” din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de The National Academies Press (ed. a 8-a, 2011).

4.2. Grupuri experimentale, inducerea tFI și tratamente HyT și OXC

Pentru a dovedi efectele protectoare ale OXC împotriva leziunilor ischemice în urma FI la gerbili, gerbilii au fost împărțiți în șase grupuri: (1) grup simulat+vehicul (n=24); (2) grup tFI+vehicul (n {{5} }}); (3) sham+HyT group (n=24); (4) tFI+HyT group (n=60);(5) sham+OXC (200 mg/kg) group (n=24); and (6) tFI+OXC group (n=60).

Șapte și cinci gerbili din cele trei grupuri tFI au fost utilizate pentru analiza Western blot și, respectiv, examenul histologic, la 30 min, 12 ore, 1 zi, 2 zile și 4 zile după operația tFI, iar în cele trei grupuri de simulare, șapte și cinci gerbilii au fost folosiți la 30 de minute și 4 zile după operația simulată pentru a minimiza numărul. În acest experiment, tFI a fost dezvoltat așa cum a fost descris anterior [34].

Pe scurt, gerbilii au fost anesteziați cu 2,5% izofluran (în 32% oxigen și 68% protoxid de azot). Sub anestezie, ambele artere carotide comune au fost izolate de teaca carotidiană, obturate cu cleme pentru anevrism (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Germania, ) timp de cinci minute.

Oprirea perfectă a alimentării cu sânge a creierului a fost confirmată prin observarea fluxului sanguin arterial în ambele artere retiniene (ramuri ale carotidarelor interne) cu ajutorul unui oftalmoscop (HEINE K180®) de la Heine Optotechnik (Herrsching, Germania).

Temperatura corpului înainte și în timpul intervenției chirurgicale în toate grupurile a fost controlată la normotermie (37 ± 0.2 ◦C) folosind o pătură termometrică. După cinci minute de ocluzie, clemele au fost îndepărtate.

În acest studiu, a fost făcută o operație de tâmplărie prin supusthem la aceeași intervenție chirurgicală TFI, fără ocluzia arterelor carotide comune. HHYT în cele două grupuri Sham+HYT și TFI+HYT a fost controlată (similar cu temperatura corpului schimbării în TFI+ grup OXC) prin răcirea întregului corp cu o pungă de gheață timp de șase ore.

Temperatura corporală a celor două grupuri sham+OXC și tFI+OXC a fost înregistrată timp de șase ore după injectarea intraperitoneală imediată a 200 mg/kg OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) după operația tFI.

Doza de OXC a fost selectată pe baza unui studiu anterior care a raportat că 200 mg/kg OXC a protejat eficient împotriva morții celulare în creier după [36]. Pentru a înregistra schimbarea temperaturii corpului, temperatura corpului a fost măsurată în rect la fiecare oră după tFI, peste o perioadă de 6 ore, la temperatura camerei ambiante (aproximativ 22 ◦C).

Gerbilii au primit un timp de recuperare de patru zile după tFI, deoarece celulele piramidale situate în regiunea CA1 hipocampală încep să moară la patru zile după tFI [30,34,62].

4.3. Testul SMA

Testul SMA a fost efectuat pentru a examina modificările hiperactivitatii în toate grupurile. Pe scurt, așa cum s-a descris anterior [63], testul SMA a fost făcut în ziua 1 după tFI, deoarece activitatea locomotorie atinge cel mai înalt punct în ziua 1 după leziunea ischemică după tFI.

Gerbilii tuturor grupelor au primit adaptare la mediu timp de două ore și au fost plasați într-o cușcă de câmp deschis (lățime, 44 cm; lungime, 44 cm; înălțime, 30) obținută de la Ugo Basile SRL (Gemonio, Italia), în care două orizontale paralele. au fost instalate fascicule infraroșii la 4 × 8 de pe podea, timp de o oră. SMA a fost înregistrat folosind un Photobeam Activity System-Home Cage de la San Diego Instruments (San Diego, CA, SUA).

Mișcarea (traiectorie și distanța totală parcursă) a fost detectată prin întreruperea matricei de fascicule infraroșii produse de fotocelule.

SMA a fost monitorizat continuu timp de o oră, iar datele au fost colectate folosind un analizor AMB de la IPC Electronics (Cumbria, Marea Britanie).

The data collection wasinitiated 15 min following habituation in the open field cage. Finally, the obtained resultswere evaluated as the distance (meters) of movement in the test period (one hour).

4.4. Teste ale funcțiilor cognitive

4.4.1. RAMT

Pentru a compara memoria spațială în toate grupurile, RAMT a fost efectuat în conformitate cu studiile toprecedente [38,44]. Pentru acest test a fost utilizat un radial 8- braț de la Stoelting Co (Wood Dale, IL, SUA).

Instrumentul labirintului a constat dintr-o platformă centrală și opt brațe (fiecare lățime de braț, 5 cm; înălțime, 9 cm; lungime, 35 cm). Gerbilii au fost dresați o dată pe zi timp de trei zile înainte de.

Și anume, hrana de peleți obținută de la DBL Co (Chungbuk, Coreea) a fost pusă la capătul fiecărui braț și fiecare gerbil a fost plasat pe platforma centrală. După aceea, gerbilul a căutat hrana.

După operația simulată sau tFI, testul real a fost efectuat o dată pe zi timp de patru zile începând cu o zi după operație.

Pentru analiză, a fost evaluat numărul de erori, o eroare apărând de fiecare dată când gerbilul a intrat într-un braț care a fost deja vizitat anterior. Testul a fost terminat când gerbilul a consumat hrana.

4.4.2. PAT

Pentru a compara memoria pe termen scurt între grupuri, PAT a fost realizat conform metodelor raportate anterior [64,65] cu unele modificări. Pe scurt, gerbilii au fost testați folosind Gemini Avoidance System (GEM 392) de la San Diego Instruments (SanDiego, CA, SUA), care constă din două compartimente (întunecate și deschise) care comunică între ele printr-o poartă glisantă verticală.

Sesiunile experimentale s-au desfășurat în două faze: o sesiune de antrenament și o sesiune de test real efectuată cu o zi înainte și la patru zile după operația tFI sau simulată.

Testul real a fost efectuat la 20 de minute după ședința de antrenament prin măsurarea timpului de latență (secunde) în timpul șederii în camera întunecată. Și anume, în ședința de antrenament, gerbilului i s-a permis să exploreze liber cele două compartimente timp de un minut în timp ce poarta era deschisă. .

După aceea, când gerbilul a intrat în compartimentul întunecat, ușa a fost închisă și gerbilul a primit un șoc electric pentru picior (0,5 mA) de la o rețea de oțel pe podea timp de cinci secunde.

În sesiunea de test real, în ziua 4 după tFI, gerbilul a fost plasat în compartimentul de lumină și a fost înregistrat timpul de latență în compartimentul de lumină înainte de a intra în compartimentul întunecat.

4.5. Analiza Western Blot pentru TRPV1 și TRPV4

Pentru a examina nivelurile de expresie ale TRPV1 și TRPV4 în hipocampul de gerbil CA1, tehnica Western blot a fost efectuată conform metodelor descrise anterior [66,67].

Pe scurt, conform programului desemnat (30 min, 12 ore, 1 zi, 2 zile și 4 zile după operația simulată sau tFI), gerbililor (n=5 pentru fiecare grup) li sa administrat anestezie pentru eutanasie prin injecție intraperitoneală cu 200 mg/kg pentobarbital sodiu (JW Pharm.Co., Ltd., Seul, Coreea).

Thereafter, their brains were harvested and homogenized with50 mM phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) containing 0.1 mM ethylene glycol-bis ( aminoethyl ether)-N, N, N{{ 11}}, acid N0-tetraacetic (EGTA) (pH 8.0), acid etilendiaminotetraacetic 1{0 mM (EDTA) (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{{17 }}, 15 mM sodium pyrophosphate, 100 mM -glycerophosphate, 2 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mMphenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and 1 mM dithiothreitol (DTT).

Apoi, probele au fost centrifugate și supernatanții au fost prelevați pentru a determina nivelurile de proteine ​​folosind un kit de analiză Micro BCA de la Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, SUA) cu albumină de ser bovin de la Pierce Chemical Co (Rockford, IL, SUA).

Alicote care includ 20 ug de proteină totală au fost fierte în tampon de încărcare, 150 mM Tris (pH 6,8) conţinând 6% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 3 mM DTT, 0,3% albastru de bromofenol şi 30% glicerol.

Probele au fost separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 10% SDS (PAGE). Apoi, gelurile au fost transferate pe membrane de nitroceluloză de la Pall Co (East Hills, NY, SUA) la 350 mA și 4 ◦ C timp de 90 de minute.

Pentru a bloca colorarea nespecifică, membranele au fost incubate în lapte degresat 5% timp de 60 de minute la temperatura camerei. După aceea, au fost imunoreactate cu fiecare anticorp primar: Rabbit Anti-Trpv1 (diluat 1: 1000) (ABCAM, Cambridge, Marea Britanie), Rabbit Anti-Trpv4 (diluat 1: 1000) (ABCAM) și Rabbit Anti - -}) actină (diluată 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) la 4°C timp de 7 ore.

Ulterior, au reacţionat cu IgG anti-iepure de măgar conjugat cu peroxidază de hrean (HRP) (diluat 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA) la temperatura camerei timp de 1 oră.

În cele din urmă, trusa de chemiluminiscență pe bază de aluminol de la Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, SUA) a fost utilizată pentru a îmbunătăți vizualizarea.

După cum s-a descris anterior [68], imunobloturile TRPV1 și TRPV4 au fost analizate utilizând software-ul Scion Image de la Scion Crop (Frederick, MD, SUA). Benzile au fost scanate și s-a efectuat analiza densitometrică. Nivelurile de proteine ​​au fost normalizate față de nivelul corespunzător de -actină.

4.6. Pregatirea Sectiunilor Histologice

Pentru examenele imunohistochimice și histopatologice, gerbilii (n=7 pentru fiecare grup) au fost sacrificați conform programului desemnat (30 min, 12 ore, 1 zi, 2 zile și 4 zile după operația tFI sau simulată).

După cum s-a descris anterior [34], gerbilii au fost profund anesteziați cu pentobarbital sodiu (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seul, Coreea). Sub anestezie, gerbilii au fost clătiți transcardial cu soluție salină tampon fosfat 0,1 M (pH 7,4) și fixați cu paraformaldehidă 4% (în tampon fosfat 0,1 M, pH 7,4).

Ulterior, creierul lor a fost obținut și post-fixat folosind același fixativ timp de șase ore. Ulterior, țesuturile creierului au fost tăiate (25 µm grosimea planurilor coronale) în acriostat (Leica, Wetzlar, Germania).

4.7. Colorare histochimică folosind CV

Pentru a examina deteriorarea morfologică și neuronală în hipocampul fiecărui grup, a fost efectuată colorarea cu violet de cresil (CV), așa cum am descris anterior [69]. Pe scurt, acetatul de violet de cresil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost dizolvat la 1,0% (g/v) în apă distilată și acid acetic glacial (0.28 %) a fost adăugat la această soluție. Secțiunile au fost colorate și montate cu balsam canadian (Kanto, Tokyo, Japonia).

4.8. FJ B Colorare

Colorația FJ B a fost efectuată pentru a examina degenerarea neuronală (moarte sau pierdere). Conform procedurii publicate [34], secțiunile de creier pregătite au fost înmuiate în hidroxid de sodiu 1%, transferate imediat în 0.{06% permanganat de potasiu și au reacţionat prompt cu 0,0004% Fluor-Jade B (Histochem). , Jefferson, AR, SUA).

Secțiunile s -au spălat și s -au spălat și s -au pus pe un cald. 70].

Pe scurt, imaginile digitale ale celulelor FJ B + au fost capturate din cinci secțiuni per gerbil folosind un microscop epifluorescent (Carl Zeiss) (Oberkochen, Germania) la o lungime de undă de 450-490 nm. Celulele au fost numărate în 250 µm2, care a inclus SP, în centrul regiunii CA1 folosind un sistem de analiză a imaginii (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, SUA).

4.9. Imunohistochimie

Pentru a investiga modificările imunoreactivității NeuN, TRPV1 și TRPV4 în regiunea CA1, a fost efectuată imunohistochimia generală. Pe scurt, conform unei metode publicate [34], secțiunile de creier preparate au fost incubate cu anticorpi primari - șoarece anti-NeuN (diluat, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, SUA), șoarece anti-TRPV1 (diluat, 1:500) (Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și iepure anti-TRPV4 (diluat, 1:500) (Abcam, Cambridge, Marea Britanie).

Ulterior, aceste secțiuni incubate au fost incubate în anticorpii secundari corespunzători (diluați, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, SUA) și dezvoltate folosind Vectastain ABC (diluat, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) , STATELE UNITE ALE AMERICII). În cele din urmă, aceste secțiuni imunoreacționate au avut culoare după vizualizare cu 3,3'-diaminobenzidină.

Numărul de celule NeuN+ a fost numărat după cum urmează. Imaginile digitale ale celulelor NeuN+ au fost capturate din cinci secțiuni per gerbil folosind un microscop cu lumină (AxioM1) (Carl Zeiss, Germania).

Celulele au fost numărate în același mod ca numărul de celule B+FJ. Pentru a evalua densitatea structurilor TRPV1+ și TRPV4+, zonele corespunzătoare din regiunea CA1 au fost utilizate în cinci secțiuni per animal. Imaginile structurilor TRPV1+ și TRPV4+au fost capturate folosind un microscop cu lumină AxioM1 (Carl Zeiss) (Germania).

Densitățile TRPV{{0}} și TRPV4+structurile au fost evaluate ca densitate optică relativă (ROD). În acest scop, imaginile au fost transformate la nivelul mediu de gri. ROD a fost prezentat ca procent folosind Adobe Photoshop (versiunea 8.0) și software-ul NIH Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

4.10. Analiza Statistică

Am prezentat datele ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). Toate analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul GraphPad Prism (versiunea 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, SUA). Diferențele în mijloacele grupurilor experimentale au fost analizate statistic prin analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) cu un test de comparație multiplă post Hocbonferroni pentru a elucida diferențele legate de TFI între toate grupurile. Semnificația statistică au fost considerate la P <0. 05.

Contribuții autor: Conceptualizare: M.-HW și T.-KL; Metodologie, J.-CL și DWK;Software, H.-IK și MCS; Validare, JHA, IJK și JHP; Investigație, J.-CL, H.-IK și M.CS; Data Curation, JHC, IJK și JHP; Writing-Original Draft Preparation, H.-IK și J.-CL; Scriere-Revizuire și Editare, M.-HW; Supraveghere, S.-SL; Administrare Proiect, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL și T.-KL Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțare: Această lucrare a fost susținută de Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (PATRU, 4220200913807) finanțat de Fundația Națională de Cercetare (NRF) din Coreea și de Programul de Cercetare în Știință de bază prin Fundația Națională de Cercetare din Coreea (NRF) finanțat de Ministerul Educației (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Declarația Comisiei de revizuire instituțională: gerbilii au fost crescuți în Centrul pentru animale experimentale de la Universitatea Națională Kangwon (Chuncheon, Coreea). Pentru acest studiu, protocolul experimental a fost aprobat (nr. de aprobare, KW-200113-1; data aprobării, 18 februarie 2020) de către Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor.

Protocolul de cercetare a aderat la liniile directoare sugerate în „Legile și politicile internaționale actuale” din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de The National Academies Press (ed. a 8-a, 2011).

Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.

Declarația de disponibilitate a datelor: Datele prezentate în acest studiu sunt disponibile la cerere de la autorul corespunzător.

Mulțumiri: Autorii îi apreciază pe Hyun Sook Kim și Seung Uk Lee pentru ajutorul lor tehnic în acest studiu.

Conflicte de interese: Autorii au declarat că nu există niciun conflict de interese financiar.

Abrevieri

CA1: subdomeniul Cornu Ammonis 1; SNC, sistemul nervos central; CV, violet de cresil; DG, gyrus dentat;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hipotermie; NeuN, nuclei neuronali; OXC, oxcarbazepină; PAT, test de evitare pasivă; ROD, densitate optică relativă; SMA, activitate motorie spontană; SO, stratum oriens;SP, strat piramidal; SR, stratum radiatum; tFI, ischemie tranzitorie a creierului anterior; TRPV1, potențialul tranzitoriu de tip Vanilloid tip 1.

Referințe

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MEA; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Diferențele mici în temperatura intraischemică a creierului determină în mod critic amploarea leziunii neuronale ischemice. J. Cereb. Fluxul de sânge Metab. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hipotermia ca potențial tratament pentru ischemia cerebrală. Cerebrovasc. Metab creier. Rev. 1993, 5.277–300.

3. Asistenta, S.; Corbett, D. Neuroprotecție după câteva zile de hipotermie ușoară indusă de medicamente. J. Cereb. Fluxul de sânge Metab. 1996, 16.474–480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Actualizarea recomandărilor preclinice de la masa rotundă a industriei academice pentru terapia accident vascular cerebral. Stroke 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Hipotermia terapeutică: mecanisme neuroprotective. Faţă. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Hipotermie terapeutică pentru accidentul vascular cerebral acut. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Hipotermia terapeutică în AVC acut. J. Neurosci. Asistente medicale. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Hipotermia terapeutică în accidentul vascular cerebral ischemic acut. Neurochirurgie. Focus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Fezabilitatea și siguranța hipotermiei moderate după infarctul emisferic masiv. AVC 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Hipotermia reglementată reduce stresul oxidativ al creierului după ischemia hipoxică. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Hipotermia farmacologică: un potențial pentru terapia viitoare a AVC? Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Efectele neuroprotective ale hipotermiei terapeutice induse de medicamente în bolile sistemului nervos central. Curr. Obiectivele de droguri 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Medicamente antiepileptice ca o posibilă strategie neuroprotectoare ischemie cerebrală. Ann. Neurol. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS medicamente anti-epileptice în leziuni cerebrale traumatice pediatrice. Expert Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com