Identificarea și analiza funcțională a unei bifavone ca un nou inhibitor al proceselor aterogene cu potențial vaniloid 4-dependent de receptori tranzitori

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru a afla mai multe

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Ateroscleroza, o boală inflamatorie progresivă a arterelor mari, constituie cel mai important contributor la povara crescândă a mortalității și morbidității asociate bolilor cardiovasculare la nivel global1. Evenimentul de inițiere pivot care duce la ateroscleroză implică reținerea particulelor modificate de lipoproteine ​​cu densitate joasă (oxLDL) în spațiile intimale aortice subendoteliale, în primul rând în punctele de ramificație arterială2. În timpul aterogenezei timpurii, în urma disfuncției endoteliale, monocitele sanguine circulante transmigrează în zonele intime și se diferențiază în macrofage tisulare3. În spațiile intimale aortice, legarea și absorbția oxLDL de către macrofage asistate de receptori scavenger precum SRA și CD36 creează o buclă atero-inflamatoare de feedforward care are ca rezultat dezvoltarea celulelor spumoase încărcate cu lipide, un proces critic în ateroscleroză2-8. Cascadele de evenimente inflamatorii provocate de celulele spumoase duc la formarea unei strie adipoase precoce și în cele din urmă la apariția leziunilor avansate de ateroscleroză caracterizate prin prezența calotei fibroase, țesut calcificat, celule imune, proteine ​​matrice și lipide2–10. Potențialul de receptor tranzitoriu Vaniloid 4 (TRPV4) al subfamiliei TRPV, un canal cationic polimodal neselectiv, permeabil la Ca2 plus, este exprimat omniprezent în diferite tipuri de celule, inclusiv macrofage11–24. Cunoscut anterior ca un osmosenzor, TRPV4 este acum cunoscut că răspunde la stimuli biochimici și biomecanici diferiți, inclusiv căldură, rigiditatea matricei, osmolaritatea, factorii de creștere, pH-ul și 4 esteri de forbol11-24. TRPV4 este raportat că mediază mai multe funcții fiziologice, cum ar fi senzația de durere în inflamație și neuropatii18,22,23, diferențierea și migrarea miofibroblastelor 17,25,26 și diferențierea osteoclastelor în os27. Mutațiile TRPV4 au fost asociate cu mai multe canalopatii28–31. Studii recente ale grupului nostru și al altora au implicat un posibil rol al acestui canal în nenumărate condiții patologice, cum ar fi leziuni pulmonare22,32, formarea celulelor de spumă14,16, fbroza tisulară17,33, răspunsul la corp străin13 și cancer34,35. Anterior, a fost demonstrat un rol ateroprotector al TRPV4, în care funcția TRPV4 indusă de agonist chimic în celulele endoteliale s-a dovedit a fi asociată cu activarea eNOS și inhibarea aderenței monocitelor la celulele endoteliale36. În schimb, deficiențele în funcțiile TRPV4 au fost legate de numeroase răspunsuri ateroinfamatorii, inclusiv disfuncția endotelială, generarea redusă de celule de spumă de macrofage și boli vasculare14,16,37-39. Laboratorul nostru a identificat recent un rol proaterogenic al TRPV4 prin care reglează formarea celulelor de spumă macrofage indusă de oxLDL. Din punct de vedere mecanic, am arătat că TRPV4 afectează absorbția, dar nu legarea oxLDL în macrofage într-un mod independent de CD36-14. Într-un alt studiu, am raportat o exacerbare dependentă de TRPV4-a formării celulelor de spumă indusă de oxLDL în prezența lipopolizaharidei și creșterea rigidității matricei, oferind astfel o legătură între mecanosensing și riscul de ateroscleroză16. Considerate împreună, aceste descoperiri sugerează TRPV4 ca o țintă atractivă în ateroscleroză și alte boli, stimulând astfel descoperirea inhibitorilor cu molecule mici ai TRPV4 care pot fi traduși în terapii eficiente clinic. Utilizările compușilor naturali în terapie au câștigat importanță, în primul rând conduse de nevoia de compuși rentabili și biocompatibili în comparație cu medicamentele sintetice existente în prezent. Compuși naturali precumflavonoide, alcaloizi,polifenoliși curcuminoizii, afectează bolile cardiovasculare prin diverse mecanisme, cum ar fi inhibareaproinflamatorsemnale, sensibilizarea la insulină și îmbunătățirea profilurilor lipidelor din sânge prin țintirea căilor AMPK, COX1/2, eNOS și Nrf240-45. Studii recente efectuate de mai multe grupuri au identificat două flavonoide, berberina și apigenina, ca potențiali modulatori ai activității TRPV446,47. Am dezvoltat și folosit o metodă de screening cu randament semi-înalt pentru a identifica potențialii antagoniști ai TRPV4 dintr-o bibliotecă de compuși naturali, utilizând un test de aflux de Ca2 plus pe bază de Cititor de plăci de imagistică fluorometrică (FLIPR). Aici, raportăm identificarea și analiza funcțională a Linkedin, o flavonă, ca un nou inhibitor al proceselor aterogenice dependente de TRPV4-la macrofage, punând astfel o bază pentru studii ulterioare ale acestui compus natural ca un mic anti-aterosclerotic natural. compus molecul. S-a raportat că Linkedin are efecte neuroprotective,anticancerigen, șiantiinflamatorroluri48,49. Raportăm mecanismul de acțiune al Linkedinului împotriva TRPV4 în stabilirea formării celulelor de spumă de macrofage folosind numeroase teste biochimice și celulare.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Materiale și metode Cultură animală și celulară

Am achiziționat șoareci congenici C57BL/6 de tip sălbatic (WT) de la Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, SUA). Îndrumările Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Maryland au fost respectate pentru toate experimentele pe animale, iar autorii au respectat ghidurile ARRIVE. Pentru izolarea macrofagelor rezidente murine (MRM) induse de tioglicolat, lavajul peritoneal a fost colectat după 4 zile de injectare intraperitoneală cu tioglicolat, iar celulele au fost menținute în ser fetal bovin (FBS) care conține DMEM7,14,16. O linie celulară de macrofage murine (RAW264.7) și fibroblaste dermice umane (HDF) au fost achiziționate de la ATCC (Manassas, VA) și au fost cultivate, respectiv, cu DMEM sau MEM (Gibco, Waltham, MA). Macrofagele derivate din măduva osoasă murine (BMDM) au fost recoltate de la șoareci de 6- până la 7-săptămâni, așa cum s-a descris anterior14,50,51. Pe scurt, femurii de la șoareci WT și TRPV4 KO au fost colectați și măduva osoasă a femurului a fost spălată cu mediu DMEM complet cu 10% FBS. Celulele de măduvă osoasă suspendate au fost filtrate printr-o sită de 70 µm (BD bioscience), centrifugate și menținute în mediu DMEM suplimentat cu M-CSF (25 ng/mL) timp de 7-8 zile la 37 de grade pentru a permite diferențierea în macrofage.

Reactivi

Linkedin și GSK1016790A (GSK101) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), iar trusa de analiză FLIPR Calcium 6 a fost obținută de la Molecular Device (Sunnyvale, CA). LDL nativ uman (VLDL) a fost achiziționat de la Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). Am incubat LDL cu 5 µM CuSO4 timp de 12 ore la 37 de grade pentru a prepara LDL oxidat cu cupru (oxLDL)7,14,16. Etichetat cu colorant fluorescent, DiI-oxLDL, a fost achiziționat de la Invitrogen (Carlsbad, CA) și MCSF de la R&D (Minneapolis, MN). Anticorpii pentru analiza FACS au fost: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 și TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Anticorpii secundari conjugați cu PE au fost de la R&D (Minneapolis, MN), iar controalele izotipului conjugați cu PE au fost de la BD (Franklin Lake, NJ). Pentru reacția cantitativă în lanț a polimerazei (qRT-PCR), am folosit kitul RNeasy de la QIAGEN (Redwood City, CA). Toți primerii au fost achiziționați de la Bio-Rad (Hercules, CA). Mediile de cultură celulară, produsele legate de cultura celulară și reactivii Western blot au fost obținute de la Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche pentru anti-oboseala

Screening cu randament semi-înalt

Am efectuat o screening semi-înaltă pentru antagoniştii Trpv4 dintr-o bibliotecă de 2000 de compuşi naturali (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) utilizând un test de aflux de calciu pe bază de cititor de plăci de imagistică fluorometrică (FLIPR)14,17. Am identificat ginkgetina (GGT), ca un nou antagonist al TRPV4. Screening-ul primar și secundar a fost efectuat cu RAW264.7, HDF și BMDM-uri pentru a evalua capacitatea Linkedin și a altor candidați de a inhiba Ca2 produs de TRPV4-plus infux14,17. Ca martori, am folosit A23187, un ionofor de calciu, BMDM nul TRPV4 și GSK219, un antagonist selectiv TRPV417. După screeningul secundar, am identificat șase compuși care prezintă o inhibare mai mare de trei ori a Ca2 mediat de TRPV4-plus influxul în comparație cu controlul vehiculului. Linkedin a fost identificat ca fiind cel mai puternic inhibitor al activității TRPV4. BMDM-urile (5 × 104 celule/godeu) au fost însămânțate în plăci acoperite cu colagen (10 ug/ml) 96-fond bine limpezi și incubate la 37 de grade, 5% CO2. În ziua experimentului, celulele au fost încărcate cu colorant de calciu 6 în HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecid și incubate timp de 45 de minute la 37 de grade. După incubare, compușii din bibliotecă au fost adăugați în fiecare godeu până la o concentrație finală de 2 pM. Plăcile au fost incubate încă 45 de minute la 37 de grade. Influxul de Ca2 plus a fost indus prin adăugarea a 10 nM de agonist TRPV4 GSK1016790A în celulele pretratate cu vehicul sau compus și înregistrat prin măsurarea ΔF/F (Max-Min), așa cum s-a descris anterior17. Datele sunt afișate ca unități de fluorescență relativă (RFU).

Imunobloturi

Macrofagele peritoneale provocate de tioglicolat au fost însămânțate în 10% FBS care conține DMEM și incubate peste noapte. Celulele neaderate au fost spălate și 1% albumină serică bovină (BSA) care conține DMEM a fost adăugată pe placă și incubată timp de 3 ore înainte de tratamentul cu Linkedin. Pentru a determina expresia proteinelor CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 și GAPDH, lizate de celule întregi au fost preparate din celule tratate peste noapte cu Linkedin (1 și 5 uM) sau vehicul în prezența sau absența oxLDL (25 ug/ml). ). Pentru a determina nivelurile de expresie ale p-JNK și JNK declanșate de LPS, celulele au fost pretratate cu Linkedin (5 și 10 pM) timp de 3 ore și apoi stimulate cu LPS de E. coli timp de 30 de minute. Lizatele de celule întregi au fost preparate din celule spălate de două ori (PBS răcit cu gheața) utilizând tampon RIPA cu cocktail de inhibitor de protează adăugat (Thermo Scientific, MA). Petele au fost testate cu iepure anti-TRPV4 (Alomone Lab, Ierusalim, Israel), anti-șoarece CD36 (R&D, Minneapolis, MN), iepure anti-TLR4, iepure anti-TLR6, iepure anti-JNK și iepure anti-p- Anticorpi primari JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) urmați de anticorpi secundari conjugați cu HRP anti-iepure și anti-șoarece (R&D, Minneapolis, MN). Petele au fost îndepărtate și re-sondate cu IgG anti-GAPDH (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) pentru controlul încărcării.

Formarea celulelor de spumă.MRM declanșat de tioglicolat au fost însămânțate pe lamele de sticlă într-o placă cu 12 godeuri cu DMEM, 10% FBS și incubate la 37 de grade, 5% CO2 timp de 2 ore. S-a adăugat GGT (1 sau 10 pM) la celule, iar după 3 ore de incubare, s-a adăugat oxLDL (50 pg/ml), iar culturile au fost incubate peste noapte la 37 de grade. LDL nativ (50 ug/ml) a fost adăugat la godeurile grupului de control și incubat peste noapte. Celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% urmată de colorare cu Oil Red O pentru a cuantifica generarea de celule de spumă.

Transducția vectorului adenovirusului.Am colectat constructe de adenovirus pentru a exprima Ad(RGD)-șoarece TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) și vectorul martor de adenovirus, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), din Vector Biolabs, Malvern, PA. Am folosit 1 × 108 pfu/ml pentru toate experimentele. Pentru studiile de generare a celulelor de spumă, macrofagele peritoneale de șoarece au fost incubate cu Ade-TRPV4 sau Ade-Vec în mediu DMEM timp de 72 de ore înainte de adăugarea de oxLDL pentru a genera celule de spumă de macrofage.

Legarea și absorbția ox-LDL.Pentru a evalua legarea, macrofagele peritoneale au fost tratate cu două doze (1 sau 10 pM) de Linkedin sau vehicul timp de 3 ore și incubate cu Dil-oxLDL la 4 grade timp de o oră. După pre-tratamentul cu Linkedin sau vehicul, celulele au fost incubate cu Dil-oxLDL la 37 de grade timp de 30 de minute pentru a evalua absorbția. Imaginile au fost capturate prin microscopie cu fluorescență (63x), iar imaginea J a fost folosită pentru a cuantifica rezultatele.

Analiza citometriei în flux.Macrofagele peritoneale provocate de tioglicolat au fost cultivate în DMEM, 10% FBS timp de 24 de ore. Celulele neaderente au fost spălate, s-a adăugat mediu fără ser, iar celulele au fost incubate timp de 2 ore urmate de adăugarea a 5 pM GGT sau vehicul, iar incubarea a fost continuată timp de 3 ore. Celulele tratate au fost răzuite de pe placă și resuspendate în PBS, 2% BSA. Celulele au fost incubate cu anticorpi primari timp de 45 de minute urmate de incubare de 30 de minute cu anticorp secundar conjugat cu PE. Un citometru de flux FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Canada) a fost utilizat pentru a obține date. Toate datele au fost prelucrate folosind software-ul FlowJo.

qRT-PCR.Macrofagele induse de tioglicolat au fost tratate cu 5 uM Linkedin sau vehicul timp de 3 ore; S-au adăugat 25 pg/ml de oxLDL la vehicul sau celulele tratate cu Linkedin, iar incubarea a fost continuată peste noapte. RNeasy Micro Kit (nr. 74.004) de la QIAGEN a fost folosit pentru a extrage ARN-ul total, iar un Universal SYBR Green One-Step Kit de la Bio-Rad a fost folosit pentru a transcrie ARN-ul invers. A fost folosit un termociclor C1000 Touch (Bio-Rad) pentru a achiziționa date. Expresia unei gene a fost determinată ca cantitate de ARNm specific genei în raport cu ARNm GAPDH utilizând metoda CT comparativă descrisă în buletinul utilizatorului sistemului Bio-Rad qRT-PCR.

Analize statistice.Datele sunt prezentate ca medie ± SEM a triplicatelor biologice. S-a folosit software-ul GraphPad Prism 7.0, iar calculele au fost efectuate folosind testul t Student pentru două grupuri sau ANOVA unidirecțional pentru mai multe grupuri.

Aprobare etică.Toate experimentele pe șoareci au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor (IACUC) și au fost aprobate de Comitetul de revizuire al Universității Maryland-College Park.

Rezultate in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>triple; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figura 1. Identificarea bazată pe screening semi-înaltă a Linkedinului ca un nou inhibitor TRPV4 dintr-o bibliotecă de compuși naturali. (A) Diagramă care arată fluxul de lucru care a rezultat în identificarea ginkgetinei ca un potențial inhibitor TRPV4 dintr-o bibliotecă de 2000 de compuși naturali. (B) Înregistrare reprezentativă FlexStation 3 care arată efectul inhibitor al a 6 compuși naturali asupra Ca2 indus de agonistul TRPV4 (GSK1016790A) plus influxul în BMDM-uri încărcate cu colorant de calciu 6 în timpul screening-ului secundar. Pretratarea cu toți cei 6 compuși a arătat efecte inhibitoare asupra fluxului de Ca2 plus dependent de TRPV4-în comparație cu celulele pretratate cu vehicul (control negativ; vehicul plus GSK1016790A (10 nM)) sau ionofor de calciu (A23187, 2 μM). Am folosit antagonist selectiv TRPV4, GSK2193874 (10 nM), ca martor negativ. Toate experimentele au fost repetate de trei ori în patru exemplare. RFU: unitate de fluorescență relativă.

Inhibarea TRPV4 de către GGT abrogă formarea celulelor de spumă de macrofage indusă de oxLDL.Studiile noastre anterioare au arătat că TRPV4-ca2 plus influxul este implicat în formarea celulelor de spumă mediată de oxLDL 14,16. Prin urmare, am evaluat posibilitatea ca formarea celulelor de spumă să fie inhibată de antagonizarea mediată de GGT a activității TRPV4. Macrofagele peritoneale murine de tip sălbatic au fost incubate cu oxLDL pentru a induce formarea de celule de spumă în prezența sau absența GGT și analizate prin colorare Oil Red O. După cum era de așteptat, am constatat că generarea de celule de spumă a crescut de cinci ori în macrofagele tratate cu oxLDL în comparație cu LDL nativ (Fig. 2A, B). Cu toate acestea, tratamentul macrofagelor cu GGT (1 sau 10 pM) înainte de stimularea cu oxLDL a scăzut semnificativ procentul de celule de spumă (Fig. 2A, B). În mod colectiv, aceste descoperiri sugerează un efect inhibitor al GGT asupra formării celulelor spumei de macrofage, care vizează posibil ca TRPV4-a provocat influxul de Ca2 plus. În plus, am supraexprimat TRPV4 în macrofagele nule TRPV4 utilizând construcția de adenovirus și apoi am indus formarea de celule de spumă prin utilizarea oxLDL în prezența GGT. Am descoperit că supraexprimarea TRPV4 a crescut formarea de celule de spumă care a fost blocată atunci când am pretratat celula cu GGT, sugerând că inhibarea formării celulelor de spumă proaterogenă de către GGT este dependentă de TRPV4 (Fig. 2C, D).

GGT nu blochează nivelul bazal de exprimare al TRPV4 și al receptorilor inflamatori.Receptorul CD36 Scavenger joacă un rol major în absorbția și legarea oxLDL și formarea celulelor spumoase, procese critice în ateroscleroză4–7,54,55. Recent, un număr tot mai mare de dovezi sugerează implicarea receptorilor de tip toll în ateroscleroză2,4,56. Pentru a investiga dacă GGT a blocat formarea celulelor de spumă prin afectarea expresiei CD36, TLR4, TLR6 și TRPV4, am efectuat analiza imunoblot la două concentrații de GGT (1 sau 5 µM). Am găsit niveluri de expresie similare ale CD36, TRPV4, TLR6 și TLR4 în comparație cu controlul netratat (Fig. 3A-D). Analiza citometrică în flux nu a evidențiat, de asemenea, nicio diferență semnificativă în expresia suprafeței celulare a proteinelor cu sau fără tratament GGT (Fig. 3E-H, I-L). Luând în considerare toate împreună, aceste rezultate sugerează că GGT blochează formarea celulelor de spumă de macrofage fără a inhiba nivelurile bazale ale expresiei de suprafață ale TRPV4, CD36, TLR4 și TLR6.

Figura 2. Inhibarea TRPV4 de către Linkedin abrogă formarea celulelor de spumă de macrofage indusă de oxLDL. (A) Macrofagele peritoneale murine induse de tioglicolat au fost tratate peste noapte cu 50 ug/ml oxLDL, urmată de o preincubare de 3 ore cu vehicul sau 1 sau 10 uM Linkedin. Celulele au fost tratate cu 50 ug/mL LDL nativ (VLDL) ca martor. Mărire originală: 40x. (B) Cuantificarea rezultatelor este prezentată în (A). n=500 celule/condiție. testul t al elevului; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Absorbția oxLDL, dar nelegarea de macrofage este suprimată de GGT. Deoarece s-a demonstrat anterior că TRPV4 are un rol în absorbția oxLDL și în formarea celulelor de spumă14,16, am evaluat dacă tratamentul cu GGT a cauzat afectarea legării oxLDL pe suprafața macrofagelor. Macrofagele peritoneale WT au fost tratate cu GGT înainte de incubare cu Dil-oxLDL la 4 grade și a fost evaluată legarea. Rezultatele indică faptul că legarea oxLDL pe suprafața macrofagelor nu a fost împiedicată în mod semnificativ de tratamentul cu GGT (1 sau 10 pM) în comparație cu controlul vehiculului (Fig. 5A-C). După ce am stabilit că GGT nu inhibă legarea oxLDL, am urmărit în continuare să determinăm dacă absorbția oxLDL în macrofage a fost afectată de tratamentul cu GGT. Interesant, rezultatele noastre au indicat că a existat o inhibare semnificativă a absorbției oxLDL în macrofage în celulele pretratate cu GGT în comparație cu grupul tratat cu vehicul (Fig. 6A, B). Luând în considerare toate împreună, aceste rezultate sugerează că GGT blochează absorbția oxLDL, dar nu se leagă, în macrofage.

GGT blochează expresia TRPV4 indusă de oxLDL în macrofage.

Deoarece studiile noastre publicate anterior au arătat că TRPV4-ca2 plus a provocat joacă un rol în formarea celulelor de spumă de macrofage mediată de oxLDL14,16, am căutat să determinăm dacă GGT a blocat formarea celulelor de spumă prin suprimarea exprimării CD36 indusă de oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 sau TRPV4. Am descoperit că stimularea peste noapte a macrofagelor cu oxLDL a dus la o reglare semnificativă a exprimării proteinelor TRPV4 în comparație cu LDL, în timp ce expresia altor receptori (CD36, TLR2, TLR4 și TLR6) a rămas neschimbată (Figurile 4A-F). Pretratarea celulelor cu GGT înainte de stimularea cu oxLDL a scăzut selectiv nivelul de exprimare al proteinelor TRPV4 în comparație cu tratamentul cu vehicul (Fig. 4A-F). În mod colectiv, aceste descoperiri sugerează un efect inhibitor al GGT asupra expresiei proteinei TRPV4, care poate fi parțial implicată în suprimarea formării celulelor spumoase de către GGT.

Figura 3. Tratamentul cu Linkedin nu modifică proteina totală sau expresia de suprafață a TRPV4, CD36 și TLR în macrofage. (A-D) Imunobloturi ale lizatelor de celule întregi macrofage în urma tratamentului peste noapte cu 1 sau 5 µM Linkedin sau vehicul. Imunobloturile reprezentative arată expresia proteinei totale a CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) și TLR4 (D) în celulele tratate și netratate cu Linkedin. Au fost efectuate trei replici biologice independente și 3 repetări experimentale pentru fiecare set de experimente. (E-H) Analiza citometrică în flux a macrofagelor tratate peste noapte cu 5 µM Linkedin sau netratate care arată expresia de suprafață a TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) și TLR6 (G) în celulele netratate și tratate cu Linkedin. Au fost analizate trei replici biologice independente și 30,000 celule per condiție. (I–L) Analiza cantitativă a rezultatelor din (E–H). Analizat prin testul t cu două cozi cu un interval de încredere de 99%. Celulele numărate per experiment, 30,000; două repetări experimentale.

GGT blochează activarea proaterogenă a JNK2 și inflamația la macrofage. Rapoarte publicate din laboratorul nostru și alții au arătat că activarea JNK2 joacă un rol critic în formarea celulelor spumoase și ateroscleroză7,57. Pentru a determina dacă GGT ar putea inhiba activarea JNK1/2, macrofagele au fost tratate cu GGT urmată de stimulare cu LPS sau oxLDL. Rezultatele analizei imunoblot au arătat că tratamentul cu GGT a suprimat semnificativ fosforilarea indusă de oxLDL sau LPS a JNK1/2 în comparație cu controlul netratat sau tratat cu LDL nativ (Fig. 7A-D). S-a demonstrat că activarea JNK în macrofage induce transcripția mediatorilor proinflamatori asociați cu ateroscleroza58–60. Pentru a determina dacă GGT ar putea bloca expresia acestor regulatori proinflamatori în macrofage, celulele pretratate cu GGT au fost stimulate cu oxLDL, iar nivelurile de expresie a ARNm de TNF, IL6, IL12, IL1 și MCP1 au fost cuantificate prin analiza qRT-PCR. Am detectat o reducere semnificativă a nivelurilor de expresie induse de oxLDL ale ARNm de TNF, IL12, IL1 și MCP1 în celulele tratate cu GGT în comparație cu controalele tratate cu vehicul (Fig. 7E-I). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că GGT blochează activarea proaterogenă a JNK2 și expresia genei inflamatorii ca răspuns la stimularea oxLDL la macrofage. Discuții Compușii naturali, cum ar fi flavonoidele și polifenolii, sunt cunoscuți că modulează răspunsurile cardiovasculare prin diverse mecanisme, cum ar fi inhibarea semnalelor proinflamatorii, sensibilizarea la insulină, starea oxidativă și îmbunătățirea profilului lipidelor din sânge40-45. Aici, raportăm identificarea și caracterizarea funcțională bazată pe screening cu randament semi-înalt a Linkedin, o flavonă, ca un nou inhibitor al proceselor proterogenice/inflamatorii dependente de TRPV4-la macrofage. Am arătat în mod specific că i) ginkgetina blochează Ca2 mediat de TRPV4-plus influxul în macrofage, ii) blocarea ginkgetinei a funcției TRPV4 a scăzut semnificativ formarea celulelor spumoase induse de oxLDL prin suprimarea absorbției oxLDL în macrofage și iii) blocurile de ginkgetina. Fosforilarea JNK1/2 indusă de LPS și oxLDL, expresia proteinelor TRPV4 și expresia genei inflamatorii. În total, rezultatele studiului nostru au arătat că ginkgetina inhibă funcția macrofagelor proaterogenă/inflamatoare într-un mod dependent de TRPV4-. Ateroscleroza, o boală aortică, este alimentată inițial de inflamație și înghițirea macrofagelor cu oxLDL, inducând formarea de celule spumoase de macrofage, care progresează ulterior pentru a forma aterom2–10. Deoarece formarea celulelor de spumă este un proces critic în aterogeneză, înțelegerea și manipularea formării celulelor de spumă poate avea potențial terapeutic. Macrofagele sunt cunoscute că exprimă o serie de canale ionice și pompe care pătrund în membrană, inclusiv TRPV4, un Ca2 polimodal mecanosensibil plus canal ionic permeabil, care este activat atât de stimuli fizici, cât și biochimici11-24. Studiile publicate de laboratorul nostru și altele au identificat rolul TRPV4 în inflamația macrofagelor și formarea celulelor spumoase induse de oxLDL14–16,26. TRPV4 poate servi astfel ca o țintă viabilă pentru atenuarea proceselor proaterogene.

Figura 5. Linkedin nu suprimă legarea DiI-oxLDL de macrofage. Macrofagele au fost pretratate cu vehicul sau Linkedin (1 sau 10 uM) timp de 3 ore urmate de incubare cu oxLDL marcat cu Dil (2,5 ug/mL) timp de 1 oră la 4 grade. (A) Imagini microscopice de fluorescență reprezentative (mărire originală, 63 ×) ale legării DiI-oxLDL pe suprafața membranei macrofagelor (n=20 celule/condiție). (B) Rezultatele experimentului A prezentate ca profil grafic folosind software-ul NIH ImageJ. (C) Analiza cantitativă a rezultatelor din A. n=20 celule/condiție. în îmbunătățirea aterosclerozei prin reducerea MMP-2 și MMP{-9 și creșterea nivelurilor de NO și NOS în aorta toracică la șobolan52. În studiul de față, am arătat că ginkgetina blochează TRPV4-a provocat Ca2 plus influx în macrofage. Din punct de vedere mecanic, am arătat că ginkgetina blochează absorbția oxLDL, dar nu se leagă, în macrofage. Studiile efectuate in vivo și in vitro au sugerat un rol critic al CD36 ca principal receptor de captare în absorbția oxLDL și formarea celulelor spumei macrofage2-7. S-a demonstrat că șoarecii CD36 nul cărora le lipsește ApoE sau LDLR sunt mai puțin predispuși la dezvoltarea leziunilor aterosclerotice5,6. Studiile anterioare din grupul nostru au identificat un rol esențial al cascadei de semnalizare CD36-JNK în formarea celulelor spumei de macrofage7. Receptorii de tip Toll TLR2, TLR4 și TLR6 acționează ca coreceptori prin interacțiunea cu CD36 și s-a dovedit a fi implicați în aterogeneză2,56,63. Am examinat posibilitatea ca lipsa formării celulelor de spumă observată la macrofagele tratate cu Linkedin să se datoreze scăderii exprimării proteinelor CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 sau TLR6. Interesant, tratamentul cu Linkedin nu a scăzut semnificativ expresia proteinelor CD36, TLR2, TLR4 sau TLR6 la niveluri bazale sau în condiții stimulate cu oxLDL. Cu toate acestea, Linkedin a blocat în mod specific reglarea exprimării proteinelor TRPV4 indusă de oxLDL, în timp ce expresia sa la niveluri bazale a rămas neschimbată. Luând în considerare toate împreună, aceste rezultate sugerează că ginkgetina blochează formarea celulelor de spumă indusă de oxLDL printr-un mecanism independent de exprimarea CD36 și TLR, dar dependent de TRPV4. Studiile anterioare din grupul nostru și alții au arătat că activarea JNK2 este implicată în formarea celulelor spumoase și dezvoltarea leziunilor aterosclerotice7,57. De asemenea, sa raportat că JNK este implicată în modularea MMP-9 și MMP{-13, care sunt supraexprimate în leziunile aterosclerotice64–68. Având în vedere legătura recunoscută a JNK în procesele aterogene, am vrut să determinăm dacă ginkgetina ar putea inhiba activarea JNK. În conformitate cu rapoartele anterioare, rezultatele noastre au arătat, de asemenea, că ginkgetina blochează fosforilarea JNK2 indusă de stimuli inflamatori în macrofage. Acest rezultat sugerează un posibil mecanism prin care Linkedin blochează formarea celulelor de spumă. În plus, am găsit o reducere semnificativă a expresiei indusă de oxLDL a ARNm de TNF, IL12, IL1 și MCP1 în celulele tratate cu ginkgetin în comparație cu controlul vehiculului, evidențiind rolurile antiinflamatorii potențiale ale ginkgetinei ca răspuns la oxLDL. În rezumat, rezultatele noastre au arătat că ginkgetina inhibă funcția macrofagelor proaterogenă și inflamatorie într-un mod dependent de TRPV4-. Aceste constatări întăresc, astfel, rațiunea utilizării compușilor naturali în dezvoltarea potențialelor terapeutice și/sau reactivi chimiopreventivi.

Referințe
1. Barquera, S. et al. Prezentare globală a epidemiologiei bolii cardiovasculare aterosclerotice. Arc. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te cellular biology of macrophages in atherosclerosis. Celula 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Inflamație în ateroscleroză. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Citokine, metabolismul lipidelor macrofage și celulele spumoase: implicații pentru terapia bolilor cardiovasculare. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Perturbarea direcționată a receptorului CD36 scavenger clasa B protejează împotriva dezvoltării leziunilor aterosclerotice la șoareci. J. Clin. Investi. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV şi colab. Receptorii scavenger clasa AI/II și CD36 sunt principalii receptori responsabili pentru absorbția lipoproteinei modificate cu densitate joasă care duce la încărcarea lipidelor în macrofage. J. Biol. Chim. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO şi colab. O cascadă de semnalizare dependentă de CD36-este necesară pentru formarea celulelor de spumă de macrofage. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Ateroscleroza-o boală inflamatorie. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te mecanismele moleculare ale complicaţiilor trombotice ale aterosclerozei. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroscleroza. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD și colab. Activarea ultra-rapidă a canalelor ionice TRPV4 prin forțe mecanice aplicate integrinelor beta1 de suprafață celulară. Întreg. Biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. și Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ axa de semnalizare a mecanotransducției în tranziția epitelial-mezenchimală indusă de rigiditatea matricei și TGF 1-. Cell Mol. Bioing.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. și Rahaman, SO Vaniloidul 4 cu potențial de receptor tranzitoriu este necesar pentru răspunsul corpului străin și formarea celulelor gigantice. A.m. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. Canalul permeabil la calciu TRPV4 este un nou regulator al formării celulelor spumei de macrofage induse de LDL oxidate. Radic liber. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).