Identificarea genelor ceas legate de hipertensiunea în rinichi de la șobolani hipertensivi spontan
Feb 20, 2022
FUNDALExistă o variație diurnă a fluctuației tensiunii arteriale a hipertensiunii arteriale, iar anomalia fluctuației tensiunii arteriale este considerată a fi un factor de risc independent pentru afectarea organelor, inclusiv complicațiile cardiovasculare. În studiul actual, am încercat să identificăm moleculele responsabile pentru formarea ritmului circadian al tensiunii arteriale sub controlulrinichiceasul biologic în hipertensiune arterială.
METODE Analiza micromatricei ADN a fost efectuată înrinichide la 5-șobolani cu hipertensiune spontană (SHR)/Izm în vârstă de o săptămână, șobolani SHR predispuși la accidente vasculare cerebrale (SHRSP)/Izm și șobolani Wistar Kyoto (WKY)/Izm. Pentru a detecta variația, celulele epiteliale tubulare de șoarece (TCMK-1) au fost stimulate cu dexametazonă. Am efectuat imunocolorarea și analiza Western blot înrenalmedulara derinichide la 5-șobolani WKY și SHR de o săptămână.
REZULTATEAm extras 1.032 de gene cu E-box, o secvență de legare pentru BMAL1 și CLOCK utilizând o analiză de îmbogățire a seturilor de gene. Într-o analiză cu microarray, am identificat 12 gene crescute cu mai mult de 2-ori înrinichide SHR și SHRSP în comparație cu șobolanii WKY. Într-o analiză periodică de regresie, fosforibozil pirofosfat amidotransferaza (Ppat) și retardul mental X fragil, omologul autozomal 1 (Fxr1) a prezentat ritm circadian. Imunocitochimia a evidențiat pozitivitatea PPAT în nuclee și citoplasmă din tubuli și pozitivitate FXR1-în citoplasma TCMK-1. În 5-șobolan WKY și SHR vechi de o săptămânărinichi, PPAT a fost localizat în nucleul și citoplasma tubilor proximali și distali, iar FXR1 a fost localizat în citoplasma tubilor proximali și distali.
CONCLUZIIPPAT și FXR1 sunt molecule esențiale în controlul ritmului circadian al tensiunii arteriale de cătrerinichiîn hipertensiune arterială.
Cuvinte cheie:tensiune arteriala;; hipertensiune; rinichi; nefrotubulus; şobolan hipertensiv spontan
Diverse fenomene biologice, inclusiv ciclul de somn, ritmul cardiac și tensiunea arterială, au un ritm circadian. Pentru ritmul circadian a fost descoperită prezența ceasului biologic, apoi s-a stabilit că ritmul circadian există în toate organismele vii de la arhebacterii până la ființe umane. 1
Nucleul suprachiasmatic (SCN), care este considerat a funcționa ca un ceas central, este un centru care exercită oscilația autonomă a ritmului circadian. În plus, ceasurile interne prezente în organele periferice sunt controlate de ceasurile centrale și marchează ritmul potrivit pentru fiecare organ. 2 Ceasul central controlează ceasurile periferice prin factori neuronali și umorali. SCN constă dintr-un număr mare de neuroni care oscilează autonom, atunci când aceste celule au fost izolate și dispersate la șobolani și șoareci, au prezentat ritmuri circadiene cu diferențe ușoare în frecvența lor de declanșare și expresia genelor. Astfel, neuronii individuali din SCN sunt celule de ceas cu proprii lor oscilatori circadieni. 3
Recent, au fost clarificate mecanismele moleculare care stau la baza ritmului ceasurilor biologice. Ceasul biologic constă dintr-o buclă principală în care creierul și mușchii arnt-like 1 (BMAL1), ciclurile locomotorii circadiene kaput (CLOCK), Perioada (PER) și Cryptochrome (CRY) funcționează ca proteine de bază. CLOCK și BMAL1 formează un dimer pentru a acționa ca un factor de transcripție și se leagă la o secvență E-box (CACGTG). 4 Genele țintă includ alte gene de ceas, cum ar fi Per și Cry. Proteinele PER și CRY generate se translocă în nucleu și suprimă genele BMAL1 și CLOCK. Ulterior, PER și CRY sunt rezolvate în timp prin fosforilarea în mai multe etape de către cazein kinaza (CKIε), glicogen sintaza (GSK-3) și protein kinaza activată de AMP (AMPK). Astfel, suprimarea BMAL1 și CLOCK este anulată de PER și CRY, iar promovarea expresiei genei de către CLOCK și BMAL1 începe din nou, iar ceasul merge în jur. În plus față de această buclă principală, există, de asemenea, o subbucla care implică receptorul nuclear subfamilia 1, membrul 1 al grupului D (NR1D1), receptorul orfan legat de receptorul acidului retinoic (ROR), situl D al proteinei de legare a promotorului albuminei (DBP) și E4 proteina de legare a promotorului 4 (E4BP4). NR1D1 se leagă de secvența RRE (AGGTCA) și suprimă bucla principală prin feedback negativ, în timp ce DBP promovează bucla principală prin feedback pozitiv prin legarea la secvența D-box (TTATGTAA). 5 De asemenea, se raportează că proteinele care bifează ritmul circadian sub controlul ceasului biologic ajung la aproximativ 15 la sută în fiecare țesut. 6 Ceasul biologic este implicat în formarea ritmurilor circadiene ale diferitelor fenomene fiziologice.
Se știe că există o variație diurnă a fluctuației tensiunii arteriale a hipertensiunii arteriale, iar anomalia fluctuației tensiunii arteriale este considerată a fi un factor de risc independent pentru afectarea organelor, inclusiv complicațiile cardiovasculare. 7 Dereglarea ritmului circadian al tensiunii arteriale provoacă leziuni ale organelor. Există multe rapoarte despre relația dintre tensiunea arterială și ceasurile biologice, cum ar fi Per, Cry, Bmal1 și Clock. Scăderea tensiunii arteriale, pierderea fluctuației zilnice a tensiunii arteriale și leziuni ale celulelor endoteliale vasculare au fost raportate la șoarecii knockout Bmal1. 8 Șoarecii knockout au raportat că prezintă o excreție urinară crescută de sodiu, scăderea tensiunii arteriale și chiar o scădere a ritmului cardiac și scăderea amplitudinii circadiane a ritmului cardiac. 9 Dashti et al. au raportat că genele ceasului induc o proporție mare de variație fenotipică a tensiunii arteriale sistolice. 10
În ceea ce privește contribuțiarinichila ritmurile circadiene, normalrinichiau o excreție mai mare de electroliți și producție de urină în timpul zilei decât noaptea și există un ritm circadian în excreția de sodiu, potasiu și clor. 11 În hipertensiune arterială, insuficiența ritmului circadian al acestor funcții este raportată a fi asociată cu complicații cardiovasculare. 12 șoareci knockout per1 prezintă o excreție crescută de sodiu și o scădere a tensiunii arteriale în raport cu subunitatearenalcanal epitelial de sodiu (ENaC) în canalul colector alrinichi, indicând prezența unui ceas biologic înrinichi.13 În plus, la pacienții cu cronici se observă variații diurne ale tensiunii arteriale (starea fără capsă).boală de rinichi. 14 Astfel, ceasul central situat în SCN reglementeazărenalceas periferic, marcând momentul optim pentrurinichi.
S-a raportat că șobolanul spontan hipertensiv (SHR), un model genetic de hipertensiune arterială esențială, prezintă abateri ale ritmului cardiac și fluctuații diurne ale tensiunii arteriale, care sunt îmbunătățite de îmbătrânire. 15 Anterior, am investigat ceasul circadian al glandei suprarenale la șobolanii SHR și Wistar Kyoto (WKY) menținuți sub un ciclu lumină-întuneric de 12-oră și am constatat că SHR posedă un ceas circadian suprarenal anormal.
și arată ritmul circadian alterat al enzimei de limitare a vitezei de codificare a genei controlate de ceas în geneza steroizilor, precum și nivelul alterat al glucocorticoizilor seric. 16 În plus față de semnalul de la ceasul central SCN, se știe că glucocorticoidul eliberat de glanda suprarenală sincronizează ceasul circadian periferic în alt organ. 17 Stimularea cu dexametazonă poate reproduce fluctuația circadiană a genei ceasului și poate fi aplicabilă pentru studii in vitro. 18 În această circumstanță, este posibil ca SHR să aibă și ceasuri circadiene periferice anormale în diferite organe, inclusivrinichicare joacă un rol esențial în reglarea tensiunii arteriale. Cu toate acestea, ceasul circadian a intratrinichidin SHR nu a fost pe deplin înțeles.
În studiul actual, am încercat să identificăm genele ceas responsabile alerinichiîn hipertensiune arterială folosind SHR și șobolani SHR predispuși la accident vascular cerebral (SHRSP) și au evaluat rolurile genelor ceas implicate în reglarea ritmului circadian anormal al tensiunii arteriale.
METODE
Etica și animaleleInvestigația noastră a fost conformă cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de Institutul Național de Sănătate din SUA (publicația NIH nr. 85-23, 1996). Protocoalele de cercetare care implică utilizarea animalelor vii au fost evaluate de comitetul de etică al Școlii de Medicină a Universității Nihon (nr. 11-034). Șobolanii WKY/Izm și SHR/Izm menținuți la Disease Model Cooperative Research Association au fost achiziționați de la Japan SLC (Hamamatsu, Shizuoka, Japonia). Tensiunea arterială sistolică a fost măsurată prin metoda coadă-manșetă. În acest studiu, pentru a evita modificările secundare ale expresiei genelor prin creșterea tensiunii arteriale și pentru a identifica genele responsabile care afectează ritmurile circadiene și eventual asociază hipertensiunea arterială, am ales șobolani prehipertensivi 5-în vârstă de o săptămână.
Căutați gene cu E-box în întregul genom
Am folosit baza de date Molecular Signatures in Gene Set Enrichment Analysis (GSEA; Broad Institute, Boston, MA) pentru a căuta în grupul de gene ținte ale factorului de transcripție uman și am folosit baza de date cu cel mai mare număr de gene în amonte de gena punctului de pornire a transcripției A, în care E-box (CACGTG) a fost prezent la 2,000 bp în amonte.
Analiza microarray ADN
Rinichiau fost eliminați de la 5-șobolani SHR/Izm, SHRSP/Izm și WKY/Izm vechi de o săptămână la 12:00. Cel rezecatrinichia fost omogenizat cu un standard TaKaRa BioMasher (Takara, Otsu, Shiga, Japonia) și a fost extras ARN total. După hibridizare și scanare, cuantificarea a fost efectuată cu Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Expresia genei a fost comparată și examinată. Genele a căror expresie fluctuează între tulpini au fost extrase cu un prag de mai mult de 2-ori sau mai mic de 0.5-ori.
Detectarea variației genelor candidate în celulele TCMK-1
Celulele epiteliale tubulare de șoarece (TCMK{{0}}) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) au fost stimulate cu 0,5 µmol/l dexametazonă așa cum este descris
anterior. 18 Mediul a fost schimbat cu Mediu Eagle modificat de la Dulbecco fără ser. ARN-ul total a fost extras la fiecare 4 ore după stimularea cu dexametazonă, iar abundența ARNm-urilor Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat și Tef a fost cuantificată folosind reacția în lanț a polimerazei în timp real. În același pas, reacția în lanț a polimerazei în timp real a fost efectuată pe ARN-ul gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și utilizată ca standard intern. Primerii utilizați sunt enumerați în Tabelul suplimentar S1 online. Periodicitatea fluctuației ARNm după stimularea cu dexametazonă a celulelor TCMK-1 a fost analizată printr-o analiză de regresie multivariată care a determinat curba ochiurilor (MESS), amplitudinea (AMP), faza (TZ1) prin optimizarea curbei cosinus folosind metoda celor mai mici pătrate Estimări ale MESS, AMP și TZ1; intervalele lor de încredere de 95 la sută au fost calculate folosind metoda coincidenței unice.
Colorarea imunofluorescentă a celulelor TCMK-1Celulele TCMK-1 au fost fixate cu 4% paraformaldehidă. După spălarea cu soluție salină tamponată cu fosfat, celulele au fost incubate cu anticorp monoclonal anti-PPAT de iepure
(Sigma-Aldrich) diluat de 250 de ori și anticorpul monoclonal anti-FXR1 de iepure (Abcam, Cambridge, UK) diluat de 300 de ori la temperatura camerei timp de 1 oră. O diluție de 1,000-ori a Alexa Fluor 488 anti-iepure IgG (Invitrogen), ca anticorp secundar, a fost făcută să reacționeze la întuneric timp de 1 oră.
Imunocolorarea în rinichi de la șobolani WKY și SHRTherenalmedular alrinichide la 5-șobolani WKY/Izm de o săptămână și SHR/Izm a fost izolat și încorporat în parafină și incubat cu anticorp monoclonal anti-PPAT de iepure diluat de 250 de ori și anticorp monoclonal anti-FXR1 de iepure diluat de 200 de ori. Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japonia) a fost aplicat ca anticorp secundar. Feliile au fost deshidratate, curățate, sigilate cu marinol și observate la microscop optic.
Western blotting pentru proteinele FXR1 și PPAT în rinichi de la șobolani WKY și SHRTherenalmedulara a fost supusă extracției de proteine folosind tampon de testare de radio-imunoprecipitare (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia). Feliile au fost transferate pe o membrană de poliviniliden difluorură cu iblot (Invitrogen) și blocate cu soluție de lapte degresat 5% timp de 1 oră. S-au aplicat anticorpii primari, care au fost anticorp monoclonal anti-FXR1 de iepure și anticorp monoclonal anti-PPAT de iepure. IgG antiiepure de capră conjugat cu peroxidază de hrean (Jackson ImmuneReseach, West Grove, PA) a fost utilizat ca anticorp secundar. GAPDH a fost folosit ca standarde interne.
analize statisticeValorile au fost raportate ca medie ± SE. Testul t al lui Student a fost utilizat pentru analiza datelor nepereche. De asemenea, a fost utilizată o analiză 2-modală a varianței cu procedura Bonferroni/Dunn ca post-test. valorile P ale<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">
REZULTATE
Tensiune arterialaTensiunea arterială sistolică la șobolani WKY/Izm de {{{0}}săptămâni, șobolani SHR/Izm și șobolani SHRSP/Izm a fost de 116 ± 3,0 (n=6), 121 ± 3,3 (n=6), respectiv 125 ± 3,4 (n=5) mm Hg. Tensiunea arterială sistolică nu a diferit între cele 3 tulpini într-o măsură semnificativă statistic.
Căutați gene cu E-box în promotor prin analiza GSEAAm căutat gene care poartă secvența de legare a E-box (CACGTG) a heterodimerului CLOCK și BMAL1 în întregul genom. Ca rezultat, au fost identificate 1.032 de gene care poartă o cutie E între 2, 000 bp în amonte sau în aval de punctul de inițiere a transcripției (Tabelul suplimentar S2 online).
Comparație a expresiei genelor în rinichi de la șobolani WKY, SHR și SHRSP prin analiza microarray ADNAm comparat expresia genelor înrinichide la 5-șobolani WKY/Izm în vârstă de o săptămână și șobolani SHR/Izm folosind micromatrice ADN. Trei sute șaizeci și trei de gene au fost foarte exprimate (mai mult de 2-ori) înrenalcortexul șobolanilor SHR/Izm în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Nivelurile de expresie a 281 de gene dinrinichiau fost mai mult de 0.5-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Înrenalmedulara de șobolani SHR/Izm, 284 de gene au prezentat niveluri de expresie mai ridicate și 203 gene
au arătat niveluri de expresie mai scăzute în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Înrenalcortexul șobolanilor SHRSP/Izm, nivelurile de expresie a 267 de gene au fost de 2-ori mai mari în comparație cu cele la șobolanii WKY/Izm. Nivelurile de expresie a 580 gene au fost mai mici de 0.5-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Înrenalmedulara SHRSP/Izm, 639 de gene au prezentat niveluri de expresie mai ridicate și 251 de gene au prezentat niveluri de expresie mai scăzute în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Dintre 1.032 de gene cu o cutie E, nivelul de expresie al ARNm-urilor a 17 gene a fost de mai mult de 2-ori înrenalcortexul șobolanilor SHR/Izm în comparație cu
Figura 2. Variația expresiei ARNm-urilor genei candidate în celulele TCMK-1 după stimularea cu dexametazonă. Celulele TCMK-1 au fost stimulate cu 0,5 µmol/l dexametazonă timp de 2 ore. ARN-ul total a fost extras la fiecare 4 ore după stimularea cu dexametazonă, iar abundența ARNm-urilor Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat și Tef a fost evaluată prin reacția în lanț a polimerazei în timp real. Expresia relativă a genei a fost analizată prin comparație cu ARNm GAPDH. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n=6).
Șobolani WKY/Izm. Printre aceste 17 gene, expresia a 4 gene (Bcl6, Nr1d1, Ppat și Tef) a fost crescută de mai mult de 2-ori înrenalcortexul șobolanilor SHRSP/Izm în comparație cu șobolanii WKY/Izm (Tabelul 1). Înrenalcortexul șobolanilor SHR/Izm, a fost detectată expresia ARNm a 10 gene, care au fost reduse la mai puțin de 0,5-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm; 8 dintre aceste gene (Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1,
Plbd1, Tbl1x și Trim46) au fost, de asemenea, reduse cu mai puțin de 0.5-ori înrenalcortexul șobolanilor SHRSP/Izm (Tabelul 1). Expresia ARNm a 10 gene înrenalmedulara de la șobolanii SHR/Izm a fost crescută de mai mult de 2-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Printre aceste 10 gene, expresia ARNm Nr1d1 și Tef înrenalmedulara de la șobolanii SHRSP/Izm a fost crescută de mai mult de 2-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm (Tabelul 1). Expresia ARNm a receptorului de transferină (Tfrc) înrenalmedulara la șobolanii SHR/Izm a fost mai mică de 0.5-ori în comparație cu șobolanii WKY/Izm. Cu toate acestea, expresia ARNm Tfrc a fost crescută înrenalmedulara șobolanilor SHRSP/Izm (Tabelul 1).
Inducerea mARN-urilor genei ceas în celulele nefrotubulareFigura 1 arată variația expresiei ARNm Per1, Bmal1, Nr1d1 și Cry1 după adăugarea dexametazonei în celulele TCMK-1. Amplitudinile expresiei ARNm Per1, Bmal1 și Nr1d1 au prezentat vârfuri la 28 și 44 de ore după 4 ore de stimulare cu dexametazonă. Amplitudinea expresiei ARNm Cry1 a arătat vârfuri la 4, 28 și 44 de ore după 4 ore de stimulare cu dexametazonă. Astfel, stimularea cu dexametazonă a indus fluctuația expresiei ARNm a genei ceasului în TCMK-1 (Figurile 1 și 2).
stimularea cu dexametazonă. Expresia ARNm a Ppat a atins vârful la 28 de ore după stimularea cu dexametazonă și apoi a crescut din nou la 44 de ore. Hnrnpa3 a prezentat vârfuri la 16, 28 și 44 de ore și a prezentat amplitudini relativ similare cu Per1. Npm1 a arătat un vârf la 28 de ore, similar cu Per1. Fxr1 a arătat un vârf la 24 și 44 de ore (Figura 2). Am efectuat o analiză periodică de regresie pentru a evalua semnificația statistică a acestor variații. Analiza a indicat că variația expresiei ARNm Cry1 și Bmal1 a arătat o periodicitate semnificativă (P <0.{05) după="" încărcarea="" dexametazonei="" în="" celulele="" tcmk{-1="" (figura="" suplimentară="" s1="" și="" tabelul="" s3)="" pe="" net).="" rezultatele="" analizei="" de="" regresie="" periodică="" a="" 7="" gene="" sunt="" prezentate="" în="" figura="" suplimentară="" s2="" și="" tabelul="" s3="" online.="" analiza="" a="" indicat="" că="" fxr1="" și="" ppat="" au="" prezentat="" o="" regresie="" semnificativă="" (p="">< 0,05).="" în="" regresia="" lui="" fxr1,="" atât="" perioada="" cât="" și="" amplitudinea="" au="" prezentat="" unde="" mari,="" în="" timp="" ce="" în="" ppat,="" atât="" perioada,="" cât="" și="" amplitudinea="" au="" fost="" mici="" și="" au="" prezentat="" ritm="">
Imunocolorarea PPAT și FXR1 în celulele nefrotubulare și în rinichi de la șobolani WKY și SHRPPAT a fost localizat atât în citoplasmă, cât și în nucleu. FXR1 a fost localizat doar în citoplasma celulelor TCMK-1 (Figura 3). PPAT a fost colorat atât în nuclee, cât și în citoplasmă în tubii proximali și distali (Figura 4). FXR1 a fost colorat în principal în citoplasma tubilor proximali și distali (Figura 4). Nu au existat diferențe aparente în colorarea sau localizarea în rinichii șobolanilor WKY și SHR.
Expresia proteinei FXR1 și PPAT în rinichi de la șobolani WKY și SHRFigura 5 prezintă western blotting a proteinelor FXR1 și PPAT înrenalmedular de la șobolani WKY și SHR în vârstă de 5-săptămâni. Abundența proteinei FXR1 a fost înrenalmedulara șobolanilor SHR a fost semnificativ mai mică în comparație cu șobolanii WKY (P < 0.05).="" expresia="" proteinei="" ppat="">renalmedularul șobolanilor WKY și SHR nu diferă într-o măsură semnificativă din punct de vedere statistic.
DISCUŢIEHipertensiunea arteriala induce cardiovascular sirenalcomplicații, cum ar fi croniceboală de rinichi(CKD). Se știe că pacienții cu CKD dezvoltă anomalii ale fluctuației tensiunii arteriale, ceea ce sugerează cărinichipoate fi implicat în ritmurile circadiene anormale ale tensiunii arteriale în hipertensiune arterială. 19 Prin urmare, în studiul actual, ne-am propus să identificăm moleculele responsabile pentru formarea ritmului circadian al tensiunii arteriale sub controlul ceasului biologic alrinichiîn hipertensiune arterială. Am obținut 1,032 de gene candidate care poartă secvența E-box din baza de date GSEA. Deoarece heterodimerul BMAL1/CLOCK leagă E-box pentru a regla transcripția genei în aval, aceste gene sunt considerate a fi controlate de un ceas biologic circadian. Pentru a identifica moleculele implicate în ritmul circadian al tensiunii arteriale în rinichi, am investigat cuprinzător expresia genelor în rinichi de la șobolani SHR, SHRSP și WKY folosind o micromatrice ADN. Dintre cele 1.032 de gene, am selectat transcrieri care au crescut de mai mult de 2-ori sau au scăzut de mai puțin de 0.5-ori.
în SHRrinichicomparativ cu cele ale șobolanilor WKY. Ne-am concentrat apoi asupra genelor care au prezentat tendințe similare înrinichia SHRSP, în special, Bcl6, Nr1d1, Ppat, Tef, Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1, Plbd1, Tbl1x și Trim46. Aceste 12 gene care poartă secvența E-box, care au prezentat niveluri de expresie mai mari sau mai scăzute la ambii șobolani model hipertensivi (SHR și SHRSP) în comparație cu șobolanii WKY normotensivi, sunt posibil asociate cu ritmul circadian al tensiunii arteriale. Printre aceste gene, Nr1d1 numită și virusul eritroblastozei inverse (Rev-erb), s-a raportat că formează o subbuclă a ceasului biologic. 20
S-a confirmat că supunerea celulelor cultivate la încărcarea cu dexametazonă sau la șoc seric de cal cu concentrație mare a reprodus amplitudinea expresiei genei ceas in vitro. 21,22 Adăugarea de ser cu concentrație mare și glucocorticoizi sunt considerate a fi utile pentru reproducerea ritmului circadian al expresiei genei ceasului în țesuturile periferice. 18,23 În acest studiu, am reușit să inducem amplitudinea genelor ceas ARNm Per1, Cry1 și Nr1d1 in vivo cu încărcare de dexametazonă în celulele epiteliale tubulare de șoarece. Odată cu încărcarea cu dexametazonă, Per1 a crescut la 4, 20–24 și la 44 de ore după stimulare, Cry1 a fost crescut la 0–8 și 24–32 ore, iar Nr1 d1 a fost crescut la 0– 4, 16–24 și 40–44 ore. Aceste modificări sunt similare cu cele descrise în rapoartele anterioare. 21 Folosind acest sistem de dexametazonă, am identificat inducerea amplitudinilor a 2 gene: Fxr1 și Ppat. Mai mult, imunocolorarea a demonstrat că PPAT a fost exprimat în nucleul și citoplasma tubilor, iar FXR1 a fost exprimat în citoplasma tubilor. Aceste rezultate sugerează că aceste 2 molecule sunt controlate derenalceasul periferic și sunt potențiali candidați pentru formarea ritmului circadian al tensiunii arteriale.
Western blot a arătat că expresia proteinei FXR1 a fost mai mică înrenalmedulara la șobolanii SHR decât la cea a șobolanilor WKY. Expresia PPAT în medularul renal al șobolanilor WKY și SHR nu a diferit într-o măsură semnificativă statistic. Fxr1 aparține aceleiași familii de gene ca gena 1 a retardului mental X fragil (Fmr1), care este considerată gena cauzatoare a sindromului X fragil. FXR1 este o proteină de legare a ARN-ului care interacționează cu FMR1 și FXR2. Se presupune că citoplasma și nucleul pot fi reciproce deoarece au semnale de localizare nucleară și semnale de export nuclear. 24 La om, s-a demonstrat că expresia aberantă a Fxr1 în mușchiul scheletic provoacă distrofie musculară facioscapulohumerală. 25 În acest studiu, expresia Fxr1 a fost redusă înrinichide șobolani SHR și SHRSP și a fost exprimat în citoplasma tubulară de origine mezodermică, care este aceeași cu cea a mușchiului scheletic și poate fi implicată în proliferarea și creșterea celulelor tubulare. PPAT formează un homotetramer în formă de gogoașă și devine un homotetramer inactivat prin legarea nucleotidelor purinice pentru a afecta metabolismul acidului uric. În acest studiu, expresia PPAT a fost crescută înrinichide șobolani SHR și SHRSP, iar PPAT a fost localizat în citoplasmă și nucleul celulelor tubulare. Deoarece acidul uric are toxicitate vasculară puternică și este un factor de risc independent pentru arterioscleroză. Astfel, funcția aberantă PPAT ar putea fi asociată cu caracteristicile patofiziologice ale SHR.
Acest studiu a aplicat analize de secvență și expresie și experimente cu celule de cultură într-o nouă încercare de a restrânge moleculele care sunt legate de reglarea tensiunii arteriale și care sunt controlate de ceasul biologic. În plus, Fxr1 și Ppat sunt controlate de ceasul biologic și sunt legate de reglarea tensiunii arteriale. Sunt necesare studii suplimentare pentru a măsura și confirma variația temporală a expresiei genelor Fxr1 și Ppat la șobolan.rinichi.Este de așteptat ca mecanismele de acțiune ale acestor molecule să fie clarificate. Controlul acestor molecule este considerat o țintă pentru tratamentul biologic al anomaliilor de fluctuație a tensiunii arteriale.
Pe baza constatărilor prezentului studiu, o posibilă buclă de feedback circadian înrinichidin SHR este prezentat în Figura 6. PPAT și FXR1 au un EBOX în care BMAL1 și CLOCK se leagă de promotor, sugerând că acestea sunt implicate în formarea ritmului circadian în tubuli sub controlul genelor ceas. Se considera ca sunt implicati in reabsorbtia si excretia apei si electrolitilor din tubuli, si ca pot afecta hipertensiunea si ritmul circadian al tensiunii arteriale.
Astfel, PPAT și FXR1 au fost considerate molecule implicate în formarea ritmului circadian al tensiunii arteriale înrinichi. În ceea ce privește mecanismele de reglare a tensiunii arteriale, aceste molecule sunt candidați de top pentru studii care încearcă să elucideze mecanismele care stau la baza formării ritmului circadian al tensiunii arteriale.
