Efectul Tropisetronului asupra stresului oxidativ, SIRT1, FOXO3a și Claudin-1 în țesutul renal al șobolanilor diabetici induși de STZ

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract

Tropisetronul este un antagonist al receptorului 5-HT3 care exercită un efect protector împotriva DN. Scopul acestui studiu a fost de a investiga posibilele mecanisme moleculare asociate cu efectele renoprotective ale tropisetronului la șobolanii diabetici induși de STZ. Animalele au fost împărțite în 5 grupuri egale; control, tropisetron, diabet, tropisetron plus diabet și glibenclamid plus diabet (n=7). Pentru inducerea diabetului de tip 1, animalelor a fost administrată o singură injecție de STZ (55 mg/kg, ip). Șobolanii diabetici au fost tratați cu tropisetron (3 mg/kg) și glibenclamidă (1 mg/kg) timp de 2 săptămâni. Conform analizei efectuate, diabetul a dus larenal disfuncție (reducerea ratei de filtrare glomerulară și a ureei și a creatininei în urină, precum și creșterea ureei plasmatice și a creatininei) și anomalii ale sistemului de apărare antioxidantă (reducerea TAC și creșterea MDA), în comparație cu grupul de control, care a fost prevenit de tropisetron tratament. Reacția cantitativă a polimerazei cu transcripție inversă și analiza western blot au demonstrat că expresia genei SIRT1 a scăzut în timp ce expresia genei FOXO3a și NF-κB, precum și raporturile fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a și nivelul de proteină claudin-1 au crescut înrinichide șobolani diabetici comparativ cu grupul martor. Aici, rezultatele acestei cercetări au arătat că tratamentul cu tropisetron a inversat aceste schimbări. În plus, toate aceste modificări au fost comparate cu cele produse de glibenclamid ca martor pozitiv. Prin urmare, tropisetronul s-a amelioratafectare renalădin cauza nefropatiei diabetice, posibil prin suprimarea stresului oxidativ și modificarea nivelurilor SIRT1, FOXO3a și claudin-1.

Cuvinte cheie:leziuni renale; functie renala; boala renala; rinichi; țesuturi renale

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ

Introducere

Nefropatia diabetică (DN) este o boală microvasculară care se caracterizează prin proteinurie excesivă cu o morbiditate de 25–40% (Chen et al. 2011; Ritz et al. 2010). Alterări morfologice și funcționale, inclusiv hipertrofia glomerulară, acumularea excesivă de matrice extracelulară și glomeruloscleroza și, în cele din urmă, pierdereafunctie renalaînrinichisunt asociate cu hiperglicemia și, ulterior, cu tulburarea metabolismului glucozei (Kanwar et al. 2008; Vikram et al. 2014). Prin urmare, s-a acordat o atenție deosebită managementului sau tratamentului eficient care poate fi necesar pentru combaterea bolii în stadiu incipient. Dovezile acumulate indică faptul că producția de specii reactive de oxigen (ROS) ca o problemă directă a hiperglicemiei și, ulterior, producția de citokine inflamatorii sunt mecanisme majore în dezvoltarea complicațiilor diabetice (Beckman și Ames 1998; Giacco și Brownlee 2010; Jaimes și colab. 2010). Kiritoshi et al. 2003). Este evident că dezechilibrul dintre capacitatea de apărare pro-oxidantă și antioxidantă are ca rezultat acumularea de radicali liberi care pot deteriora macromoleculele celulare, inclusiv ADN-ul, precum și modificarea proteinelor și peroxidarea lipidelor (Peluso și Raguzzini 2016).

Sirtuinele de mamifere sunt o familie de deacetilaze dependente de NAD plus, incluzând șapte membri (SIRT1-7). Dintre aceștia, SIRT1, primul membru al familiei, a fost studiat cel mai pe larg (Dong et al. 2014). Studii recente au arătat că SIRT1 joacă un rol important în reglarea morții/longevității celulare, precum și în răspunsul la stres acut și cronic la mamifere prin atenuarea leziunilor ADN-ului, a inflamației și a apoptozei (Hasegawa et al. 2013; Yun et al. 2012). ). Mai multe studii evidențiază niveluri mai ridicate de scădere indusă de ROS a activității SIRT1 la diabetici.rinichi,atât in vivo, cât și in vitro (Akhtar și Siragy 2019; Du și colab. 2016; Kumar și colab. 2014; Papadimitriou și colab. 2015; Park și colab. 2016; Shi și Huang 2018).

SIRT1 își poate exercita acțiunea prin reglarea mai multor proteine, cum ar fi factorii de transcripție ai factorului nuclear-kappaB (NF-κB) și ai familiei FOXO (Brunet și colab. 2004; Langley și colab. 2002; Motta și colab. 2004; Yeung și colab. 2004). Recent, a fost notificat că SIRT1 reglează metabolismul glucozei contribuind la FOXO (Kobayashi et al. 2005). FOXO3a este un subgrup al familiei FOXO de factori de transcripție care au un rol important în timpul stresului oxidativ (Accili și Arden 2004). Modificările FOXO3a apar prin fosforilare și acetilare care pot apărea simultan în diferite condiții. Conform literaturii de specialitate, SIRT1 poate deacetila FOXO3a, crescând astfel nivelul său de ubiquitinare și protejând împotriva factorilor de stres (Wang et al. 2017a). Există puține informații despre mecanismul interacțiunilor dintre SIRT1 și FOXO în condiții de hiperglicemie (Yun et al. 2012). Cu toate acestea, s-a sugerat că SIRT1 modulează activitatea FOXO probabil prin translocarea lor nucleară (Brunet et al. 2004) și, de asemenea, controlează transcripția specifică genei (Kobayashi și colab. 2005). Prin urmare, translocarea FOXO3a din citoplasmă în nucleu este cauzată în principal de activitatea de deacetilare a SIRT1, în special în starea de stres oxidativ (Yun et al. 2012).

Wang şi colab. a raportat că tratamentul cu glucoză ridicată a modulat expresia proteinei SIRT1 și FOXO3a la omrinichicelule epiteliale (Wang et al. 2017b). Mai mult, FOXO3a funcționează ca un regulator pozitiv al semnalizării NF-kB, în care ar putea fi folosit pentru a afecta strategiile de supraviețuire a celulelor în condiții de stres (Li et al. 2012). Claudin-1 este un marker specific pentru celulele epiteliale parietale (PEC) (Huby et al. 2009; Ohse et al. 2009; Rincon-Choles et al. 2006), care este asociat negativ cu expresia SIRT1 atât în ​​zona proximală. tubii si regiunea glomerulara. S-a demonstrat că reglarea descendentă a SIRT1 în diabet este coroborată de reglarea în sus a proteinei de joncțiune strânsă claudin-1 în podocite care contribuie la albuminurie (Gong și colab. 2017; Hasegawa și colab. 2013). Deoarece stresul oxidativ, o citokină inflamatorie și mediatorii lor moleculari sunt subiecte majore în efectul dăunător al diabetului, agenții antioxidanți și antiinflamatori ar putea oferi noi terapii împotriva DN (Elmarakby și Sullivan 2012).

Tropisetronul este un antagonist recent al receptorului 5-HT3 care a fost identificat ca un medicament antiemetic în timpul chimioterapiei (Barzegar-Fallah et al. 2015). Mai multe rapoarte au arătat că tropisetronul poate oferi efecte antiapoptotice, antidiabetice, anticancerigene, antilipidemice, neuroprotectoare și cardioprotectoare care sunt probabil mediate prin mecanisme antioxidante și antiinflamatorii (Aminzadeh 2017; Asadi et al. 2016; Barzegar-Fallah et al. 2015; Barzegar-Fallah și colab. 2014; Gholizadeh-Ghaleh Aziz și colab. 2019; Rashidi și Bazi 2020). Există unele studii care dovedesc efectul antioxidant al tropisetronului, atât in vitro, cât și in vivo, cum ar fi efectul protector al tropisetronului asupra tulburărilor oxidative induse de hiperglicemie în celulele PC12 (Aminzadeh 2017), ameliorarea leziunii mitocondriale prin scăderea nitrigiei. activitatea sistemului în creier (Haj Mirzaian et al. 2016) sau atenuarea stresului oxidativ împotriva îmbătrânirii creierului la șoareci (Mirshafa și colab. 2020).

Recent, Barzegar Fallah et al. a dezvăluit că tropisetronul ameliorează glicemia și, de asemeneafunctie renaladupă cum este evidențiat prin scăderea azotului ureic din sânge (BUN), a nivelurilor de creatinine serice și a excreției urinare de albumină. îmbunătățit la animalele diabetice tratate cu tropisetron (Barzegar-Fallah et al. 2015). Cu toate acestea, nu există alte dovezi puternice despre modularea DN de către tropisetron și mecanismul său molecular. Prin urmare, acest studiu își propune să evalueze, în primul rând: efectele tropisetronului asupra mediatorilor moleculari, inclusiv SIRT1, NF-κB și FOXO3a, precum și claudina-1, care este o proteină implicată în joncțiunile epiteliale strânse și joacă un rol important. rol major înrenalnefropatie diabetica; în al doilea rând, pentru a compara efectul tropisetron cu medicamentul antidiabetic standard comercializat, glibenclamida, pentru a găsi un agent mai benefic și mai sigur ca medicament antidiabetic standard de aur.

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

Materiale și metodeAcest studiu a fost realizat în conformitate cu principiile îngrijirii animalelor de laborator din Universitatea de Științe Medicale din Urmia. Aprobarea etică a fost obținută din Directiva UE 2010/63/UE pentru experimente pe animale, conform ghidurilor Comitetului de Etică Medicală, Ministerul Sănătății, Iran (IR.UMSU.REC.1397.291). Treizeci și cinci de șobolani Wistar masculi (230-270 g greutate, vârsta de 3-4 luni) au fost alocați în 5 grupuri (șapte șobolani în fiecare grup): 1. Grupul martor: șobolanii au primit soluție salină normală intraperitoneal timp de 2 săptămâni. 2. Grupul Tropisetron: Sobolanii au primit tropisetron intraperitoneal timp de 2 saptamani. 3. Grupa cu diabet zaharat: Diabetul a fost indus prin injectare cu streptozotocină (STZ) la șobolani. 4. Grupul de tropisetron plus diabet: șobolanii au primit 3 mg/kg de tropisetron (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) intraperitoneal timp de 2 săptămâni după inducerea diabetului. 5. Grupul de glibenclamid plus diabet: șobolanii au primit 1 mg/kg glibenclamidă (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) intraperitoneal timp de 2 săptămâni după inducerea diabetului.

Inducerea diabetuluiStreptozotocina (50 mg/kg) a fost injectată intraperitoneal într-o singură doză pentru a induce diabetul la șobolani. Pe baza acestei metode, diabetul de tip I a fost indus la șobolani la 72 de ore după injectare. Diabetul a fost diagnosticat și confirmat prin crearea unei răni minore folosind o lancetă în coada șobolanilor care țin jeun, iar apoi o picătură de sânge a fost plasată pe o bandă de glucometru. Apoi, a fost măsurat cu un glucometru (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN), iar nivelurile de glucoză din sânge peste 300 mg/dl au fost considerate un indicator al inducerii diabetului. După 2 săptămâni și 24 de ore înainte de anestezie, șobolanii au fost plasați în cuști metabolice unul câte unul și a fost colectată urina. Apoi, probele de urină au fost centrifugate imediat, cu suprafața transparentă a probelor depozitate la -20 de grade pentru analiza ureei și creatininei. După aceea, șobolanii au fost cântăriți și anesteziați prin injectare intraperitoneală cu amestec de ketamina (60 mg/kg) și xilazină (4 mg/kg). Apoi, cavitatea abdominală a fost deschisă; sângele a fost obținut din inimă cu o seringă îngustă și amestecat cu acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) și centrifugat la 4000 x g timp de 20 min. Apoi, plasma obținută a fost stocată la -80 de grade pentru măsurarea ulterioară a ureei, creatininei și a capacității antioxidante totale (TAC). Ambiirinichidintre animale au fost excizate, spălate cu ser fiziologic rece și cântărite. Stangarinichițesuturile au fost omogenizate de Ultra Turrax (T10B, IKA și Germania) într-o soluție care conține ARNază pentru a testa nivelurile de expresie ale SIRT1, NF-kB și FOXO3a folosind metoda PCR în timp real. Dreaptarinichia fost înghețat la -80 de grade pentru măsurarea MDA și analiza Western blot (FOXO3a total și fosforilat și claudin-1).

Glicemia a jeunLa sfârșitul protocolului, după postul peste noapte (14 până la 18 ore), s-au obținut probe de sânge din vârful cozii, iar apoi s-au măsurat nivelurile de glucoză cu ajutorul unui glucometru digital (Elegance, CT-X10, Frankenberg, Germania).Uree și creatinine urinare și plasmaticeÎn acest scop, nivelurile urinare și plasmatice de uree și creatinine vor fi măsurate prin truse economice specifice pentru măsurarea ureei și creatininei (Biotechnical; Varginha, Minas Gerais, Brazilia).Rată de filtrare glomerularăRata de filtrare glomerulară (RFG) este cel mai bun indice general alfuncțiile rinichilor, care a fost evaluat prin calcularea clearance-ului creatininei (GFR=[UCr × V]/SCr) și utilizând concentrațiile plasmatice și ale creatininei urinare și debitul sau volumul de urină.

Malondialdehidă și capacitate antioxidantă totalăMDA ca produs final al peroxidării lipidelor a fost evaluat printr-o reacție cu acid tiobarbituric (Sigma-Aldrich; SUA) înrinichiprobe conform protocolului producătorului (Esterbauer și Cheeseman 1990). Pe scurt, 0,3–0,4 g dețesut renala fost omogenizat în KCI rece ca gheață (150 mM) și apoi centrifugat la 3000 x g timp de 10 min. Apoi, 0,5 ml de supernatant s-au combinat cu 3 ml de acid fosforic (1 procente, v/v), iar după amestecarea vortexului, s-au alăturat probelor 2 ml de 6,7 g/l TBA. Probele au fost încălzite la 100 de grade timp de 45 de minute. După răcire pe gheață, n-butanol (3 ml) a fost combinat și produsele au fost centrifugate în continuare la 3000 x g timp de încă 10 minute. Apoi, absorbanța produselor a fost considerată la 532 nm prin spectrofotometrie. Nivelul absorbanței a fost comparat cu curba standard. TAC a fost măsurat printr-un kit de status antioxidant total Randox, în care ABTS 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin{-6-sulfonat) este incubat cu peroxidază și H2O2, rezultând cationul radical ABTS plus producție. . Acesta are o culoare albastru-verde stabilă, care este evaluată folosind un analizor automat 600-nm (Amini et al. 2020).

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Design primer și PCR în timp realARN-ul a fost extras mai întâi de trusa relevantă (GENALL), iar ARN-ul condensat a fost evaluat calitativ (electroforeză) și cantitativ (nano-drop) pentru a asigura extracția și aplicarea ARN-ului în tehnicile moleculare ulterioare. Apoi, cADN-ul relevant a fost sintetizat din toate probele de ARN extrase. Primerii genelor țintă și gena gliceraldehidă dehidrogenază (GAPDH) ca genă de întreținere au fost examinați pe site-ul NCBI folosind software-ul Generunner (tabel suplimentar). Apoi, expresia genei a fost analizată utilizând primerii sintetizați printr-un kit PCR, urmată de analiza statistică a datelor.

Western blotMetoda Western blot a fost utilizată pentru a determina nivelul proteinei FOXO3a (total și fosforilat) și claudin-1 înrinichi.Două geluri de separare și stivuire sunt utilizate pentru a face gelul de electroforeză. După prepararea gelului de dizolvare și turnarea acestuia în matriță, s-a adăugat un gel de stivuire după o oră și după stivuire. Probele au fost încărcate în puțuri realizate cu un pieptene special. Apoi au fost separați prin SDS-PAGE. În decurs de o oră, toate specimenele încărcate au fost transferate pe membrana PVDF. Ulterior, specimenele au fost blocate cu 5% tampon de lapte degresat incluzând 0,1% Tween 20 și apoi au fost incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 grade într-un incubator agitator. Apoi membranele au fost incubate cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean. În cele din urmă, beta-actina a fost utilizată ca standard intern pentru analiza Western blot. La final, efectele probelor blotate, în funcție de nivelul de proteină țintă, au fost evaluate pe filmul de radiografie într-o cameră întunecată. Pentru a cuantifica proteinele țintă, rezultatele scanării filmului au fost calculate cu un densitometru în raport cu nivelul de actină. Anticorpii utilizați în testele Western blotting sunt prezentați în tabelul suplimentar (numerele de catalog și companiile).

analize statisticeRezultatele au fost prezentate ca medie ± SEM. Analiza statistică a fost efectuată utilizând SPSS 16.0. Comparația între grupuri a fost estimată prin testul ANOVA urmat de testul post-hoc al lui Tukey. Diferențele au fost presupuse semnificative statistic la P <>

Rezultate

Tropisetronul a scăzut glicemia a jeun (mg/dl), greutatea rinichilor (g) și indicele rinichilor (mg/g), în timp ce a crescut greutatea corporală (g) la șobolanii diabetici induși de STZSimilar cu studiile anterioare din această lucrare, grupurile de diabetici au prezentat hiperglicemie severă (P < {{0}}.001)="" în="" comparație="" cu="" grupul="" de="" control.="" consumul="" de="" tropisetron="" (p="">< 0.01)="" și="" glibenclamidă="" (p="">< 0,05)="" timp="" de="" 2="" săptămâni="" a="" redus="" semnificativ="" glicemia="" la="" grupurile="" cu="" diabet="" zaharat="" indus="" de="" stz,="" dar="" a="" fost="" încă="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" cea="" din="" grupul="" de="" control="" (p="">< 0,001).="" ).="" nu="" a="" existat="" nicio="" diferență="" semnificativă="" în="" greutatea="" corporală="" (bw)="" între="" grupuri="" la="" începutul="" acestui="" studiu="" (datele="" nu="" sunt="" prezentate).="" inducerea="" diabetului="" zaharat="" de="" către="" stz="" a="" scăzut="" semnificativ="" (p="">< 0,001)="" în="" cele="" din="" urmă="" (bw)="" la="" șobolanii="">Rinichigreutatea (KW) nu a fost semnificativă între grupuri la început; cu toate acestea, a fost crescută în grupul cu diabet și a scăzut după intervenții.Rinichiindicele (KW/BW) a fost semnificativ crescut (P <{{{0}},001) în="" t1dm="" în="" comparație="" cu="" grupul="" de="" control.="" interesant,="" după="" 2="" săptămâni="" de="" administrare="" de="" tropisetron="" și="" glibenclamidă,="" kw/bw="" a="" modulat="" (p="">< 0,05)="" (tabelul="">

Tropisetron a îmbunătățit analiza biochimică la șobolanii diabetici induși de STZCa și în studiile anterioare, nivelurile de uree din plasmă și urină ale grupului cu diabet zaharat au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul de control (P < {{0}}.001)="" .="" în="" grupul="" de="" tropisetron="" plus="" diabet,="" plasmă="" (p="">< 0.{{10}}01)="" și="" urină="" (p="">< 0.0="" 5)="" nivelurile="" de="" uree="" au="" scăzut="" semnificativ="" în="" comparație="" cu="" cele="" din="" grupurile="" cu="" diabet="" zaharat.="" cu="" toate="" acestea,="" ureea="" din="" urină="" a="" fost="" încă="" semnificativ="" mai="" mică="" decât="" cea="" din="" grupul="" de="" control="" (p="">< 0,01).="" nu="" există="" nicio="" diferență="" semnificativă="" în="" nivelul="" ureei="" plasmatice="" între="" tropisetron="" plus="" diabet="" și="" grupurile="" de="" control.="" nivelul="" creatininei="" plasmatice="" (p="">< 0,001)="" și="" urinei="" (p="">< 0,05)="" a="" arătat="" o="" creștere="" semnificativă="" la="" șobolanii="" diabetici="" comparativ="" cu="" cel="" din="" lotul="" martor.="" administrarea="" de="" tropisetron="" a="" redus="" semnificativ="" concentrațiile="" plasmatice="" ale="" creatininei="" în="" urină="" (p="">< 0,001)="" comparativ="" cu="" grupul="" cu="" diabet="" zaharat.="" la="" animalele="" diabetice,="" clearance-ul="" creatininei,="" ca="" indicator="" al="" ratei="" de="" filtrare="" glomerulară,="" a="" fost="" semnificativ="" mai="" mic="" decât="" cel="" din="" grupul="" martor="" (p="">< 0,05).="" tratamentul="" cu="" tropisetron="" a="" crescut="" semnificativ="" clearance-ul="" creatininei="" comparativ="" cu="" cel="" din="" grupul="" cu="" diabet="" (p="">< 0,001).="" aceleași="" rezultate="" au="" fost="" obținute="" și="" în="" grupul="" tratat="" cu="" glibenclamidă.="" cu="" toate="" acestea,="" ureea="" plasmatică="" este="" mult="" mai="" mică="" în="" grupul="" tratat="" cu="" tropisetron="" în="" comparație="" cu="" cea="" din="" grupul="" cu="" glibenclamid="" plus="" diabet="" (p="">< 0,01)="" (tabelul="">

Tropisetronul a crescut conținutul de TAC în plasmă și a atenuat nivelul de MDA la șobolanii diabetici induși de STZNivelul MDA în grupele de control, tropisetron, diabet zaharat, tropisetron plus diabet și glibenclamid plus diabet a fost de 8,65 ± 1.01, 1{0,89 ± 1.6 35,54 ± 7,1, 18,76 ± 3,6 și, respectiv, 16,89 ± 4,1 nmol/mg de proteină. Studiul nostru, împreună cu cele ale altora, au demonstrat cel mai înalt nivel de MDA în grupul cu diabet, care a arătat o creștere semnificativă în comparație cu grupul de control (P < 0.00="" 1).="" nivelul="" mda="" în="" grupurile="" cu="" tropisetron="" plus="" diabet="" și="" glibenclamidă="" plus="" diabet="" a="" arătat="" o="" reducere="" semnificativă="" (p=""><{{30}}.01) în="" comparație="" cu="" grupul="" cu="" diabet="" (fig.="" 1a).="" nivelurile="" tac="" în="" grupele="" martor,="" tropisetron,="" diabet,="" tropisetron="" plus="" diabet="" și="" glibenclamid="" plus="" diabet="" au="" fost="" de="" 0,65="" ±="" 0.{{40}}3,="" {{44}="" },76="" ±="" 0,06,="" 0,26="" ±="" 0,08,="" 0,45="" ±="" 0,06,="" respectiv="" 0,57="" ±="" 0,08="" nmol/ml.="" nivelurile="" tac="" au="" scăzut="" în="" grupul="" cu="" diabet="" în="" comparație="" cu="" cel="" al="" grupului="" de="" control="" (p="">< 0,001),="" așa="" cum="" sa="" arătat="" anterior.="" atât="" administrarea="" de="" tropisetron,="" cât="" și="" de="" glibenclamidă="" a="" crescut="" semnificativ="" (p="">< 0,01)="" nivelurile="" plasmatice="" de="" tac="" la="" animalele="" diabetice="" în="" comparație="" cu="" grupul="" diabetic="" (fig.="">

Tropisetron a crescut SIRT1 și a scăzut expresiile genelor FOXO3a și NF-kB. Expresiile genelor au fost evaluate prin PCR în timp real, ceea ce a furnizat dovezi importante pentru o diferență între grupuri. În consecință, diabetul a fost asociat cu o scădere semnificativă (0,65 ± 0.08) a expresiei genei SIRT1 (P < 0.01.="" )="" și="" o="" creștere="" semnificativă="" (p="">< 0.0{01)="" în="" foxo3a="" (1,98="" ±="" 0.08)="" și="" nf-kb="" (1,71="" ±="" 0.14)="" expresia="" genei="" comparativ="" cu="" grupul="" martor.="" tratamentul="" cu="" tropisetron="" a="" crescut="" semnificativ="" nivelul="" sirt1="" (0.88="" ±="" 0,3)="" și="" a="" scăzut="" semnificativ="" foxo3a="" (1,53="" ±="" 0,08)="" (p=""><0,05) și="" nf-kb="" (1,27="" ±="" 0,03)="" (p=""><0,01) la="" șobolanii="" diabetici="" (fig.="" 2a–c).="" rezultate="" similare="" au="" fost="" furnizate="" la="" animalele="" tratate="" cu="" medicamentul="" standard,="">

Tropisetronul a scăzut expresia proteinei FOXO3a și claudin-1Pentru a evalua expresia proteinei FOXO3a (totală și fosforilată) și claudin- 1 după tratamentul cu tropisetron și glibenclamidă, a fost utilizată Western blotting înrinichia diferitelor grupuri. Analiza datelor arată o creștere semnificativă a raporturilor fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a (4,6 ± 0,17) și claudin-1 (3,02 ± 0,16). ) nivelurile de proteine ​​din grupul cu diabet zaharat comparativ cu controlul (P <0.001). administrarea="" de="" tropisetron="" a="" scăzut="" semnificativ="" raporturile="" fosforilate="" foxo3a/proteina="" totală="" foxo3a="" (2,14="" ±="" 0,31)="" și="" nivelurile="" de="" claudin-1="" (2,4="" ±="" 0,12)="">rinichide șobolani diabetici (P <{{0}}.01). tratamentul="" cu="" glibenclamidă="" a="" atenuat="" semnificativ="" atât="" raporturile="" fosforilate="" foxo3a/proteina="" totală="" foxo3a="" (2,57="" ±="" 0,5)="" (p="">< 0},001)="" și="" claudin{-1="" (2,2="" ±="" 0,11)="" (p="">< 0,05)="" )="" nivelurile="" de="" proteine="" ​​la="" șobolanii="" diabetici="" induși="" de="" stz="" (fig.="">

Discuţie Concluziile studiului actual sunt prezentate în următoarele secțiuni: injecția unică de T1DM indus de STZ a fost asociată cu hiperglicemie severă, pierdere în greutate șirinichidisfuncție, care se manifestă printr-o creștere marcată a creatininei plasmatice și a ureei și o scădere marcată a clearance-ului creatininei ca indice al RFG comparativ cu cel din grupul martor. STZ a perturbat echilibrul oxidativ înrinichițesut care a fost dovedit prin creșterea MDA și scăderea conținutului de TAC. O analiză moleculară ulterioară a arătat că diabetul a scăzut ARNm SIRT1 și a crescut ARNm NF-kB, precum și raporturile fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a și nivelul de proteină claudin-1 înrinichide șobolani masculi. Ameliorarea semnificativă a ureei, creatininei, creatininei

clearance-ul, precum și ARNm SIRT1, ARNm NF-kB, raporturile fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a și proteina claudin-1, similare cu cele ale animalelor martor, au fost observate în grupul cu tropisetron plus diabet. DN care se caracterizează prin mai multe caracteristici, cum ar fi întreruperea înrenalintegritatea structurală și funcțională, creșterea înrinichidimensiunea, precum și hipertrofia glomerulară și tubulară, este o cauză principală a stadiului terminalboala renala(Singh și colab. 2018; Yaribeygi și colab. 2018). Albuminuria progresivă, scăderea RFG și creșterea tensiunii arteriale sunt cele mai pronunțate simptome funcționale observate la pacienții diabetici (Alzahrani și colab. 2020). Cel mai precoce marker al DN este albuminuria care este cauzată de afectarea glomerulară progresivă ca o caracteristică centrală în inițierealeziuni renale(Elsherbiny și colab. 2018). În concordanță cu constatările noastre, studiile anterioare au evidențiat faptul că DN este însoțit de creșteri ale creatininei și ureei serice sugerând disfuncțiațesut renal(Sharma et al. 2006; Tang et al. 2018).

Dovezile acumulate indică faptul că generarea de radicali liberi din cauza hiperglicemiei este un eveniment cheie în debutul și progresia complicațiilor microvasculare diabetice, inclusiv DN. Producția excesivă de ROS contribuie la deteriorarea oxidativă prin afectarea macromoleculelor, celulelor și țesuturilor și are ca rezultat insulte ireversibile sau tulburări funcționale (Kiritoshi et al. 2003).

MDA ca marker al peroxidării lipidelor este declanșat de atacul radicalilor liberi asupra acizilor grași nesaturați membranari, care au contribuit la complicațiile diabetului (Pieme et al. 2017). Statutul antioxidant total a fost estimat de TAC care este un biomarker pentru a determina stresul oxidativ în multe condiții patologice. Astfel, tulburările MDA și TAC la pacienții diabetici reflectă producția de radicali liberi care induc starea de stres oxidativ (Peluso și Raguzzini 2016). În mod constant, rezultatele acestui studiu au arătat creșterea MDA și scăderea nivelurilor de TAC la șobolanii diabeticirinichi. Având în vedere acest fapt, atenuarea stresului oxidativ a ameliorat complicațiile diabetice, inclusivleziuni renale(Alzahrani et al. 2020; Barzegar-Fallah et al. 2015).

Tropisetronul, ca antagonist 5-HT3 cu activități antioxidante și antiinflamatorii, prezintă efecte protectoare în mai multe afecțiuni patologice, cum ar fi diabetul (Barzegar-Fallah și colab. 2015; Rashidi și Bazi 2020). Efectul nefroprotector al tropisetronului a fost descris anterior în experimente pe animale. Din această perspectivă, tropisetronul a ameliorat DN-ul într-un mod 5-independent de receptorul HT3, prevenind creșterea glicemiei,renalNivelurile MDA, CAT, SOD, Gpx și TNF și scăderea excreției urinare de citokine și albuminurie (Barzegar-Fallah și colab. 2015).

În conformitate cu această problemă, în investigația actuală, sunt furnizate dovezi pentru a arăta că hiperglicemia modulată cu tropisetron, pierderea în greutate și starea de stres oxidativ, care se manifestă prin scăderea MDA și creșterea conținutului de TAC și îmbunătățirearinichidisfuncție (o depleție semnificativă a ureei plasmatice și a creatininei). Glibenclamida a fost aplicată ca medicament standard conform studiilor anterioare (Amini et al. 2020). În mod interesant, nu s-a observat nicio diferență semnificativă în parametrii menționați la grupurile cărora li s-a administrat glibenclamidă și la care au fost administrate tropisetron.rinichide șobolani diabetici. Cu toate acestea, mecanismele precise din spatele efectului protector al tropisetronului în DN sunt încă necunoscute. Din câte cunoștințele noastre, acesta este primul studiu care demonstrează că tropisetronul a crescut expresia genei SIRT1 și a scăzut raporturile fosforilate FOXO3a/proteine ​​totale FOXO3a, NF-κB și nivelurile de proteină claudin- 1 înrinichia animalelor diabetice.

SIRT1 este o proteină deacetilază de clasa III care se implică în supraviețuirea celulelor în condiții stresante prin activarea mai multor proteine ​​cheie. Este un factor esențial pentru modularea expresiei genelor ca răspuns la generarea ROS, cum ar fi NF-kB și factorii de transcripție Foxo (Brunet și colab. 2004; Sengupta și colab. 2011). Printre familia Foxo, se presupune că FOXO3a are un rol important în timpul stresului oxidativ prin reglarea mai multor antioxidanți, inclusiv SOD și CAT.

(Hasegawa et al. 2008; Kops et al. 2002). În special, inactivarea FOXO3a a fost asociată cu reducerea stresului oxidativ indus de CAT în condiții de hiperglicemie (Wang și colab. 2017b). SIRT1 gestionează activarea FOXO3a prin deacetilare și modulează răspunsul celular la stresul oxidativ direct sau indirect (Hori et al. 2013). S-a declarat că există o asociere funcțională între reglarea SIRT1 și FOXO3 a sistemului de apărare antioxidant mediat de MnSOD (Tanaka et al. 2009; Zhang et al. 2015). În consecință, Zhang și colab. (2015) au demonstrat că icariina a protejat leziunea pulmonară acută cauzată de calea de semnalizare SIRT1/FOXO3 mediată de ischemie intestinală/reperfuzie prin reglarea în sus a expresiei MnSOD. Rapoartele anterioare au implicat, de asemenea, că suprareglarea SIRT1 atenuează nefropatia indusă de cisplatină,renalleziuni ischemice/ de reperfuzie și nefropatie diabetică (Funk și Schnellmann 2013; Gu et al. 2016; Kim et al. 2011). În special, reglarea descendentă a SIRT1 indusă de diabet care conduce la modificările fiziopatologice duce larenaltoxicitate (Wang et al. 2017b). Hasegawa et al. (2013) au demonstrat că scăderea SIRT1 în tubii proximali a declanșat inițierea DN și a dus la albuminurie. În linie, rezultatele acestei cercetări identificate au scăzutrenalExpresia genei SIRT1 în grupul diabetic. Prin urmare, activarea SIRT1 a cauzat rezistențarenalcelulele tubulare la stresul celular (Kume et al. 2013). Una peste alta, activatorii SIRT1 au câștigat o atenție remarcabilă ca candidați interesanți pentru terapia diabetului (Song et al. 2018)

Mai mult, cercetarea de față a arătat și un răspuns inflamator marcat la diabeticirinichiașa cum este evidențiată de creșterea NF-kB. Este un factor de reglare esențial legat de răspunsul imun și de inflamație (Hayden și Ghosh 2012). În concordanță cu constatările acestei cercetări, mai multe studii au raportat că activarea NF-kB și translocarea sa nucleară crește atât în ​​DN experimental, cât și în cel uman (Alzahrani et al. 2020; Kuhad și Chopra 2009). În plus, creșterea SIRT1 contribuie la inactivarea NF-kB pentru a salva podocitele de leziuni la diabetici.rinichi(Liu et al. 2014). Interesant, supraexpresia SIRT1 atenuează expresia unei proteine ​​în joncțiunile epiteliale strânse, și anume claudin-1, la șobolanii hiperglicemici, care este în corelație cu nivelul proteinuriei. Claudina activată-1 în podocite deteriorează funcția barierei glomerulare prin reducerea expresiei sinaptopodinei sau podocinei, ducând la albuminurie (Hasegawa et al. 2013). Aceste descoperiri au fost aprobate și în rinichii șobolanilor diabetici.

Aici, s-a demonstrat pentru prima dată că, în condiții de diabet, administrarea de tropisetron a condus la creșterea expresiei genei SIRT1 și la scăderea concomitentă a raporturilor de proteine ​​​​FOXO3a fosforilate/total FOXO3a, NF-κB și nivelurile de proteină claudin-1. Prin urmare, este foarte logic ca o astfel de activare în SIRT1 și scăderea ulterioară a raporturilor fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a, NF-κB și claudin-1 să fie, parțial, responsabile pentru îmbunătățirea diabeticfunctia rinichilor. Cercetătorii au raportat că efectele protectoare ale tropisetronului în DN par a fi 5-independente de receptorul HT3, deoarece granisetronul, un alt blocant selectiv al receptorului 5-HT3, nu a reușit să protejeze DN. S-a declarat că mecanismele antioxidante și antiinflamatorii ale tropisetronului pot avea un rol critic înțesut renalprotecție în diabet (Barzegar-Fallah et al. 2015). Recent, laboratorul nostru a observat că tratamentul cu tropisetron a crescut secreția de insulină și a scăzut nivelul de glucoză din sânge prin creșterea expresiei genei GLUT2, precum și a căii UCP2/ZnT8 (Naderi et al. 2020). Tropisetronul ca blocant al receptorului 5-HT3 a crescut eliberarea de insulină din linia de celule beta producătoare de insulină pancreatică, ceea ce a dus la hipoglicemie (Heimes et al. 2009). Prin urmare, se pare că modularea eliberării insulinei și, ulterior, homeostazia glucozei poate implica răspunsuri antioxidante și antiinflamatorii care contribuie larinichiprotecţie.

În conformitate cu descoperirile prezente, tropisetronul a inversat daunele oxidative prin creșterea expresiei genei SIRT1 în senescență la șoareci (Mirshafa et al. 2020). În plus, s-a observat atenuarea leziunilor hepatice, a nivelurilor de proteine ​​TNF- și IL-6 în ficatul șobolanilor diabetici după co-tratamentul cu tropisetron (Amini et al. 2020; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019). De asemenea, în cercetarea de față, tropisetronul a arătat un răspuns similar la un medicament standard, glibenclamida. În consecință, expunerea la glibenclamidă a crescut SIRT1 și a scăzut raporturile fosforilate FOXO3a/proteina totală FOXO3a, NF-kB și nivelurile de claudin-1 la diabetici.rinichiîn studiul actual. Glibenclamida este un medicament consacrat care a fost utilizat pe scară largă în tratamentul pacienților diabetici prin inhibarea canalelor K plus sensibile la ATP. Deoarece au existat unele rezultate contradictorii cu privire la efectul glibenclamidei în DN (Akbar et al. 2013; Elmalí et al. 2004; Nakamura et al. 2000), probabil din cauza dozei sau a duratei tratamentului, acest eveniment a furnizat motivația pentru introducerea unui medicament nou pentru pacienții diabetici ca agent sigur și eficient, cu mai puține efecte secundare

În general, tropisetronul se îmbunătățește eficientfunctie renalaîn DN, probabil, prin modificarea expresiei SIRT1, a raporturilor fosforilate FOXO3a/proteine ​​totale FOXO3a, NF-kB și claudin-1. Acest studiu a avut unele limitări în susținerea acestui subiect. De exemplu, studiile morfologice ar trebui să încerce să ofere dovezi suplimentare pentru a valida investigația de față. De asemenea, cercetătorii nu au folosit inhibitori de molecule pentru a valida mecanismul exact al căii de semnalizare.

Concluzie

În concluzie, constatările acestui studiu au arătat efectul nefroprotector al tropisetronului în T1DM indus de STZ. Descoperirile demne de remarcat ale acestei investigații au indicat că efectul nefroprotector al tropisetronului a implicat posibil modificări ale expresiei SIRT1, FOXO3a, NF-kB și claudinei-1. Aceste date ar putea fi stimulatoare pentru cercetări ulterioare în acest domeniu.