Inactivarea RPX1 în Arabidopsis conferă rezistență Plutella Xylostella prin acumularea de homoterpenă DMNT

Abstract

Dăunătorul culturii lepidoptere Plutella xylostella provoacă constrângeri severe asupra culturii Brassica. Aici, raportăm un rol nou pentru RPX1 (rezistența la P. xylostella) în rezistența la acest dăunător în Arabidopsis thaliana. Mutantul rpx1-1 respinge larvele P. xylostella, iar hrănirea cu mutantul rpx1-1 dăunează grav structurii matricei peritrofice din intestinul mediu al larvelor, afectând astfel în mod negativ creșterea și pupația larvelor. Această rezistență rezultă din acumularea de compuși de apărare, inclusiv monoterpenul (3E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrien (DMNT), datorită reglării pozitive a PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1), care codifică un enzima biosintetică cheie DMNT. Infestarea și rănirea cu P. xylostella induc degradarea proteinei RPX1, care poate conferi un răspuns rapid la infestarea cu insecte. Inactivarea RPX1 și supraexprimarea PEN1 nu sunt asociate cu compromisuri negative pentru creșterea plantelor, dar au o producție de semințe mult mai mare decât tipul sălbatic în prezența infestării cu P. xylostella. Acest studiu oferă o nouă strategie pentru reproducerea moleculară a plantelor împotriva P. xylostella.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

  CUVINTE CHEIE

rezistență la dăunători, metabolism secundar, emisii volatile

1|INTRODUCERE

Insectele dăunătoare nu numai că reduc randamentul culturilor, ci afectează și calitatea produselor vegetale (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Printre acestea, molia de diamant Plutella xylostella este un dăunător lepidoptere dăunător și răspândit pe scară largă, care se hrănește cu culturi de crucifere, cum ar fi conopida și varza, provocând pierderi economice imense. În prezent, în managementul agriculturii, controlul dăunătorilor folosind substanțe agrochimice (de exemplu, pesticide) a avut mare succes și a fost aplicat intens, dar această abordare devine problematică din cauza potențialei contaminări a mediului și a amenințărilor la adresa sănătății umane (Shakeel et al., 2017). O abordare alternativă a producției de culturi este utilizarea culturilor modificate genetic cu rezistență sporită la dăunători, de exemplu în expresia plantei a Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) sau a altor proteine ​​entomotoxice heterologe (Douglas, 2018). Au fost depuse eforturi ample pentru a identifica noi abordări de combatere a P. xylostella în agricultură; cu toate acestea, genele eficiente, pesticidele naturale și germoplasma rezistentă rămân limitate (Zhou & Jander, 2021). Printr-o cursă constantă a înarmărilor cu insectele dăunătoare, plantele au dezvoltat diverse abilități de a combate atacurile insectelor. În consecință, plantele sintetizează rețele de metaboliți defensivi, cum ar fi benzoxazinoizi (Handrick și colab., 2016; Varsani și colab., 2019), benzoat de metil (Feng și Zhang, 2017) și serotonina (Lu și colab., 2018) ca răspuns la vătămarea dăunătorilor. Acidul iasmonic (JA), numit și „hormonul plăgii”, joacă un rol central în diferitele răspunsuri la daune legate de răni inițiate de infestarea cu insecte (Lortzing & Steppuhn, 2016). Dovezile tot mai mari sugerează că JA funcționează sinergic și/sau antagonic cu alți fitohormoni, cum ar fi acidul salicilic (SA) și etilena (Costarelli și colab., 2020; Ma și colab., 2019). Pe lângă apărarea directă, plantele afectate de atacurile insectelor eliberează diverși compuși volatili care atrag inamicii naturali ai ierbivorelor (Gols, 2014). Dintre aceste amestecuri volatile complexe, compușii homoterpenici (3E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrienă (DMNT) și (E, E) -4,8,12-trimetil-1,3,7, 11-tridecatetraenul (TMTT) a fost raportat la mai multe specii de plante, cum ar fi Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), orezul (Li et al., 2018), porumbul (Gouinguené et al., 2005). Richter și colab., 2016) și bumbac (Liu și colab., 2018). Mai multe studii au indicat, de asemenea, că DMNT acționează ca o moleculă semnal care induce apărarea anti-erbivoră în timpul comunicării plantă-plantă (Arimura și colab., 2000; Meents și colab., 2019). De exemplu, după ce au suferit daune din cauza insectelor de mestecat, unii cartofi dulci emit DMNT, ceea ce are ca rezultat inducerea sistemică a entorsei inhibitoare de protează la plantele de cartof dulci învecinate și le face indigeste pentru insecte (Meents et al., 2019). Rezultate similare au fost observate pentru plantele de ceai (Jing et al., 2020). Recent, am descoperit că DMNT joacă un rol în uciderea larvelor de P. xylostella prin perturbarea barierei matricei peritrofice (PM) din intestinul mijlociu al insectelor (Chen et al., 2021).

În plantele superioare, căile de biosinteză DMNT și TMTT au fost bine caracterizate prin genetică inversă și analize biochimice. La porumb, DMNT și TMTT sunt produse din degradarea oxidativă a (E)-nerolidol și (E, E)-geranil linalol de către două monooxigenaze P450, CYP92C5 și CYP92C6 (Richter et al., 2016). În bumbac, două gene CYP (GhCYP82L1 și GhCYP82L2) sunt responsabile pentru conversia (E)-nerolidol în DMNT și (E, E)-geranil linalol în TMTT (Liu et al., 2018). În rădăcinile Arabidopsis, DMNT este catalizat din precursorul C30 triterpendiol, canabidiol, de monooxigenaza citocromului P450 codificată de gena specifică rădăcinii CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Un studiu folosind drojdia ca organism model a prezentat dovezile că canabidiolul este produs din 2,3-oxidosqualen de către canabidiol sintetaza PEN1 (Xiang et al., 2006), iar expresia căreia este asociată sinergic cu CYP705A1 (Sohrabi et al. ., 2015). Cu toate acestea, reglarea genelor cheie în biosinteza DMNT rămâne în mare parte necunoscută. Gena RPX1 descrisă în acest studiu codifică o nouă proteină de legare a capacului (CBP), care este un membru al familiei de gene a factorului de inițiere eucariotic 4E (eIF4E). La plante, familia eIF4E este formată din eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E și nCBP, care joacă roluri esențiale în inițierea traducerii mARN dependentă de cap (Rhoads, 2009). Membrii familiei eIF4E sunt sursele primare de rezistență recesivă la virusul Y al cartofului (PVY) - cel mai dăunător agent patogen care afectează randamentul și calitatea cartofului, iar utilizarea tehnologiei CRISPR-Cas9 care vizează gena eIF4E1 extinde spectrul de rezistență al virusului Y al cartofului al Solanum tuberosum. (Lucioli și colab., 2022). În mod similar, editarea mediată de CRISPR/Cas9 a izoformelor eIF4E de manioc nCBP-1 și nCBP-2 reduce severitatea și incidența simptomelor cauzate de boala cu dungi brune a maniocului (Gomez et al., 2019). Mai mult, studiile din Arabidopsis demonstrează că deficiența de nCBP joacă un rol în limitarea mișcării de la celulă la celulă a virusurilor vegetale (Keima et al., 2017). Cu toate acestea, funcția nCBP în apărarea erbivoră nu a fost raportată. Aici, folosim o abordare integrativă pentru a caracteriza funcțional gena Arabidopsis RPX1, care joacă un rol important în rezistența plantelor la P. xylostella. Rezultatele noastre indică faptul că distrugerea RPX1 are ca rezultat gene exprimate diferențial (DEG) și acumularea de compuși. Una dintre genele supraregulate este PEN1, care este cheia pentru biosinteza DMNT. Infestarea mutantului rpx1 și acumularea de DMNT afectează structura PM a P. xylostella și provoacă defecte de dezvoltare a larvelor și moartea. Dovezi suplimentare demonstrează că infestarea și rănirea cu P. xylostella induc degradarea proteinei RPX1, care, la rândul său, poate duce la rezistența plantelor la insecte.

2|MATERIALE ȘI METODE

2.1|Materiale vegetale și condiții de creștere

Semințele de Arabidopsis au fost comandate de la Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC, http://Arabidopsis.info/). Semințele au fost sterilizate la suprafață, semănate pe mediu Murashige și Skoog (MS) și stratificate la 5 grade într-o cameră de creștere sub o fotoperioadă de scurtă zi (8 ore lumină, 16 ore întuneric) timp de 3 zile. Au fost apoi transferați la 22 de grade în seră sub o fotoperioadă de zi lungă (16 ore lumină, 8 ore întuneric) cu întreținere normală a plantei.

2.2|Experimente și teste biologice cu alegere (preferință) și fără alegere

Ouăle de P. xylostella au fost achiziționate de la Henan Jiyuan Baiyun Company (Cat: HJB004, dezvoltat în 2009, propagat pentru cercetare științifică într-un mediu controlat) și incubat într-o cameră de creștere setată la 26 de grade, 16 ore lumină/8 ore întuneric. Pentru experimente de alegere, am transferat plante Arabidopsis de 3 săptămâni (opt plante de tip sălbatic și, respectiv, mutante) în rezervoare de testare care au fost conectate la fiecare capăt al eprubetei de sticlă, iar etapele experimentale rămase au fost efectuate așa cum este descris anterior ( Chen și colab., 2021). Au fost utilizate larvele din stadiul al patrulea și 15 larve au fost incluse în fiecare replica experimentală.

Pentru experimentul fără alegere, plantele de tip sălbatic și mutante de 3 săptămâni au fost transferate în plăci Petri separate și semi-deschise conținând același număr de 15 larve de P. xylostella de s-instar. Etapele ulterioare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Chen și colab., 2021).

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

2.3|Screeningul mutanților Arabidopsis rezistenți împotriva P. xylostella

Am colectat 179 mutanți de inserție de ADN-T ai Arabidopsis pentru screeningul rezistenței la P. xylostalle. Mutanții au fost cultivați pe mediu MS și transplantați în ghivece P7 (dimensiune: 7 × 7 cm) în condiții de creștere de zi lungă (22 grade, 16 ore lumină/8 ore întuneric). Pentru a evita potențiala influență a mediului, am mutat și rotit vasele zilnic. Pentru screeningul inițial al mutanților, am configurat două replici prin creșterea fiecărui mutant în două ghivece, cu plante Col-0 ca martor. După 2 săptămâni de creștere după transplant, toți mutanții au fost supuși unui test de preferință al larvelor de P. xylostella din stadiul al treilea, comparându-le cu Col-0, așa cum este descris mai sus. Mutanții care au prezentat preferințe larvare diferite față de Col-0 au fost considerați mutanți rezistenți sau sensibili la candidat și au fost selectați pentru validare experimentală și studii funcționale ulterioare.

2.4|Construcția plasmidelor și transformarea genelor

Pentru constructul RPX1pro: RPX1, regiunea de codificare genomică RPX1 cu o secvență în amonte de 1,6 kb și o secvență în aval de 1 kb a fost amplificată prin PCR din ADN-ul genomic extras din Col-0. Fragmentul de ADN asamblat a fost donat în vectorul pGreenII-{0179 și transformat în mutantul rpx1-1 utilizând metoda floral dip (Clough & Bent, 1998). Pentru a construi RPX1pro: RPX1-GFP, promotorul RPX1 (1,6 kb), regiunea de codificare și secvențele netraduse de 1 kb 3′ au fost amplificate prin PCR din ADN-ul genomic Col-0. Fragmentul GFP a fost amplificat dintr-o plasmidă care conține secvențe GFP. Aceste fragmente de ADN au fost asamblate în vectorul pGreenII-0179 folosind metoda de tăiere și ligare și apoi transformate într-un mutant rpx1-1. Pentru 35Spro: construct RPX1-FLAG, secvențele de codificare RPX1 au fost amplificate prin PCR din ADNc transcris invers din ARNm Col-0. Fragmentul PCR a fost donat într-un vector pCambia1300-FLAG folosind metoda de perfuzie (Clontech) și transformat în Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) și 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Secvențele de codificare ale acestor gene au fost amplificate prin PCR din ADNc-ul Col-0 și legate în vectorul pLGNL-35S. Un microARN artificial (amiR) care vizează PEN1 a fost proiectat așa cum a fost descris anterior (Schwab și colab., 2006), amplificat folosind plasmida pRS300 ca șablon și legat într-o versiune modificată a vectorului pCambia1300m. Toate secvențele de primer sunt listate în Informații justificative: Tabelul S1.

2,5|Teste ale activității glutation s-transferazei (GST) și citocromului P450 (CYP450) la larvele de P. xylostella

După ce larvele de P. xylostella din stadiul al doilea au fost hrănite cu răsaduri Col-0 sau rpx1-1 timp de 72 de ore, acestea au fost colectate și măcinate până la o pulbere fină în azot lichid. Testele au fost efectuate folosind kituri de analiză a activității GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, cat: A004) și CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, cat: P450), conform instrucțiunilor producătorului. Fiecare test a avut trei replici biologice și fiecare replicat a cuprins 30 larve de P. xylostella.

2,6|Testele ștrumfului

Răsadurile Col‐0 sau rpx1‐1 de trei săptămâni au fost folosite pentru a hrăni larvele de P. xylostella din stadiul al doilea. Testul a fost efectuat așa cum a fost descris anterior, cu modificări minore (Chen și colab., 2021). Au fost utilizate șase replici biologice și fiecare replicat a conținut 15 larve de P. xylostella.

2,7|Observarea microscopică a structurii PM a larvelor

Analiza anatomică a structurii PM larvelor și analiza secțiunii transversale a parafinei a intestinului larvei a fost efectuată așa cum a fost descris anterior (Chen și colab., 2021).

2,8|Analiza expresiei genelor și secvențierea transcriptomului (ARN-seq)

Răsadurile de Col-{{0}} și rpx1-1 au fost cultivate în condiții de creștere de zi lungă (16 ore de lumină, 8 ore de întuneric) la 22 de grade. Pentru secvențierea transcriptomului au fost utilizate răsaduri de Col-0 și rpx1-1 de două săptămâni. Fiecare probă a conținut trei replici biologice. ARN total a fost extras folosind kitul RNAprep Pure Plant (TIANGEN, număr de catalog: DP441). ADNc-urile de prima catenă au fost sintetizate prin transcripție inversă folosind sistemul One-Step RT (Takara Bio) conform instrucțiunilor producătorului. qRT-PCR a fost efectuată cu primerii specifici genei enumerați în Informații suport: Tabelul S1 pe un instrument Roche Light Cycler 480. Construcția și secvențierea bibliotecilor ARN-seq au fost efectuate folosind Biomarker (Beijing, China) pe o platformă Illumina HiSeq. În cele din urmă, am folosit edgeR pentru a efectua analiza expresiei diferențiale (pragul diferenței semnificative a fost stabilit:|log2foldchange|Mai mare sau egal cu 1, p < 0,05). Au fost efectuate trei replici biologice pentru Col-0 și rpx1-1, iar genele exprimate diferențial sunt enumerate în setul de date S1.

2,9|Extracție și analiză prin cromatografie în gaz și spectrometrie de masă (GC-MS) a DMNT și DMNT-2 H în Arabidopsis

Extracția și analiza DMNT au fost efectuate așa cum a fost descris anterior, cu modificări minore (Sohrabi și colab., 2015). În teste, 2 g de răsaduri de Arabidopsis de 3 săptămâni au fost utilizate pentru extracția și măsurarea DMNT.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Pregătirea și caracterizarea DMNT

DMNT a fost sintetizat așa cum a fost descris anterior, cu modificări minore (HJ Huang & Yang, 2007). Pe scurt, un balon cu fund rotund de 500 ml echipat cu o bară de agitare magnetică acoperită cu teflon a fost încărcat cu 1 g (6,48 mmol) de alcool alilic și 50 ml de diclormetan. Soluția a fost agitată energic și tratată cu 3,6 g de dioxid de mangan activ, urmată de adăugarea a 1-2 g de oxidant la fiecare 2-3 ore până la terminarea reacției. Produsul a fost apoi utilizat pentru a genera compusul dorit printr-o reacție de știință. Structura și puritatea DMNT au fost confirmate prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) 1 H și abordări spectroscopice 13C RMN.

2.11|Tratamentul DMNT al P. xylostella

Testele au fost efectuate în vase Petri acoperite cu folii de plastic transparent, cu găuri multiple. DMNT a fost diluat în ulei de parafină (Sigma-Aldrich) la doza dorită (2,5 nmol/L-25 μmol/L) și injectat în furaje așa cum este descris în text. Toate testele au fost efectuate în șase replici biologice, fiecare replicat constând din 15 larve. Creșterea larvelor a fost înregistrată prin documentație fotografică. Ca martor a fost folosit furaj injectat cu același volum de solvent de ulei de parafină.

2.12|Măsurarea conținutului de JA și SA la răsadurile de Arabidopsis

Testele au fost efectuate de Nanjing Convinced-test Technology Company. Răsadurile Col-{{0}} și rpx1-1 de două săptămâni au fost infestate cu 15 larve de P. xylostella s-instar, cu răsaduri neinfestate ca martor. Am plasat două larve pe fiecare plantă din grupul de infestare pentru a ne asigura că toate plantele au fost infestate. După 24 de ore, probele de plante au fost colectate și congelate rapid în azot lichid pentru determinarea JA și SA. Probele au fost măcinate într-o pulbere fină în azot lichid și extrase cu o soluție de extracție izopropanol-apă-acid clorhidric, urmată de adăugarea a 8 ul de acid salicilic deuterat (D-SA) și acid dihidrojasmonic (2HJA) (1 ug). /ml fiecare) ca standarde interne. S-a adăugat apoi diclormetan și soluția a fost amestecată bine pe un rotator timp de 30 min. După ce faza organică inferioară a fost obținută prin centrifugare la 13,{{1{{20}}}} rpm timp de 5 min, a fost uscată cu azot, redizolvată în metanol (0 0,1% acid formic) și apoi centrifugat la 13,000 g timp de 10 min. În cele din urmă, supernatantul a fost filtrat printr-o membrană de filtru organic de 0,22 μm și analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă (HPLC-MS/MS). Toate etapele de extracție au fost efectuate la 4 grade. Identitățile JA și SA au fost determinate pe baza timpului de vârf al substanțelor țintă și a raportului masă-încărcare (m/z) al ionilor corespunzători. Cuantificarea JA și SA a fost ajustată folosind o ecuație de regresie liniară obținută din curbele standard interne. Pentru achiziția curbei standard interne, soluții standard SA și JA cu gradienți de 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 și 200 ng/ml au fost preparate folosind metanol (0,1% acid formic) ca solvent, și soluții standard interne cu o concentrație finală de 20 ng/ml au fost adăugate la graficul real. Anomaliile de liniaritate au fost eliminate din ecuațiile curbelor standard. JA: y=0,853 x + 0,00152 (r=0,9958); SA: y=1,76 x + 0,0403 (r=0,9936).

2.13|Analiza transportului DMNT în Arabidopsis

DMNT a fost dizolvat în DMSO și adăugat la mediul MS fără glucoză. Plantele Arabidopsis vechi de trei săptămâni au fost transferate în eprubete și rădăcinile lor au fost scufundate într-un mediu MS cu DMNT sau DMSO (martor). Pentru a preveni contaminarea, eprubetele au fost acoperite cu două straturi de parafilm și a fost făcută o mică gaură în peliculă, prin care rădăcinile plantelor au fost poziționate în mediu MS pentru creșterea ulterioară. După 24 de ore, rădăcinile plantelor tratate au fost îndepărtate și frunzele acestora au fost folosite pentru a hrăni P. xylostella, iar apoi au fost analizate ratele de supraviețuire a larvelor și pupație. Același experiment a fost repetat cu un mediu de creștere care conține fie DMNT marcat cu 2 H, fie DMSO ca martor. După 24 de ore de incubație, frunzele au fost colectate și procesate pentru analiza GC-MS. Pentru a exclude posibilitatea ca DMNT să se volatilizeze din mediul DMNT în părțile aeriene și să provoace contaminarea urmăririi, a fost înființat un grup de control în același mod, dar rădăcinile plantelor au fost îngropate cu bumbac umed și nu au fost scufundate în mediu DMNT. După 24 de ore, părțile aeriene au fost recoltate pentru teste biologice suplimentare sau detectarea DMNT folosind GC-MS.

Beneficiile cistanche tubulosa- intareste sistemul imunitar

2.14|Extracția proteinelor și analiza imunoblotării RPX1 la Arabidopsis după infestarea cu P. xylostella și tratamentele rănilor

Am stabilit două tipuri de tratamente pe RPX1pro transgenic: RPX1‐GFP și 35Spro: RPX1‐FLAG răsaduri Arabidopsis: infestarea și rănirea cu P. xylostella. Pentru infestarea larvară, am crescut răsaduri de Arabidopsis timp de 2 săptămâni și le-am hrănit larvelor de stadiul al doilea (așezați cel puțin o larvă pe fiecare răsad), după 15-120 min, larvele au fost îndepărtate, iar răsadurile infestate au fost selectate și recoltate pentru experimente ulterioare. Pentru a imita rănirea, am folosit un ac dintr-o seringă de 1 ml pentru a crea o gaură în fiecare frunză de Arabidopsis. După 15-120 min de creștere, răsadurile au fost colectate.

Pentru a determina dacă plantele infestate cu P. xylostella ar putea induce degradarea RPX1, am infestat răsadurile de Col‐0 cu P. xylostella timp de 15-120 min și am testat influența acestuia asupra RPX1-GFP în plante transgenice. Toate probele au fost măcinate în pulbere în azot lichid, apoi cantități egale de Col-0 infestate și neinfestate au fost amestecate separat cu aceeași cantitate de țesuturi RPX1-GFP și incubate în soluție la 4 grade timp de 15 minute. În cele din urmă, amestecul a fost centrifugat, iar supernatantul a fost supus analizei de imunoblot. Pentru analiza Western blot, proteinele totale au fost extrase cu tampon de extracție a proteinelor [50 mmol/L Tris‐HCl pH8,0, 2,5 mmol/L EDTA pH8,0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10% glicerol (v/v), 7% 2-mercaptoetanol (v/v), 1 mmol/L PMSF și 1 × cocktail inhibitor de proteinază (Roche)]. Extractul proteic a fost apoi utilizat pentru separarea PAGE și analiza imunoblotting cu anticorpi împotriva GFP (Roche, diluție: 1/1000) și FLAG (Abcam, diluție: 1/2000). Imaginile au fost capturate folosind un sistem de analiză cu chemiluminiscență Tanon 5200.

3|REZULTATE

3.1|Mutantul Arabidopsis rpx1 a îmbunătățit rezistența la P. xylostella

Pentru a identifica genele implicate în rezistența la P. xylostella, am colectat 179 de mutanți Arabidopsis și i-am crescut într-o seră controlată. La două săptămâni după transplant, am efectuat un test de preferință al larvelor de P. xylostella din stadiul al treilea, ca răspuns la fiecare Col-0 mutant și de tip sălbatic. În acest experiment de screening, 15 mutanți au arătat influențe diferite asupra preferinței larvelor (datele nu sunt prezentate), iar unul dintre ei a fost selectat pentru acest studiu și desemnat ca rpx1-1 (rezistența la P. xylostella). RPX1 codifică o nouă proteină de legare a capacului (nCBP) (Ruud și colab., 1998). Mutantul de inserție ADN-T a fost SALK_131503, iar expresia genei RPX1 a fost redusă semnificativ în comparație cu Col-0 de tip sălbatic (Figura 1a, Informații justificative: Figura S1a, Informații suport: Tabel S1). Când au fost plantate în apropiere, plantele rpx1-1 au prezentat un nivel semnificativ mai scăzut de daune de către larvele P.xylostella în comparație cu plantele de tip sălbatic (Informații justificative: Figura S1b).

FIGURA 1 Inactivarea RPX1 conferă rezistență Plutella xylostella la Arabidopsis. (a) Structura genei a RPX1 (At5g18110). Casetele portocalii indică exonii, iar liniile continue reprezintă intronii și regiunile netraduse. Inserția T-ADN în SALK_131503, denumită rpx1-1, se află pe al patrulea exon. (b) Larvele de P. xylostella se deplasează de preferință către liniile de complementare de tip sălbatic Col-0 și RPX1 (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1-1, RPX1com), în comparație cu rpx1-1. (c) Comparația Col- 0, rpx1‐1 și frunzele RPX1com infestate cu P. xylostella. (d) Larvele de P. xylostella au fost grav afectate de rpx1-1, în comparație cu cele de pe liniile de tip sălbatic Col-0 și RPX1com, în ceea ce privește statura, mărimea și culoarea larvelor. (e, f) Larvele de P. xylostella hrănite cu rpx1-1 prezintă o mortalitate mai mare (e) și rate mai mici de pupație (f) în comparație cu liniile de tip sălbatic Col-0 și RPX1com. (g, h) Larvele de P. xylostella hrănite cu plante rpx1-1 au activități crescute de glutation S-transferaza (GST, g) și citocrom P450 (CYP450, h), în timp ce la larvele hrănite cu RPX1com, activitățile nu au arătat nicio diferență față de cele pe Col-0. În (b, e–h), datele sunt prezentate ca medie ± sem. Diferitele litere la fiecare tratament indică o diferență semnificativă (analiza unidirecțională a varianței, n=3 pentru b, g, h, n {{ 36}} pentru e, f).

Pentru a determina mecanismul care stă la baza rezistenței rpx1-1 la infestarea cu P. xylostella, am efectuat teste de preferință și fără alegere. În experimentele de preferință, larvele de P. xylostella au fost plasate în centrul eprubetei de sticlă la o distanță egală de răsaduri de Col‐0 și rpx1‐1, după 10–6{{11} } min, semnificativ mai multe larve adunate pe partea Col‐0 decât cele de pe partea rpx1‐1 (Figura 1b). În experimentele fără alegere, am hrănit răsaduri Col-0 și rpx1-1 separat larvelor de P. xylostella și am observat că Col-0 a pierdut mai multe țesuturi de frunze decât mutantul rpx1-1 (Figura 1c). Pentru a confirma că RPX1 a fost gena cauzală pentru rezistența observată, am introdus un construct de completare a RPX1 în mutantul rpx1-1. Aceste linii de completare RPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) au fost susceptibile la infestarea cu P. xylostella, așa cum este determinat de testele de preferință și fără alegere (Figura 1b, c), care sugerează că RPX1 este implicat în rezistența Arabidopsis la P. xylostella.

3.2|Creșterea larvelor de P. xylostella este afectată negativ de mutația rpx1-1

Pentru a investiga răspunsul fiziologic al P. xylostella la hrănirea cu mutanți rpx1-1, am inspectat dezvoltarea larvelor după hrănirea cu plante vechi de 3 săptămâni din liniile Col-0, rpx1-1 și RPX1com. Larvele hrănite cu plante rpx1‐1 au prezentat o dezvoltare grav compromisă în ceea ce privește dimensiunea corpului. Culoarea corpului larvelor a fost, de asemenea, diferită de cea a larvelor hrănite cu plante Col‐0. Cu toate acestea, nu am observat astfel de modificări la larvele hrănite cu răsaduri RPX1com (Figura 1d). O analiză fenotipică ulterioară a arătat că larvele de P. xylostella hrănite cu rpx1-1 au avut o mortalitate semnificativ mai mare și rate mai mici de pupație decât cele hrănite cu Col-0 sau RPX1com (Figura 1e, f). În plus, larvele hrănite cu rpx1‐1 au prezentat activități enzimatice mai mari ale GST și CYP450, care sunt biomarkeri pentru deteriorarea organelor sau țesuturilor (Cheng și colab., 2018; Mikstacki și colab., 2015), decât cele de pe Col-0 și RPX1com (Figura 1g, h), sugerând că țesutul larvar ar putea fi rănit de hrănirea cu rpx1-1.

3.3|Larvele intestinului mediu al P. xylostella sunt deteriorate după hrănirea cu plante rpx1‐1

Am observat că larvele hrănite cu rpx1‐1 au consumat mai puține țesuturi de plante și au produs mult mai puține fecale decât cele hrănite cu Col‐0 de tip sălbatic; prin urmare, am emis ipoteza că digestia larvelor hrănite cu rpx1‐1 ar putea fi afectată. Pentru a verifica dacă s-au produs scurgeri în intestinul larvelor hrănite cu rpx1‐1, am efectuat „testul ștrumf”. Larvele hrănite cu linii Col-0 și RPX1com de tip sălbatic au defecat colorantul și niciun colorant nu a fost lăsat vizual în corpul larvelor, în timp ce larvele hrănite cu rpx1-1 au păstrat o cantitate semnificativă de colorant în intestinul mediu și țesuturile din jur, iar larvele au devenit albastre (Figura 2a). Analiza cantitativă a larvelor albastre („Ștrumf”) și normale („fără ștrum”) a arătat că hrănirea plantelor rpx1‐1 a dus la mai mult de trei ori indivizi care prezintă „Ștrumf” în comparație cu cei hrăniți cu Col-{{ de tip sălbatic. 14}} sau RPX1com (Figura 2b). Aceste rezultate sugerează că hrănirea cu rpx1-1 poate provoca leziuni și o permeabilitate mai mare în intestinul mediu al larvelor.

3.4|Matricea peritrofică a P. xylostella este deteriorată prin hrănirea răsadurilor rpx1‐1

Am disecat și izolat în continuare matricea peritrofică (PM) din larvele hrănite cu răsaduri Col-{{{{{}}}}, rpx1-1 și RPX1com pentru analiza structurală sub un stereomicroscop. În comparație cu PM intactă și plumbă a larvelor hrănite cu Col-0 și RPX1com, larvele hrănite cu rpx1-1 au prezentat caracteristici de deteriorare și au fost subțiri, libere și discontinue (Figura 2c-f). Pentru a confirma în continuare caracteristicile de deteriorare ale PM, am obținut secțiuni transversale ale probelor de larve. Rezultatele colorării cu hematoxilin-eozină (HE) au arătat că PM-ul larvelor hrănite cu Col-0 era gros și intact și că exista un spațiu ectoperitrofic (ES) între PM și celulele epidermice ale intestinului mediu (Figura 2g). În schimb, PM din intestinul mediu al larvelor hrănite cu rpx1-1 a fost sever perturbată, iar conținutul intestinal a fost aproape de peretele intestinal (fără es, Figura 2h). Când larvele au fost hrănite cu răsaduri RPX1com, PM și ES lor nu au fost modificate semnificativ (Figura 2i, j). Aceste rezultate confirmă că distrugerea RPX1 a rănit PM larvelor de P. xylostella.

3,5|Acumularea conținutului de DMNT în rpx1‐1 conferă rezistență larvelor de P. xylostella

Pentru a investiga dacă distrugerea RPX1 remodelează metaboliții Arabidopsis și duce la rezistența la larvele de P. xylostella, am comparat compușii organici volatili (COV) eliberați de rpx1‐1 și plantele de tip sălbatic Col‐0. Patru COV (Hexanol, 3-etil-5metil, Octance, 2,6-dimetil, Nonan, 2,6-dimetil și DMNT) au fost acumulate diferențiat între rpx1-1 și Col-0 (Figura 3a). Pentru a diseca în continuare mecanismul molecular al rpx1-1 în rezistența la P. xylostella, am efectuat analiza ARN-seq. În comparație cu Col-0, mutantul rpx1-1 a prezentat 211 gene exprimate diferențial (DEG) (Informații de sprijin: Setul de date S1). Analiza de îmbogățire KEGG a indicat că aceste DEG aparțineau la mai mult de 20 căi metabolice diferite, inclusiv biosinteza sesquiterpenoid și triterpenoid, metabolismul acidului alfa-linolenic și căile metabolismului tirozinei (Figura 3b, Informații justificative: Tabelul S2). În special, calea cea mai semnificativ îmbogățită a fost biosinteza sesquiterpenoidelor și triterpenoidelor, care a constat din trei DEG: At4g15340, At5g42600 și At5g48010 (Figura 3b, Informații justificative: Figura S2a-c). S-a raportat că At4g15340 codifică PEN1, o oxidosqualen ciclază care transformă 2,3-oxidosqualenul în arabidiol și conduce la sinteza DMNT bioactiv prin CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi și colab., 2015). At5g42600 codifică mineral sintaza 1 (MRN1), care este o componentă cheie în biosinteza minerală. At5g48010 codifică pentru talianol sintetaza (THAS), o enzimă implicată în biosinteza talianolului. S-a raportat că marneralul și talianolul sunt implicați în menținerea dezvoltării plantelor (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Informații justificative: Figura S3). Am studiat rolurile potențiale ale MRN1 și THAS în rezistența la insecte prin investigarea preferinței, mortalității și ratelor de pupație ale P. xylostella prin hrănirea lor cu răsaduri transgenice de Arabidopsis care supraexprimă MRN1 (35Spro: MRN1) și THAS (35Spro: THAS) (Sprijin). Informații: Figura S4a,b). Nu a fost detectată nicio diferență semnificativă între cele două transgene și Col-0 de tip sălbatic (Informații suport: Figura S4c-n), sugerând că rezistența insectelor a rpx1-1 nu depinde probabil de aceste două gene.

FIGURA 2 Inactivarea RPX1 dăunează structurii matricei peritrofice (PM) în intestinul mediu larvar. (a) Imagini reprezentative ale larvelor hrănite cu linii Col‐0, rpx1‐1 și RPX1com care arată reținerea coloranților, așa cum demonstrează aspectul lor albastru, cum ar fi personajul de desene animate Smurf. (b) Cuantificarea rezultatelor este prezentată în (a). Datele sunt prezentate ca medie ± sem; diferitele litere indică o diferență semnificativă (analiza unidirecțională a varianței, n=6). (c–f) Ultrastructura PM a larvelor hrănite cu linii Col-0 (c), rpx1-1 (d) și RPX1com (e, f). Rețineți că PM-ul larvelor hrănite cu Col-0 și RPX1com este plin și intact, dar PM-ul larvelor hrănite cu rpx1-1 este subțire, delicat și discontinuu în unele regiuni. (g–j) Secțiunea transversală și colorarea cu hematoxilin-eozină arată deteriorarea PM de la larvele hrănite cu linii Col-0 (g), rpx1-1 (h) sau RPX1com (i, j). [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

Îmbogățirea biosintezei terpenoidelor în analiza KEGG (Figura 3b) și acumularea diferențială de DMNT detectată în rpx1-1 (Figura 3a) au sugerat că DMNT ar putea fi unul dintre compușii implicați în rezistența plantelor la P. xylostella. Similar cu rapoartele anterioare care abia detectaseră DMNT prin analiza GC-MS în Col-0 (Liu și colab., 2018; Sohrabi și colab., 2015), am putea detecta urme de DMNT în Col‐0 neinfestat (Figura 4a,b). În schimb, nivelurile de DMNT au fost foarte îmbogățite (~ 8 ng/g) în rpx1-1, iar liniile RPX1com au prezentat niveluri foarte scăzute de DMNT, similar cu cel din plantele Col-0 (Figura 4). În plus, după infestarea cu P. xylostella, nivelurile de DMNT au crescut (~20 ng/g) în rpx1‐1, care a fost mai mare decât cea din liniile Col‐{0 și RPX1com (Figura 4) . Am sintetizat DMNT in vitro folosind o metodă modificată (Chen et al., 2021). În concordanță cu observațiile anterioare (Chen și colab., 2021), DMNT a suprimat creșterea P. xylostella, după cum evidențiază preferința (2,5 μmol/L) și performanța fără alegere (0,25-25 μmol/L) ( Informații justificative: Figura S5a,b). Mai mult, rezultatele colorării HE au arătat că PM-ul larvelor martor a fost gros și intact (Informații justificative: Figura S5c), în timp ce PM al larvelor tratate cu 2,5 μmol/L DMNT timp de 48 de ore a fost subțire și discontinue în unele regiuni (Informații justificative: Figura S5d). Luate împreună, descoperirile noastre sugerează că mutația rpx1-1 cauzează acumularea de DMNT, care contribuie la uciderea larvelor de P. xylostella la Arabidopsis. JA și SA sunt metaboliți secundari ai plantelor care sunt strâns legați de stresul biotic. Pentru a determina dacă aceste substanțe contribuie la rezistența insectelor a rpx1‐1, am verificat nivelurile JA și SA ale Col‐0 și rpx1‐1 înainte și după infestarea cu P. xylostella. În condiții netratate, nu a existat nicio diferență semnificativă în nivelurile de JA și SA între plantele rpx1-1 și Col-0 (Informații justificative: Figura S6), iar nivelurile ambilor hormoni au crescut semnificativ la 24 de ore după infestarea cu P. xylostella. . În mod remarcabil, după infestare, conținutul de SA a fost semnificativ mai mic în rpx1-1 comparativ cu Col-0, în timp ce conținutul de JA a fost mult mai mare în rpx1-1 decât în ​​Col-0 (Informații justificative: Figura S6).

FIGURA 3 Comparația compușilor volatili și expresia genelor îmbogățite diferențial între Col‐0 și rpx1‐1. (a) Compușii volatili îmbogățiți diferențial în Col-0 și rpx1-1 au fost detectați prin metoda cromatografiei gazoase-spectrometrie de masă (GC-MS). Datele sunt prezentate ca medie ± sem; asteriscurile indică o diferență semnificativă (*p < 0.05, **p < 0.01, test t neîmperecheat cu două cozi). (b) Analiza transcriptomică a Col-0 și rpx1-1. Analiza KEGG a îmbogățirii căilor din gene exprimate diferit între Col-0 și mutantul rpx1-1. O cale îmbogățită (săgeata roșie) este legată de biosinteza sesquiterpenoid și triterpenoid și constă din trei gene, așa cum se arată în figură. [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

3,6|RPX1 reglează acumularea de DMNT în funcție de PEN1

Pentru a investiga contribuția PEN1 în acumularea de DMNT reglată rpx1-1, am generat un construct care conține un miARN artificial (PEN1amiR) și l-am transformat în mutanți rpx1-1. De asemenea, am generat un construct de supraexpresie PEN1, care a fost transformat în Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{0}}). Analiza expresiei genice a arătat că PEN1 a fost doborât (4-7 ori) în PEN1amiR/rpx1-1 în comparație cu cel al rpx1-1 și a fost supraexprimat (~2,5 ori) în 35Spro: PEN1 în comparație cu Col-0 (Figura 5a). În aceste linii transgenice, expresia RPX1 nu a fost influențată de deprimarea sau supraexpresia PEN1 (Figura 5b). Când a fost infestat cu P. xylostella timp de 6-24 de ore, expresia PEN1 a fost semnificativ upregulată în Col-0 și rpx1-1, iar expresia PEN1 mult mai mare a fost obținută în rpx1-1 după 24 de ore de infestare (Figura 5c) . Apoi, am măsurat conținutul DMNT în Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 și 35Spro: PEN1/Col-{{50}}. Fără infestarea cu P. xylostella, rpx1-1 a produs niveluri mai mari de DMNT decât Col-0 (Figura 5d,e,f,k,l) ​​și când PEN1 a fost doborât de microARN artificial în rpx1-1 (PEN1amiR) /rpx1-1), nivelurile DMNT au fost reglate în jos, prezentând un nivel mult mai scăzut decât cel din rpx1-1 (Figura 5d,g,h,m,n). La infestarea larvară, nivelurile de DMNT la răsadurile Col-0 și rpx1-1 au fost semnificativ supraregulate, dar la răsadurile PEN1amiR/rpx1-1, nivelul DMNT nu a putut fi indus și a fost mult mai scăzut decât cel din rpx1-1 (Figura 5d, g,h,m,n), sugerând că PEN1 poate juca un rol important în biosinteza DMNT reglată de RPX1, așa cum este ilustrat în Informații de sprijin: Figura S3. În concordanță cu aceasta, DMNT a fost foarte acumulat în răsaduri 35Spro: PEN1/Col-0 (Figura 5d, i,j,o,p).

FIGURA 4 Pierderea RPX1 crește acumularea de dimetil-1,3,7-nonatrienă (DMNT). (a) analiza prin cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS) a DMNT în liniile Col-0, rpx1-1 și RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1). Standardul DMNT este afișat în partea de jos. (b) Cromatografia ionică totală (TIC) a DMNT capturată din Col-0, rpx1-1 și RPX1com. (c) Conținutul de DMNT crește în mutantul rpx1-1, dar revine la niveluri de tip sălbatic în plantele transgenice RPX1com. Datele sunt prezentate ca medie ± sem; diferitele litere indică o diferență semnificativă (analiza unidirecțională a varianței, n=3). [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

3,7|PEN1 contribuie la uciderea P. xylostella în rpx1‐1

Având în vedere observația că knockdown PEN1 ar putea atenua acumularea de DMNT indusă de inactivarea RPX1 (Figura 5), ​​am efectuat biotesturi asupra PEN1 knockdown și supraexpresia Arabidopsis transgenic pentru a demonstra rolul său biologic. Am descoperit că larvele de P. xylostella nu au arătat preferințe pentru plantele amiR-PEN1/rpx1-1 în comparație cu Col-0 (Informații justificative: Figura S7). Între timp, larvele de P. xylostella hrănite cu PEN1-amiR/rpx1-1 au prezentat o mortalitate semnificativ mai mică și rate mai mari de pupație decât rpx1-1, în timp ce larvele hrănite cu 35Spro: PEN1/Col-0 au prezentat o mortalitate mai mare și o pupație mai mică. rate decât cele hrănite cu Col‐0 (Figura 6a,b). În concordanță cu aceste rezultate, experimentele ulterioare „Testul Smurf” și secțiunea transversală au arătat că PEN1-amiR/rpx1-1 a avut intestine și PM normale și intacte în comparație cu larvele hrănite cu rpx1-1 (Figura 6c,d,g,h), și supraexprimarea PEN1 a provocat leziuni severe la nivelul intestinului mediu și PM al larvelor P. xylostella (Figura 6c, d, i, j). Aceste rezultate sugerează că distrugerea PEN1 ar putea suprima efectele negative asupra creșterii larvelor cauzate de inactivarea RPX1, jucând astfel un rol important în influența toxică indusă de rpx1-1- asupra larvelor de P. xylostella.

3,8|DMNT transportă de la rădăcini la părțile aeriene ale Arabidopsis 

S-a raportat că PEN1 este exprimat în principal în rădăcinile Arabidopsis (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Informații justificative: Figura S8a), care este diferit de rezultatele pe care le-au arătat părțile aeriene ale rpx1‐1 toxicitatea la P. xylostella într-o manieră dependentă de PEN1 (Figura 6). Prin urmare, am formulat o ipoteză alternativă: plantele sintetizează DMNT în principal în rădăcini și îl transportă în părțile aeriene, unde promovează rezistența la insecte. Pentru a testa această ipoteză, am efectuat două teste de transport DMNT. În primul test (Figura 7a), am incubat rădăcinile răsadurilor de Arabidopsis de 3-3-săptămâni într-un mediu lichid de creștere a plantelor care conține 2,5 μmol/L DMNT, folosind DMSO ca martor. După cultivare timp de 24 de ore, am excizat frunzele de Arabidopsis și le-am oferit larvelor de P. xylostella. În comparație cu controlul DMSO, frunzele plantelor tratate cu DMNT au cauzat o mortalitate semnificativ mai mare a larvelor și rate mai mici de pupație decât martorul (Figura 7b, c). În cel de-al doilea experiment care urmărește să obțină o validare suplimentară independentă a transportului DMNT, am etichetat DMNT cu 2 H și am adăugat DMNT-2 H la mediul lichid de creștere a plantelor. După 24 de ore de incubație, DMNT-2 H a fost foarte îmbogățit în frunze (Figura 7d-i). Pentru a exclude posibilitatea ca DMNT să se volatilizeze din mediul de creștere lichid în aer și să contamineze părțile aeriene ale plantei, am stabilit un control paralel, care a fost efectuat în același mod ca în Figura 7a, cu excepția faptului că rădăcinile Arabidopsis nu au fost scufundate în lichid. mediu de creștere. Rezultatele au arătat că nu a fost detectat DMNT‐2 H în părțile aeriene ale plantelor (Informații justificative: Figura S8b,c). Astfel, propunem ca DMNT să treacă de la rădăcini, unde este produs, la frunzele de Arabidopsis, unde provoacă moartea dăunătorilor.

FIGURA 5 PEN1 contribuie cu un rol important în acumularea de dimetil-1,3,7-nonatrienă (DMNT) în rpx1-1. (a) Analiza expresiei PEN1 în Col-0, rpx1-1, PEN1 knockdown în fundal rpx1-1 (PEN1-amiR/rpx1-1) și supraexpresia PEN1 (35Spro:PEN1/Col-{{2{{ 22}}}}) linii. (b) Expresia RPX1 în Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 și 35Spro:PEN1/Col-0. (c) Expresia PEN1 este indusă de infestarea cu Plutella xylostella în Col-0 și rpx1-1. (d) Comparația acumulării de DMNT între Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 și 35Spro:PEN1/Col-{0. (e–j) analiza prin cromatografie gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS) a substanțelor volatile emise de Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) și 35Spro: linii PEN1/ Col‐0 (i, j). (k–p) TIC al DMNT capturat din liniile Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) și 35Spro: PEN1/Col-0 (o, p) , corespunzătoare datelor din (e–j). În (a–d), datele sunt prezentate ca medie ± sem; diferitele litere indică o diferență semnificativă (analiza unidirecțională a varianței, n=3). [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

3,9|RPX1 este degradat prin infestarea cu P. xylostella și tratamentele pentru răni

Am arătat că expresia PEN1 a fost reglată în creștere în răsadurile rpx1-1 și Arabidopsis infestate cu larve de P. xylostella (Figura 5a, c), creând posibilitatea ca RPX1 să poată răspunde și la infestarea larvelor. Pentru a valida această predicție, am investigat răspunsul potențial al RPX1 la infestarea cu P. xylostella. Analiza expresiei genice a arătat că RPX1 a fost exprimat în diferite țesuturi (Informații de sprijin: Figura S9a), dar nu a avut un răspuns semnificativ la infestarea larvară de 6-24 de ore (Informații de sprijin: Figura S9b). Prin urmare, am verificat nivelurile proteinei RPX1 în plante transgenice RPX1pro: RPX1-GFP prin efectuarea imunoblotării. Rezultatele au arătat că fără infestare larvară, RPX1‐GFP a fost stabil timp de 0-12{{40}} min; în schimb, după infestarea cu larve timp de 15 min, RPX1‐GFP a început să se degradeze; după 120 min, proteina RPX1-GFP a scăzut continuu până la aproximativ 6% din momentul de pornire (Figura 8a, Informații justificative: Figura S10a). Ca control, la răsadurile Arabidopsis care conțin transgena GFP, GFP a fost relativ stabilă după infestarea larvelor (Figura 8b). Pentru a exclude posibila influență a etichetei GFP asupra stabilității RPX1, am generat plante transgenice RPX1 cu o etichetă FLAG (35Spro: RPX1‐FLAG) pentru a efectua experimente de infestare a larvelor, care au arătat rezultate consistente că RPX1‐FLAG ar putea fi, de asemenea, degradat de larve. infestare, similară cu RPX1-GFP (Figura 8c). Infestarea cu insecte cauzează adesea răni la plante, iar daunele fizice pot simula parțial procesul de hrănire al insectelor erbivore. Pentru a demonstra dacă rănirea ar putea induce degradarea RPX1, am folosit un ac pentru a crea găuri în frunzele plantelor pentru a imita rănirea și am constatat că RPX1-GFP s-a degradat după 30 min de tratamente (Figura 8d, Informații justificative: Figura S10b). Pentru a înțelege mai bine motivul degradării RPX1 la infestarea cu P. xylostella, am incubat țesuturile plantelor transgenice RPX1-GFP împreună în soluție timp de 15 minute cu cea de Col-0, care a fost infestată de P. xylostella timp de 15-120 de minute. , sau țesuturi Col-0 fără infestare. Analiza imunoblotting a arătat că nivelul RPX1-GFP din probele incubate cu Col-0 pre-infestat a fost mult mai scăzut decât cele cu Col-0 neinfectat (Figura 8e), sugerând că infestarea cu P. xylostella a indus unii factori sau semnale în Col-0. care ar putea duce la degradarea RPX1.

3.10|Mutația rpx1-1 conferă un avantaj în dezvoltarea și reproducerea plantelor

O caracteristică comună a răspunsurilor de apărare specifice erbivorului este compromisul dintre rezistența dăunătorilor și creșterea și reproducerea plantelor (Li et al., 2018). Pentru a determina dacă genotipul de la locusul RPX1 este supus unor astfel de compromisuri, am comparat producția de semințe în mutanții Col-{{10}} și rpx1-1. În absența infestării cu P. xylostella, randamentul de semințe per plantă a fost similar între cele două genotipuri (Informații justificative: Figura S11). În schimb, expunerea plantelor rpx1-1 și Col-0 de 3 săptămâni la infestarea cu 15 s-instar P. xylostella timp de numai 72 de ore a redus producția finală de semințe de Col-0 de trei ori, în timp ce randamentul de semințe în rpx1‐1 nu a fost afectat semnificativ. Mai mult decât atât, randamentul de semințe al RPX1com a fost similar cu cel al Col-0, dar mult mai mic decât cel al rpx1-1, sugerând că inactivarea RPX1 conferă un avantaj în producția de semințe la infestarea larvelor (Informații de sprijin: Figura S11). De asemenea, am evaluat producția de semințe în Arabidopsis transgenic 35Spro: PEN1 și am observat că supraexprimarea PEN1 a produs un randament mai mare de semințe atât în ​​condiții de larve, cât și în condiții neinfestate (Informații justificative: Figura S11). Aceste rezultate sugerează că mutația rpx1-1 și expresia mai mare a PEN1 conferă rezistență P. xylostella în absența unui compromis de creștere asociat în mod obișnuit, evidențiind potențialul RPX1 și PEN1 în programele de ameliorare moleculară care vizează îmbunătățirea producției de culturi.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

4|DISCUŢIE

Dăunătorii scad dramatic randamentele și calitatea agronomiei, făcând protecția plantelor o prioritate și un obiectiv pe termen lung pentru fermieri și crescători. În acest studiu, am identificat mutantul Arabidopsis rpx1‐1, care a arătat rezistență ridicată la P. xylostella, un important dăunător lepidoptere al culturilor. Analiza noastră a arătat că mutația rpx1-1 a dus la niveluri mai mari de transcriere PEN1, acumulare de DMNT și rezistență îmbunătățită a plantelor împotriva dăunătorilor. De asemenea, am arătat că proteina RPX1 ar putea fi degradată prin infestarea larvelor și tratamentul rănilor.

FIGURA 6 PEN1 contribuie la creșterea rezistenței rpx1-1 la Plutella xylostella. (a, b) Transgena PEN1-amiR atenuează în mod semnificativ rezistența rpx1-1 la infestarea cu P. xylostella, în timp ce 35Spro: PEN1 sporește efectul de rezistență, așa cum este demonstrat de ratele de mortalitate (a) și pupație (b) ale larvelor de P. xylostella . (c) Imagini reprezentative ale larvelor hrănite cu Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 și 35Spro: răsaduri PEN1 care prezintă reținere a colorantului, așa cum demonstrează aspectul lor albastru, cum ar fi desenul animat cu ștrumf. caracter. (d) Rezultatele cuantificării imaginilor prezentate în (c). (e–j) Secțiunea transversală și colorarea cu hematoxilin-eozină arată deteriorarea PM de la larvele hrănite cu Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) și 35Spro: puieți PEN1 (i, j). Datele sunt prezentate ca medie ± sem; diferitele litere la fiecare tratament indică o diferență semnificativă în (a, b, d) (analiza unidirecțională a varianței, n=6). [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

În testele fără alegere, mutantul rpx1-1 a prezentat rezistență semnificativă la infestarea cu P. xylostella (Figura 1c). În schimb, larvele de P. xylostella hrănite cu plante rpx1-1 au prezentat afecțiuni grave de dezvoltare negative (Figura 1d, e). Aceste fenotipuri sunt atribuibile inactivării RPX1, deoarece liniile de complementare RPX1 (RPX1com) sunt la fel de susceptibile ca Col‐0 de tip sălbatic (Figura 1c–e), susținând concluzia că RPX1 este implicat în rezistența dăunătorilor. Pe lângă uciderea larvelor, mutantul rpx1-1 a avut, de asemenea, un efect pe termen lung asupra dezvoltării larvelor, inclusiv pupația (Figura 1f), ceea ce duce la o reproducere redusă a dăunătorului.

FIGURA 7 Dimetil-1,3,7-nonatriene (DMNT) transportă de la rădăcinile Arabidopsis la frunze. (a) Ilustrație a testului de transport DMNT folosind răsaduri de Arabidopsis. DMNT a fost dizolvat în mediu lichid Murashige și Skoog. După o cultură de 24-oră, rădăcinile au fost excizate, iar frunzele au fost folosite pentru a hrăni larvele de Plutella xylostella pentru evaluarea mortalității și a ratei de pupație. (b, c) DMNT, transportat de la rădăcini la frunze, are ca rezultat o mortalitate mai mare (b) și rate mai mici de pupație (c) ale larvelor de P. xylostella. (d–f) DMNT marcat cu 2 H (DMNT-2 H) este transportat de la rădăcină la frunze. DMNT-2 H a fost dizolvat în mediu MS lichid ca în (a) timp de 24 de ore, iar apoi frunzele au fost recoltate pentru analiza GC-MS (e). DMSO a fost utilizat ca martor (d). Standardul DMNT-2 H este prezentat pentru referință (f). (g–i) TIC al DMNT-2 H obținut în timpul testelor de transport prezentate în (d–f). Datele sunt prezentate ca medie ± sem, în (b, c) n=6, valorile p sunt afișate adiacent coloanelor histogramei pentru a indica o diferență semnificativă (test t nepereche cu două cozi). Rețineți că mai multe controale pentru testele de transport sunt incluse în Informații justificative: Figura S8. [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

Mai mult, testele de preferință au indicat că mutanții de tip sălbatic Col-{{0}} și rpx1-1 ar putea emite diferiți compuși volatili; unul dintre ele este DMNT, care este eficient în alungarea dăunătorilor (Figurile 1b, 3a, Informații justificative: Figura S5a). Pe baza rezultatelor de mai sus, propunem că acumularea de DMNT în rpx1‐1 este unul dintre motivele intoxicației cu insecte. S-a raportat că căile de semnalizare JA și SA sunt implicate în rezistența insectelor (Costarelli și colab., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). În acest studiu, după 24 de ore de hrănire cu insecte, conținutul de JA și SA atât în ​​mutanții Col-0, cât și rpx1-1 a crescut, iar creșterea conținutului de SA în rpx1-1 a fost semnificativ mai scăzută decât în ​​Col-0, în timp ce creșterea conținutului de JA a fost mult mai mare (Informații justificative: Figura S6), sugerând că JA și SA pot juca, de asemenea, roluri importante în rezistența rpx1‐1 la P. xylostella. Prin urmare, propunem că atât efectele directe, cât și cele indirecte ale rpx1-1 contribuie la creșterea rezistenței Arabidopsis împotriva insectelor.

FIGURA 8 Degradarea proteinei RPX1 este indusă de infestarea cu Plutella xylostella și tratamentele rănilor. (a) RPX1-GFP de la RPX1pro: plantele transgenice RPX1-GFP sunt degradate la infestarea cu P. xylostella timp de 15-120 min. (b) Ca control pentru (a), GFP în sine de la 35Spro: plantele transgenice GFP nu prezintă nicio degradare la infestarea larvelor. (c) RPX1-flag de la 35Spro: plantele transgenice RPX1-flag sunt degradate la infestarea larvelor. (d) RPX1-GFP de la RPX1pro: plantele transgenice RPX1-GFP sunt degradate de 15-120 min de tratament al rănilor. (e) RPX1-GFP de la RPX1pro: Plantele transgenice RPX1-GFP sunt degradate atunci când țesuturile sunt incubate în soluție cu țesuturile din plantele Col-0 care au fost infestate de P. xylostella timp de 15-120 min. Valorile de mai jos benzile de imun-blotting arată abundența relativă de proteine ​​cuantificată folosind ImageJ. Toate aceste experimente au fost repetate de cel puțin trei ori și sunt prezentate rezultate reprezentative. Mai multe date experimentale cu linii transgenice independente sunt prezentate în Informații justificative: Figura S10. [Figura de culoare poate fi vizualizată la wileyonlinelibrary.com]

Prezentăm câteva linii de dovezi care demonstrează modul în care acumularea DMNT mediată de PEN contribuie la funcțiile RPX1 în rezistența plantelor la P. xylostella. PEN1, o genă cheie aparținând căii de biosinteză sesquiterpenoid și triterpenoid, a fost identificată din analiza KEGG a datelor ARN-seq de la mutantul rpx1-1 (Figura 3b), oferind o legătură între RPX1, PEN1 și DMNT (Sohrabi și colab. , 2015). În sprijinul DMNT ca unul dintre compușii cauzatori care ucid larvele dăunătorilor, DMNT sa acumulat mai mult în mutanții rpx1-1 decât în ​​Col-0 (Figura 3a), dar nivelul din liniile RPX1com a fost inversat la Col-0 ( Figura 4a–c). În plus, DMNT sintetizat chimic ar putea respinge și ucide larvele de P. xylostella (Informații justificative: Figura S5a,b), ceea ce este în conformitate cu rezultatele rpx1‐1 (Figura 1b,e). În plus, plantele transgenice care supraexprimă PEN1 au produs mai mult de patru ori DMNT în Col-0 și au conferit P. xylostella rezistență similară cu rpx1-1 (Figurile 5d, i,j,o,p și 6).

Important, reducerea nivelurilor de transcriere PEN1 în rpx1-1 blochează biosinteza DMNT (Figura 5d,g,h,m,n) și atenuează efectul de distrugere asupra larvelor P. xylostella, care sunt susceptibile la infestarea cu P. xylostella (Figura 6a,b). ). Aceste rezultate combinate indică faptul că mutația PEN1 poate suprima funcția inactivării RPX1 în rezistența dăunătorilor. Leziunea RPX1 provoacă o abundență mai mare a PEN1 (Figura 5a), cu toate acestea, modul în care RPX1 reglează exact PEN1 și mediază biosinteza DMNT necesită studii suplimentare. Deoarece RPX1 este prezis ca o proteină nouă de legare a capacului aparținând familiei eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud și colab., 1998), este posibil ca RPX1 să afecteze PEN1 prin influențarea stabilității ARNm sau a eficienței translației proteinei, ceea ce va fi un factor important. subiect în studiul viitor. Mai mult, trebuie remarcat faptul că nivelurile de DMNT ar putea fi încă induse la un nivel mai ridicat de infestarea cu P. xylostella la mutantul rpx1-1 (Figura 5d), sugerând că ar putea exista și alte căi care reglează acumularea de DMNT independente de RPX1. DMNT a fost detectat într-o gamă largă de specii de plante, cum ar fi Arabidopsis (Sohrabi și colab., 2015), bumbac (Liu și colab., 2018) și porumb (Richter și colab., 2016). În plus, conferă protecție indirectă împotriva dăunătorilor ierbivori prin atragerea prădătorilor, permițând plantelor să îndepărteze amenințările dăunătorilor (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Am raportat recent că ar putea respinge și ucide larvele de P. xylostella prin deteriorarea PM din intestinul mediu larvar (Chen și colab., 2021). Aici, am constatat că structura PM ar putea fi grav deteriorată atunci când larvele au fost hrănite cu răsaduri care supraexprimă rpx1-1 sau PEN1 (Figurile 2c–j și 6i,j). Aceste rezultate sunt în concordanță cu constatările din experimentele de tratament cu DMNT pe care le-am descris anterior (Chen et al., 2021), susținând din nou propunerea conform căreia acumularea de DMNT în rpx1-1 poate fi unul dintre factorii care contribuie la repulsia și moartea dăunătorilor. RPX1 aparține familiei de gene eIF4E (Rhoads, 2009) și este implicat în mișcarea de la celulă la celulă a virusurilor vegetale (Keima et al., 2017). Cu toate acestea, rămâne neclar dacă acumularea DMNT se leagă de rezistența virală a plantelor. PEN1 este exprimat în mod specific în rădăcinile Arabidopsis, unde catalizează biosinteza DMNT (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

În mod constant în acest studiu, am detectat o expresie ridicată a PEN1 în rădăcini și o expresie foarte scăzută în frunze (Informații de sprijin: Figura S8a). Am observat că frunzele mutantului rpx1-1 au fost toxice pentru larvele de P. xylostella (Figura 1), sugerând că acumularea de DMNT și rezistența asociată a dăunătorilor în frunze nu poate fi explicată pur și simplu prin expresia minută a PEN1 în aceste țesuturi. În mod semnificativ, am descoperit că DMNT ar putea fi transportat de la rădăcinile plantelor în părțile aeriene, așa cum se arată prin testele de transport DMNT și analiza GC-MS a extractelor de frunze de la plantele incubate cu DMNT-2 H la rădăcini (Figura 7). Modul în care acest compus este transportat în interiorul plantelor nu este clar și poate fi un subiect pentru investigații suplimentare. Plantele au capacitatea de a tolera și de a lupta împotriva atacurilor insectelor în diferite moduri. Aici, prin efectuarea unei analize de imunoblotare a plantelor transgenice RPX1pro: RPX1‐GFP și 35Spro: RPX1‐FLAG, am constatat că, la infestarea cu P. xylostella, proteina RPX1 ar putea fi degradată rapid (Figura 8a,c, Informații suport: Figura S10a), în timp ce , la nivelul expresiei ARNm, RPX1 a rămas neafectat (Informații de sprijin: Figura S9b). În prezent, modul în care este degradată proteina RPX1 rămâne neclar, dar datele noastre au sugerat în primul rând că mecanismul de degradare a proteinei poate fi implicat în căile de semnalizare ale rănilor (Figura 8d, Informații justificative: Figura S10b).

Mai mult decât atât, Col‐0 pre-infestat cu P. xylostella a indus degradarea RPX1‐GFP în diferite plante (Figura 8e), sugerând că infestarea cu P. xylostella poate provoca o acumulare de semnale în plante care, la rândul lor, ar putea duce la Degradarea RPX1. Va fi interesant să ne dăm seama de identitatea semnalelor în viitor. Această caracteristică a degradării RPX1 este importantă pentru plante, ceea ce poate duce la acumularea de DMNT și poate oferi un răspuns rapid la daunele dăunătorilor (Informații de sprijin: Figura S3). Toleranța crescută a plantelor la dăunători vine adesea în detrimentul fitnessului. Observația că mutația rpx1-1 duce la o rezistență sporită (Figura 1) și la o producție mai mare de semințe (Informații justificative: Figura S11) în Arabidopsis fără compromisuri semnificative oferă o cale promițătoare pentru cultivarea culturilor cu rezistență mai mare la dăunători. De exemplu, editarea genomului prin CRISPR-Cas9 este un instrument puternic pentru îmbunătățirea culturilor (Yang et al., 2017) care permite introducerea de mutații în RPX1 și extinde potențial aplicațiile acestuia la diferite culturi.

REFERINȚE

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Volatile induse de erbivor provoacă gene de apărare în frunzele de fasole Lima. Natura, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. şi colab. (2021) DMNT volatil protejează direct plantele împotriva Plutella xylostella prin perturbarea barierei matricei peritrofice din intestinul mijlociu al insectelor. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T., şi colab. (2018) Leziunile glandelor de mătase și răspunsul transcripțional la genele de detoxifiere legate de enzimele Bombyx mori sub expunerea la phoxim. Chemosphere, 209, 964–971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Scufundarea florală: o metodă simplificată pentru transformarea mediată de Agrobacterium a Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. et al. (2020) Acidul salicilic indus de hrănirea erbivorelor antagonizează apărarea plantelor mediată de acid iasmonic împotriva atacului insectelor. Plant Signaling & Behavior, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Strategii pentru creșterea rezistenței culturilor la dăunătorii insectelor. Revizuirea anuală a biologiei plantelor, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Un parfum floral, benzoatul de metil, este un pesticid verde eficient. Scientific Reports, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Asamblarea independentă de diversificarea metabolică a grupurilor de gene asemănătoare operonilor în diferite plante. Știință, 320, 543–547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK și colab. (2012) Identificarea sintetazei minerale, care este esențială pentru creșterea și dezvoltarea în Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Apărări chimice directe și indirecte împotriva insectelor într-un cadru multitrofic. Plant, Cell & Environment, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K., și colab. (2019) Editarea simultană mediată de CRISPR/Cas9 a izoformelor eIF4E de manioc nCBP-1 și nCBP-2 reduce severitatea și incidența simptomelor bolii cu dungi brune ale maniocului. Plant Biotechnology Journal, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Răspunsuri electrofiziologice antenale ale trei viespi parazite la substanțele volatile induse de omidă din porumb (Zea mays), bumbac (Gossypium herbaceum) și cowpea (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023–1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. și colab. (2016) Biosinteza compușilor de apărare benzoxazinoid 8-O-metilați în porumb. The Plant Cell, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. și colab. (2019) O rețea metabolică specializată modulează selectiv microbiota rădăcinii Arabidopsis. Science, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Sinteza moenocinolului și a analogilor săi folosind BT-sulfonă în olefinarea Julia-Kocienski. Litere tetraedrice, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. şi colab. (2020) DMNT indus de erbivore catalizat de CYP82D47 joacă un rol important în inducerea rezistenței erbivorelor dependente de JA a plantelor de ceai vecine. Plant, Cell & Environment, 44, 1178–1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Schimbări climatice și insecte dăunătoare: rezistența nu este inutilă? Trends in Plant Science, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: un insecticid de succes cu noi caracteristici de mediu și vești. Microbiologie aplicată și biotehnologie, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Ingineria genetică a metabolismului terpenoidului atrage gărzile de corp la Arabidopsis. Știință, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara‐Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N., et al. (2017) Deficiența izoformei eIF4E nCBP limitează mișcarea de la celulă la celulă a unui virus vegetal care codifică proteine ​​cu blocuri de gene triple la Arabidopsis thaliana. Scientific Reports, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Volatile monoterpenelor induse de erbivore și florale sunt biosintetizate de o singură enzimă P450 (CYP82G1) în Arabidopsis . Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR și colab. (2018) Evoluția convergentă a unui comutator metabolic între rezistența la afidă și la omizi la cereale. Science Advances, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. și colab. (2018) Identificarea și analiza funcțională a două enzime P450 ale Gossypium hirsutum implicate în biosinteza DMNT și TMTT. Revista de biotehnologie a plantelor, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Semnalizarea jasmonatului în plante formează ecologia interacțiunii plante-insecte. Opinia curentă în știința insectelor, 14, 32–39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J., şi colab. (2018) Rezistența orezului la dăunătorii insectelor mediată de suprimarea biosintezei serotoninei. Nature Plants, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) CRISPR-Cas9 țintirea genei eIF4E1 extinde spectrul de rezistență Y al virusului cartofului al Solanum tuberosum L. cv. dorită. Frontiers in Microbiology, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Noua diafonie între răspunsurile căii acidului etilen și iasmonic la o insectă care suge piercing din orez. New Phytologist, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW și colab. (2019) DMNT volatil induce sistemic apărare anti-erbivoră directă independentă de jasmonat în frunzele plantelor de cartof dulce (Ipomoea batatas). Scientific Reports, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska‐Banaszak, O., Skrzypczak‐Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutation S‐transferase ca indicator de toxicitate în anestezia generală: genetică și funcția biochimică. Journal of Clinical Anesthesia, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: noi membri ai familiei, noi parteneri obligatorii, noi roluri. Journal of Biological Chemistry, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG şi colab. (2016) Caracterizarea căilor de biosinteză pentru producerea homoterpenelor volatile DMNT și TMTT în Zea mays. The Plant Cell, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Identificarea și caracterizarea unei noi proteine ​​de legare a capacului din Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 273, 10325–10330.