Analiza integrativă Omică dezvăluie căile legate de inflamația microvasculară în biopsiile de alogrefă renală

edmund.chen@wecistanche.com

În transplantul de organe solide, microARN-urile (miARN-urile) au apărut ca jucători cheie în reglarea funcției celulelor alogrefei ca răspuns la leziuni. Pentru a obține o perspectivă asupra rolului miARN-urilor în respingerea mediată de anticorpi, un fenotip de respingere definit histologic de inflamația microvasculară,rinichi Biopsiile de alogrefă au fost supuse profilării miARN, dar și ARNm mesager (ARNm). Folosind un proces unic de selecție în mai multe etape specific studiului BIOMARGIN (cohorta de descoperire, N=86;cohorta de selecție, N=99; cohorta de validare, N=298), șase miARN exprimate diferențiat au fost identificate în mod constant: miR-139-5p (jos) și miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (sus). Nivelul lor de expresie sa corelat treptat cu intensitatea inflamației microvasculare. Specificitatea celulară a genelor țintă miARN a fost investigată prin integrarea țintelor lor mARN in vivo cu secvențierea ARN unicelular dintr-o cohortă independentă de biopsie de alogrefă. Expresia miR-139-5p derivată din endoteliu a corelat negativ cu expresia genelor legate de MHC. În schimb, supraexprimarea miR-222-3p derivată din epiteliu a fost puternic asociată cu homeostazia electroliților renali degradată și căile imune reprimate. În celulele imune, miR-150-5p a reglat activarea NF-kB în limfocitele T, în timp ce miR-155-5p a reglementat splicingul ARNm în celulele prezentatoare de antigen. În total, omicele integrate ne-au permis să descoperim noi căi implicate în inflamația microvasculară și să sugerăm că modificările metabolismului în celulele epiteliale tubulare apar ca o consecință a respingerii mediate de anticorpi, dincolo de compartimentul endotelial din apropiere.

Cuvinte cheie:transplant de rinichi, microARN, multi-omic, inflamație microvasculară, respingere mediată de anticorpi

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

INTRODUCEREÎntransplant de rinichi(KT), leziunea aloimună este de obicei dihotomizată în două tipuri de respingere alogrefei, în funcție de distribuția spațială a infiltrației imune și informații despre prezența sau absența anticorpilor anti-HLA specifici donatorului. Diagnosticul se bazează pe biopsia de alogrefă cu gradarea leziunilor histologice conform clasificării Banff International Consensus(1). Tubulita (leziunea „t”) și inflamația interstițială (leziunea „I”) sunt caracteristici histologice caracteristice ale respingerii mediate de celule T (TCMR) și sunt legate de citotoxicitatea directă a compartimentului tubulointerstițial. Respingerea mediată de anticorpi (ABMR) este cel mai adesea asociată cu anticorpii anti-HLA circulanți, cu inflamație care vizează compartimentul microvascular. Leziunile histologice ABMR active includ prezența celulelor mononucleare în capilarele glomerulare („leziune g”) și în capilarele peritubulare (leziune „ptc”), denumite în mod combinat „inflamație microvasculară” (MVI). În ABMR cronic activ, leziunile cronice ale țesuturilor, cum ar fi glomerulopatia de transplant sau fibroza intimală arterială se adaugă la aceste leziuni acute (1). Folosind actualii agenți imunosupresivi țintiți pe celulele T’, TCMR este considerat a avea un impact prognostic limitat, în timp ce ABMR este o cauză majoră a eșecului grefei, care se referă la lipsa abordărilor terapeutice eficiente (2).

Pentru a găsi terapii mai bune pentru MVI și ABMR, este nevoie de o mai bună înțelegere a mecanismelor biologice care stau la baza acestor procese de leziune. Tehnologiile omice de mare performanță par a fi potrivite acestui scop, deoarece permit screening-ul exact și simultan a mii de gene, proteine ​​și metaboliți(3). Interogarea întregului transcriptom alrinichibiopsiile de alogrefă au demonstrat modificări profunde ale expresiei genei ARNm în celulele rezidente rănite sau în populațiile de celule infiltrate în timpul ABMR (4). Între timp, microARN-urile (miARN-urile) au apărut ca jucători cheie în metabolismul celular, prin reglarea ARN-ului mesager (ARNm) la nivel posttranscripțional. De fapt, miARN-urile au revoluționat înțelegerea noastră a reglajului proceselor fiziologice ale corpului implicate în proliferare, apoptoză, diferențiere și dezvoltare (5). Nu este surprinzător, expresia dereglată a miARN are ca rezultat dezvoltarea multor patologii, inclusivboala renala(6). Deoarece profilurile de expresie a miARN diferă între stările bolnave și cele sănătoase, multe studii au analizat miARN-urile fie singure, fie în combinație cu alți markeri mai tradiționali, nu numai pentru a diagnostica boala și a prognoza progresia bolii, ci și pentru a proiecta potențiale aplicații terapeutice (7).

În contextul transplantului de organe solide, miARN-urile pot fi implicate în respingere prin rolul lor în reglarea funcției celulelor imune și în răspunsul celulelor rezidente alogrefei la leziuni (6,8). Mai multe studii au investigat miARN alogrefei ca biomarkeri și/sau efectori în setările TCMR (8,9), dar niciunul nu s-a concentrat până acum pe MVI și ABMR. În acest studiu, ne-am propus să integrăm diferite niveluri omice de larinichibiopsii de alogrefă, pentru a obține o perspectivă asupra rolului miARN-urilor în acest fenotip de respingere dăunător.

MATERIALE ȘI METODE Proiectarea studiuluiAcest studiu face parte din BIOMArkers of, finanțat de FP7-RenalProgramul de cercetare Graft INjuries (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, numărul NCT02832661), condus de un consorțiu european de cercetare în căutarea biomarkerilor leziunilor imune de alogrefă întransplant de rinichidestinatari, cu valoare diagnostica si/sau prognostica. BIOMARGIN este un studiu multicentric, prospectiv, multifazic, efectuat la patrutransplant de rinichicentre din Europa (Spitalul Necker, Paris, Franța; Spitalele Universitare, Leuven, Belgia; Facultatea de Medicină din Hanovra, Hanovra, Germania; și Spitalul Universitar, Limoges, Franța). Probele au fost colectate prospectiv la momentul screening-ului și al biopsiilor de indicație între aprilie 2013 și iunie 2015 (Figura IA). Toate transplanturile au fost efectuate cu potriviri încrucișate cu citotoxicitate dependentă de complement negativ. În aceste patru centre clinice, biopsiile de protocol au fost efectuate la 3,12, iar uneori la 24 de luni după transplant, conform practicii centrului local, pe lângă biopsiile de indicație. Comitetul de revizuire instituțional de la fiecare site a aprobat studiul, iar toți pacienții au furnizat consimțământul informat în scris.

Cohorte de studiuStudiul a fost împărțit în trei faze (Figura 1A). În prima fază de descoperire caz-control, N=88 probe de biopsie au fost utilizate pentru analiza globală a expresiei miARN (N=754 miARN, excluzând potențialele miARN de normalizare) . Am selectat probe în funcție de disponibilitate și criterii histologice (excluzând cazurile cu diagnostic de glomerulonefrită sau nefropatie asociată poliomavirusului și cazurile cu diagnostic neclar). Pe baza citirilor biopsiei locale, s-a făcut o primă selecție, care a fost rafinată în continuare prin citirea centrală de către un grup de patologi, independenți de centrul original. Analiza statistică (vezi selecția miARN) a fost utilizată pentru a selecta lista extinsă de miARN, cel mai diferențial exprimate între fenotipurile histologice, care au fost ulterior cuantificate în a doua fază.

Un design similar de studiu caz-control a fost utilizat pentru a doua fază (de selecție), în care analiza exprimării miARN (N=143) a fost efectuată pe N=99 probe de biopsie. Aceeași conductă statistică a fost aplicată pentru a selecta o listă și mai restrânsă de miARN, care urmează să fie cuantificată ulterior în a treia fază. În cele din urmă, în a treia cohortă (de validare), toate probele colectate prospectiv și consecutiv conform protocolului BIOMARGIN între 24 iunie 2014 și 2 iulie 2015 și curinichiCalitatea biopsiei alogrefei, au fost evaluate pentru cei 38 de miARN selectați ca rezultat al celei de-a doua faze de selecție. În această cohortă de setare din viața reală, nu s-a făcut nicio selecție pe baza histologiei, a datelor demografice, a timpului sau a oricărui alt factor decât disponibilitatea probei și criteriile de control al calității (adecvarea biopsiei și a randamentului de ARN).

Selecția miRNAO conductă statistică robustă a fost dezvoltată special pentru studiul BIOMARGIN în R (R Core Team(10), versiunea 1.0.44), ca o extensie a pachetului biosignal R (1l). Pe scurt, în faza de descoperire, am realizat o strategie de selecție a caracteristicilor care include abordări univariate și multivariate. Pentru selecția univariată, am folosit un test neparametric (testul Wilcoxon-Mann-Whitney) și un test parametric (testul t Student) și o cohortă Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Scorurile de predicție ale fiecărei transcrieri miARN în fiecare model multivariat au fost integrate pentru a produce un „scor multivariat”. Combinând rezultatele acestor analize univariate și multivariate, am reușit să clasificăm și să selectăm un subset de candidați miARN care să facă parte din lista extinsă care urmează să fie cuantificată în faza următoare.Pentru această analiză post-hoc care se concentrează pe căile VMI, expresia mediană normalizată a fiecărui miARN a fost comparată între cazuri și controale folosind testul Wilcoxon în toate cele trei cohorte. Am controlat testele multiple folosind metoda Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR).

Evaluare clinicopatologicăScorurile individuale ale leziunilor histologice au fost evaluate semi-cantitativ conform criteriilor Banff 2019(16). Termenul „inflamație microvasculară” (MVI) a fost folosit pentru a se referi la orice grad de combinație de glomerulită (g) și/sau capilarită peritubulară (ptc). Toate cazurile ABMR au îndeplinit primele 2 criterii ale clasificării Banf 2015 sau Banff 2017 (histologice). dovezi ale leziunii tisulare acute și dovezi ale interacțiunii anticorpilor actuale/recente cu endoteliul vascular), dar nu toate au îndeplinit cel de-al treilea criteriu [dovezi serologice ale anticorpilor specifici donatorului (DSA) și/sau colorării CAd]. DSA-urile după transplant au fost determinate conform practicii centrului local, pozitivitatea DSA definită ca anticorpi anti-HLA serici detectabili specifici donatorului cu o valoare medie a intensității fluorescenței (MFI) de 500 la momentul biopsiei sau în orice moment înainte.

Extracția ARN din probe de biopsie pentru profilarea ARNm și miARNAu fost luate miezuri cu două ace la fiecarerinichibiopsie de alogrefă. Unul a fost folosit pentru clasificarea histologică convențională, iar cel puțin jumătate din celălalt a fost stocat imediat în Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Țările de Jos). Tuburile Allprotect au fost depozitate la 4C (minimum 24 de ore până la maxim 72 de ore) și apoi stocat la -20 grade până la extracția ARN. ARN total a fost izolat dinrinichiprobe de biopsie de alogrefă utilizând kitul universal Allprep ADN/ARN/miRNA (Qiagen Benelux BV) pe un instrument QIAcube (Qiagen Benelux BV). Cantitatea (absorbanța la 26{{20}} nm) și puritatea (raportul absorbanței la 230.260 și 280 nm) de ARN izolat au fost măsurate folosind spectrofotometrul NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia). Numărul de integritate ARN (RIN) a fost evaluat cu kitul eucariote nano/pico ARN (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgia) pe instrumentul Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indicii de control al calității nu au fost semnificativ diferiți între VMI și No. Grupuri MVI [RIN(medie±SD):5,6±1,96vs5,4±1,97,P=0.66;raport 260/280 (medie±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. Pentru probele de ARN cu un RIN scăzut(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI RINCHII/DIALIZA RENALĂ

Profilarea miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 au fost considerate a fi neexprimate. RNU44 și RNU48 au arătat o expresie consistentă în toate probele, coeficientul mediu de variație (RNU44 plus RNU48) a fost de 3,73 la sută în Array Card A și 3,79 la sută în Array Card B] și au fost utilizate ca gene de întreținere pentru normalizarea datelor în toate substudiile.

Analiza transcriptomică ARNmAnaliza transcriptomică a fost efectuată prin microarray așa cum este deja descris(17). Pe scurt, ARN-ul total extras din probele de biopsie a fost mai întâi amplificat și biotinilat la ARN complementar (ARNc) folosind kitul de reactivi GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) și hibridizat cu matricele Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix), care a cuprins 54.675 seturi de sonde care acoperă întregul genom. Am folosit o normalizare Robust Multichip Average (RMA). Expresia mediană normalizată a fiecărui ARNm a fost comparată între cazuri și martori folosind testul Wilcoxon. Am controlat inflația riscului alfa datorită testelor multiple prin aplicarea metodei Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR). Datele de microarray au fost tratate în conformitate cu ghidurile Minimum Information About Microarray Experiment.

Analize in silicoSoftware-ul de interpretare biologică a experimentelor multiomice (BIOMEX) a fost utilizat pentru analiza diferențială a datelor transcriptomice, folosind adnotarea ID Ensembl (18). Analiza căii ingeniozității (IPA, Build: 478438M Versiunea conținutului: 44691306, Qiagen) și OMICSnet(19) au fost utilizate pentru a determina seturile de gene reglementate de miARN-urile selectate. OMICSnet a fost utilizat pentru a efectua analiza Ontologiei genetice cu baza de date a căii Reactome, folosind calea completă (20). Construirea rețelelor de gene a fost complet nesupravegheată și s-a bazat pe numărul de interacțiuni moleculare raportate ale fiecărei gene cu toate celelalte gene din rețea. Genele care prezintă cel mai mare număr de interacțiuni au fost poziționate automat în centrul rețelei, în timp ce genele cu un număr mai mic de interacțiuni au fost răspândite la periferie. Originea celulară a miARN-urilor selectate a fost investigată utilizând proiectul Fantom5 (21), care oferă o analiză maximă a expresiei genelor în celulele și țesuturile umane. Pentru analiza expresiei miARN, am luat în considerare toaterinichi-celule structurale înrudite și toate celulele hematopoietice circulante, fără selecție ulterioară.

Analiza datelor de secvențiere a ARN-ului cu o singură celulăAu fost utilizate date de secvențiere a ARN-ului unicelular uman (siRNA-seq) publicate anterior din două biopsii ABMR și patru referințe sănătoase corespunzătoare biopsiilor de supraveghere a transplantului. Numărările brute asociate sau matricele au fost descărcate, respectiv, din GEO (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) șiRinichiProiect de medicină de precizie (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Matricele brute de expresie a genelor generate per probă au fost îmbinate și analizate folosind pachetul Seurat V4 (23). Parametrii aplicați pentru a crea și filtra obiectele Seurat au fost următorii: includerea celulelor care exprimă între 500 și 10000 de gene detectate și mai puțin de 25% transcrieri mitocondriale. După filtrare, toate obiectele au fost integrate folosind fluxul de lucru de integrare SCTransform pe Seurat (24). Pe scurt, 3000 de caracteristici au fost utilizate pentru integrare folosind funcția PrepSCTIntegration, iar funcția FindIntegrationAnchors a fost folosită pentru a limita efectul lotului. Un set complet de date Uniform Manifold Aproximation and Projection (UMAP) a fost generat folosind funcția DimPlot și primele 16 componente principale. Clusterele au fost construite folosind funcțiile FindNeighbors și FindClusters cu o rezoluție de 0,6. Identificarea clusterelor a fost efectuată utilizând funcția FeaturePlot prin evaluarea expresiei unor markeri specifici din fiecare cluster. Graficele de puncte au fost generate utilizând funcțiile de graficare DotPlot și FeaturePlot, cu numărări normalizate în testul ARN ca date de intrare.

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INFECȚIA RENICALE/RENALE

Analize statisticeCaracteristicile pacientului și donatorului au fost descrise prin numere, procente și frecvențe pentru variabilele categorice. Am raportat variabilele continue folosind medii și abateri standard (SD) dacă sunt distribuite în mod normal, mediane și intervale interquartile (IQR) pentru variabilele cu o distribuție anormală. Le-am comparat caracteristicile folosind testul Fisher sau Wilcoxon, atunci când este cazul. Am folosit testul Kruskal-Wallis pentru a compara expresia mediană a miARN în funcție de intensitatea MVI și testul Spearman pentru analiza corelației. Am luat în considerare semnificația statistică pentru valorile P mai mici de 0.05. Am folosit GraphPad Prism (versiunea 8; GraphPad Software, San Diego, CA) și RStudio (versiunea 4.0.3) pentru analiza statistică și prezentarea datelor. Au fost utilizate următoarele pachete R: heatmap3 (heatmap3_1.1.9)pentru analize de hărți termice, fmsb(fmsb_0.7.0)și pachete scale (scale{_1.1.1)pentru diagrame radar, ggplot2 (ggplot2_3.3.5)pentru grafice cu bare și complot(corrplot_0.90)pentru analiza matricei de corelație.

REZULTATE

Identificarea în mai multe etape a miARN-urilor asociate MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Ceilalți 59 de pacienți (MVI-) au prezentat diverse diagnostice cuprinzând respingerea mediată de celule T (TCMR, N=8), fibroză interstițială și atrofie tubulară (IFIA, N{=20) și biopsii normale (N{{6} }}), dar nu MVI. Din cei 754 de candidați miARN, 18 miARN au fost exprimați diferențial între grupurile MVI plus și MVI- (Figura 1B). În cohorta de selecție, o listă restricționată de 143 de miARN a fost cuantificată în 99 de probe. În această cohortă de selecție, 14 miARN-uri au fost exprimate diferențiat între cazurile cu (N=28) și fără (N=71) ABMR (Figura 1C). În cele din urmă, în cea mai mare cohortă trans-secțională, 38 de miARN au fost cuantificați în 298 de eșantioane, dintre care 12 miARN-uri au fost exprimate diferențiat între biopsiile ABMR (N{=29) și nicio biopsie ABMR (N{=269) (Figura 1D). ).

Identificarea consecventă a 6 MiRNA-uri asociate MVI și corelarea cu histologieApoi, am intersectat cele 3 liste de miARN-uri exprimate diferențial și am identificat 6 miARN-uri care au fost asociate în mod constant cu MVI sau ABMR în cele 3 cohorte independente (Figura 2A). -155-5p, miR-222-3p și miR-223-3p au fost supraexprimate în MVI/ABMR, în timp ce expresia miR{-139-5p a fost scăzută. Graficele radar (Figura 2B) afișează pentru fiecare pas expresia diferențială între caz și controale celor 6 miARN și susțin robustețea profilurilor miARN în cele trei cohorte independente. Apoi, am studiat modul în care expresia celor 6 miARN este asociată cu leziunile histologice individuale în toate cele 483 de biopsii de alogrefă luate împreună. Expresia celor 5 miARN reglați în sus a crescut treptat odată cu intensitatea leziunilor MVI, în timp ce expresia miR-139-5p a fost corelată negativ (Figura 2C). MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/{223-3p nu au fost doar foarte asociate cu caracteristicile legate de ABMR (g, ptc, depunerea C4d), ci și cu leziuni legate de TCMR (i, t ) și leziuni IFTA (ct, ci), sugerând implicarea lor în procese comune, nespecifice ABMR, inflamatorii și cicatrizante. Alternativ, ar putea exista o oarecare coliniaritate intrinsecă între leziuni, ceea ce duce la incapacitatea noastră de a identifica adevărata specificitate pentru o leziune. MiR-222-3p nu s-a corelat cu leziunile histologice ale TCMR sau IFTA (Figura 2D).

Integrare Multi-Omics: Interacțiunea ARNm-miARN în MVApoi, am evaluat genele exprimate diferențial între cazurile MVI plus și MVI-, în setul de descoperire publicat anterior (25). Dintre cele 54.675 de sonde, un total de 2755 de gene exprimate diferențial (DEG) au fost identificate între MVI plus și MVI-

grupuri, cuprinzând 1085 de gene reglate în jos și 1670 de gene reglate în sus (Figura 3A). Cele mai exprimate diferențial ARNm în probele MVI plus au fost CXCL9 și CXCL10, în conformitate cu rapoartele anterioare (17, 26) conform cărora aceste gene sunt cele mai supraexprimate în ABMR. Apoi, am folosit IPA și OMICSnet pentru a identifica in silico genele țintă presupuse pentru fiecare miARN. Un total de 4504 ARNm au fost prezis a fi vizate de cel puțin unul dintre cei 6 miARN. Apoi, am integrat aceste 4504 ținte prezise cu DEG-urile din biopsiile de alogrefă. Analiza integrată miARN/mARN a identificat 61 DEG vizate de miR-139-5p care au fost semnificativ crescute în MVI plus biopsii. De asemenea, a identificat 28, 58, 52, 43 și 27 DEG scăzute semnificativ în MVI plus biopsii care au fost vizate de miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p și miR-223-3p (Figura 3B).

Originea celulară a miARN-urilor asociate cu MVOriginea celulară a celor șase miARN a fost caracterizată în diverserenalsubtipuri de celule și celule hematopoietice folosind atlasul miARN disponibil online [baza de date Fantom (27)]. Gruparea nesupravegheată discriminatărenalmiARN-uri derivate din celule din miARN-uri derivate din celule imune (Figura 4A). De asemenea, a dezvăluit unul sau două tipuri de celule dominante pentru fiecare miARN. MiR-139-5p părea a fi exprimat în principal de celulele endoteliale glomerulare (EC). MiR-222-3p, deși expresia sa nu a fost corelată cu inflamația tubulară (leziuni Banff „t”, Figura 2D), a fost în principal legată derenalcelule epiteliale. Cele patru miARN rămase au fost exprimate în principal în celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) sau granulocite, cu miR-142-3p îmbogățit în celule NK și monocite, miR-150-5p în celulele CD4 plus și CD8 plus, miR -155-5p în CD19 plus celulele B și macrofage și miR-223-3p în neutrofile.

Secvențierea ARN cu o singură celulă a identificat toate celulele renale și celulele imune infiltrate Pentru a caracteriza rolul potențial al fiecărui miARN asociat MVI, am analizat datele sc-RNAseq disponibile public de la douărenalbiopsii de alogrefă cu ABMR și scoruri MVI mari (g2, ptc3) (22). Aceste seturi de date au fost integrate cu 4 biopsii de referință sănătoase fără MVI. După controlul calității și filtrare, au fost detectate 31545 de celule și gruparea nesupravegheată a evidențiat 12 clustere (Figura 4B). Am folosit markeri bine stabiliți (28) pentru a identifica toate subtipurile principale de celule rezidente și infiltrante și pentru a le eticheta (Figura suplimentară S2). Apoi, ne-am concentrat asupra populațiilor de celule din care se credea că provin cele șase miARN-uri ale noastre. În acest scop, am stratificat celulele în 4 grupuri majore corespunzătoare endoteliului, epiteliului, limfocitelor și APC-urilor (Figura 4C). În conformitate cu analiza anterioară a acestor date (22), în seturile de date sc-RNASeg nu au fost detectate populații de celule neutrofile sau NK.

miR-139-5p controlează activarea EC și calea de prezentare a antigenului în timpul MVIMiR-139-5p a fost singurul miARN reglat în jos din studiul nostru în cazurile cu MVI/ABMR (Figura 2A) și s-a constatat că provine în principal din EC glomerulară (Figura 4A). S-a confirmat că Șaizeci și una dintre genele sale țintă sunt reglate în microarray în vrac din cazurile MVI plus (Figura 3B), iar expresia lor a fost investigată în continuare la rezoluția cu o singură celulă în cele 3 subclustere EC identificate anterior (Figurile 4B, C). După cum este descris în Figura 5A, ECcluster-ul activat a fost detectabil numai în probele MVI plus. În plus, jumătate dintre cele 61 de gene (N=30) au fost crescute constant în sc-RNAseq MVI plus biopsii, indiferent de cele trei subclustere EC. Dintre acestea, GBP5 a fost cea mai crescută genă. Apoi, analiza ontologiei genelor folosind aceste 30 de transcrieri derivate din endoteliu a identificat UBE2D1 și YWHAG ca jucători centrali în rețeaua de gene (Figura 5B). Mai precis, căile legate de imun și procesarea antigenului mediată de complexul major de histocompatibilitate (MHC) și căile de prezentare au fost îmbogățite (Figura 5C). Analiza pseudotimp a fost efectuată pentru a caracteriza mai bine modificările expresiei genelor în cursul activării EC, traiectoria stării celulelor (Figurile 5D, E), UBE2D1, YWHAG și GBP5 au crescut continuu în timpul activării endoteliale asociate cu MVI. Traiectorii foarte asemănătoare au fost găsite pentru genele legate de MHC HLA-A,-B și -DRA, dar și pentru activarea endotelială bună și markerii de inflamație, cum ar fi VCAM1, CXCL9 și CXCL10, sugerând că toate aceste gene sunt exprimate concomitent în timpul activării endoteliale. În total, aceste rezultate sugerează că miR-139-5p este scăzut în timpul leziunilor MV și nu mai reprimă calea de prezentare a antigenului MHC în EC activată.

miR-222-3p Deteriorează ambeleRenalCăi fiziologice și imune legate de celulele epiteliale în timpul MVI În continuare, ne-am concentrat pe miR-222-3p, un miARN reglat în sus din probele MVI cu unrenaloriginea celulelor epiteliale și o corelație mai exclusivă cu leziunile histologice legate de ABMR (Figurile 2A, D, 4A). În țesutul de alogrefă în vrac, expresia a 43 dintre genele sale țintă a fost reglată în jos (Figura 3B) și evaluată în continuare la un singur rezoluție celulară în diferiterenalpopulațiile epiteliale pe care le-am identificat anterior (Figurile 4B, C). O scădere masivă a 41 din aceste 43 (95 la sută) gene în toate identificaterenalclusterele de celule epiteliale sugerează o reducere a tăcere a genelor

profil în VMI (Figura 6A). Interesant, 4 gene implicate înrenalCăile fiziologice (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 și KIF3B), dar și genele legate de imun (TRAPI și PEBPI) au fost identificate ca gene centrale în rețea (Figura 6B). Ontologia genică a 43 de gene a dezvăluit îmbogățirea căilor de semnalizare ErbB, dar și în căile legate de imunitate și răspunsul la citokine (Figura 6C) și expresia ERBB4 au fost confirmate în continuare în toaterenalcelule (Figura 6D). În total, aceste rezultate sugerează că în timpul VMI, un nivel înalt de-222-3p inrenalcelulele epiteliale este asociată cu represiunea puternică a genelor implicate atât înrenalcăile de homeostazie a electroliților și căile legate de imunitatea din epiteliu.

miR-150-5p reglează activarea NF-kB în limfocitele T în timpul MVI În mod similar, am investigat rolul reglator al (creștet) miR-150-5p în timpul MVI în clusterul de celule T, în care acesta a fost exprimat cel mai predominant (Figura 4A). Am reprezentat grafic cele 58 de DEG asociate MVI scăzute identificate în probele de biopsie de alogrefă în vrac (Figura 3B) și l-am confruntat cu expresia genelor în clusterul de celule T sc-RNAseq (Figura 7A). Proporția de gene țintite atât de miR150-5p, cât și în mod specific subexprimate în celulele T în timpul MVI a fost surprinzător de scăzută (15/58, 25,9 la sută), ceea ce sugerează că scăderea globală a acestor gene in vivo nu sa datorat exclusiv Compartimentul limfocitelor T. Cu toate acestea, din această listă foarte selectată de 15 gene și folosind platforma OMICSnet, am construit o rețea de gene (Figura 7B) și am efectuat analiza ontologiei genelor (Figura 7C). Am observat că supraexpresia miR-150-5p a fost asociată cu NF -Reglarea KB în limfocitele T în timpul MVI.

miR-155-5p Reglează îmbinarea ARNm în APC-uri în timpul MV În cele din urmă, exact aceeași strategie a fost aplicată pentru genele țintă 52miR-155-5p, subexprimate în timpul MVI (Figura 3B). În contrast cu miR{-150-5p din limfocitele T, am observat că aproape două treimi dintre genele vizate miR-155-5p au fost în mod constant scăzute în clusterul APC sc-RNAseq (31/52, 59,6 la sută, Figura 8A). Analiza rețelei genetice a arătat că AIFMI și CIAO1 erau gene centrale (Figura 8B). Mai mult, ontologia genelor a relevat o îmbogățire puternică în căile legate de splicing-ul ARNm (Figura 8C).

DISCUŢIEPrin designul său unic, studiul BIOMARGIN este cadrul tipic pentru integrarea datelor multi-omice. Într-adevăr, conducte foarte robuste au fost utilizate atât în ​​cohorte de descoperire, selecție și validare, care cuprind un număr mare de pacienți din diferite centre de transplant. În cele trei cohorte independente, am observat și confirmat concomitent profilul de expresie a 6 miARN-uri în timpul MVI: miR-139-5p a fost scăzut în timp ce miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p și miR-223-3p au fost crescute. Este important că nivelul fiecăruia dintre aceste 6 miARN a fost corelat cu severitatea MVI, sugerând un mecanism de reglare dependent de doză. Apoi am folosit în platforme de siliciu pentru a investiga fiecare origine celulară miARN. În mod surprinzător, au fost observate două grupuri distincte de miARN: primul derivat din celulele imune infiltrate și al doilea mai specific rezidenților.renalcelule. Apoi, atât miARN-urile, cât și ARNm-urile au fost măsurate în același set de descoperire de probe de biopsie, permițând o analiză integrată a ARNm/miARN-urilor exprimate diferențial validate in vivo asociate cu MVI. În cele din urmă, după ce am descris asocierea ARNm/miARN la rezoluția țesutului în vrac, am confirmat interacțiunea ARNm/miARN-uri la rezoluția unicelulare pentru patru din cele 6 miARN identificate.

Interesant, miR-139-5p a fost singurul miARN corelat negativ cu leziunile MVI. Ea provine în principal din CE și s-a raportat că reglează genele legate de MHC. Printre genele sale țintă, UBE2D1 a fost intens reglat în timpul activării endoteliale asociate cu MVI. Familia UBE2D este o familie de enzime de conjugare a ubiquitinei E2 în sistemul ubiquitină-proteazom (29, 30) și s-a demonstrat că UBeD1 îmbunătățește ubiquitinația March-I, ceea ce duce la reglarea în sus a proteinelor MHC clasa II (31). În plus, GBP5 a fost cea mai reprezentată genă inactivată EC în timpul MVI, ceea ce este în concordanță cu rapoartele noastre recente care arată că GBP5 este puternic reglată în biopsiile ABMR (17), dar și în probele de sânge (32). Interesant, s-a dovedit că expresia GBP5 este inductibilă de interferonul de tip II în celulele endoteliale microvasculare uterine umane, împreună cu CXCL9 și CXCL10 (33). Rolul timpuriu al acestor două chemokine proinflamatorii în procesele acute de respingere este bine documentat și nivelul lor în urină este propus pentru a monitoriza riscul de respingere acut în supravegherea de rutină a primitorilor de transplant de rinichi (34). O altă țintă miR-139-5p este YWHAG.YWHAG codifică familia de proteine ​​HLA-F și a fost descrisă ca fiind exprimată diferențial în timpul procesului profibrotic activ în nefropatia diabetică (35). Posibilul rol al miR-139-5p în fibroză, o cale finală comună după inflamație, este cu atât mai relevant cu cât IFTA a fost recent inclus într-un scor compus pentru a prezice supraviețuirea alogrefei de rinichi după ABMR(36). În total, aceste rezultate sugerează că miR-139-5p nu mai reprimă expresia antigenului MCH la suprafața Anethum în timpul MVI și ar putea participa la procesul de chimioatracție și fibroză, dar aceste mecanisme rămân să fie confirmate experimental exprimarea la suprafața endoteliului în timpul MVI și ar putea participa la procesele de chemoatracție și fibroză, dar aceste mecanisme rămân de confirmat experimental.

Al doilearenalmiARN derivat pe care l-am identificat este miR-222- 3p, a cărui expresie s-a dovedit a fi mai specifică leziunilor MVI: este asociat cu scorurile g și PTC, precum și cu depunerea C4d, dar nu cu leziunile i sau t. Cu toate acestea, provine în principal din celulele epiteliale. După integrarea multi-omică la rezoluția celulei, am stabilit că miR-222-3p reprimă în principal semnalizarea ErbB, care este crucială pentru funcțiile celulare fundamentale, cum ar fi proliferarea, migrarea, creșterea și diferențierea (37). În biologia umană, semnalizarea fiziologică ErbB este necesară pentrurenalhomeostazia electrolitică și menținerea integrității rinichilor (38). Rezultatele noastre au identificat, de asemenea, ADAM22, NRG1, ZNF91 ca gene legate de semnalizarea ErbB reprimate în special în epiteliu în timpul MVI. Alte gene esențiale pentru fiziologia rinichilor, cum ar fi ATP1B1 și KIF3B, au fost, de asemenea, reprimate în epiteliul renal de miR-222-3p în timpul MVI. Anterior, Baker și colab. a arătat că ATP1B1 (subunitatea b1 de Na plus /K plus -ATPază) conducerenalreabsorbția tubulară a sodiului (39). În plus, Aguado-Fraile și colab. au identificat membrul familiei Kinesin 3B (KIF3B) ca fiind implicat în traficul de celule în celulele tubului proximal de șobolan. KIF3B apare ca un mediator cheie al răspunsului celulelor tubulare epiteliale proximale la ischemie/reperfuzie cu potențială aplicare înrenalmanagementul leziunilor ischemice (40). Astfel, putem specula că miR-222-3p reprimă căile fiziologice esențiale în timpul MVI în epiteliu. Mai mult, căile legate de imunitate sunt, de asemenea, reglementate de supraexpresia miR-222-3p: gene importante precum TRAP1 și PEBP1 au fost total inhibate în probele cu MVI puternic. Interesant, sa demonstrat că TRAP1 se amelioreazărenalfibroza tubulointerstițială la șoareci cu obstrucție ureterală unilaterală prin protecțierenalmitocondriile cu celule epiteliale tubulare (41). În plus, PEBP1 oferă efecte antiinflamatorii prin inhibarea ambelor căi MAPK și NF-kB în condiții homeostatice/bazale (42). Înrenalepiteliu, un studiu al lui Marko et al. a arătat în mod elegant că activarea post-ischemică a NF-kB agravează leziunea tubulară și exacerbează inflamația (43). În mâinile noastre, PEBP1 a fost complet reprimat de miR-222-3p, sugerând că calea NF kB este dezlănțuită în timpul MVI. În total, aceste rezultate arată că biologia epitelială este perturbată în timpul MVI șirenalcelulele epiteliale răspund activ la leziunile MVI, în timp ce implicarea acestui țesut în MVI este rar abordată. Aceste descoperiri moleculare ar putea arunca o nouă lumină asupra leziunilor tubulare acute, un criteriu ABMR bine stabilit, dar de mult neglijat. În plus, s-a demonstrat că celulele epiteliale pot secreta miR-222-3p exosomal și pot induce fenotipul M2 în macrofage (44). Între timp, Li și colab. foarte recent a raportat că macrofagele M2 supraexprimă miR-155 și furnizează acest miARN în micromediu, de asemenea, prin secretarea exozomilor. În transplantul de rinichi, miR-155 a fost crescut în diferite afecțiuni (IFTA, respingere acută și TCMR) și în lichidul sau țesuturile corporale (45). Interesant este că miR- 155 poate promova tranziția epitelial-mezenchimală prin țintirea RASSF4 în celulele epiteliale (46). Această diafonie bazată pe miARN între macrofage șirenalcelulele epiteliale rămâne de evaluat întransplant renalși mai ales în contextul MVI. În conformitate cu aceste constatări, am observat că miR-155-5p a fost exprimat în principal de APC-uri care cuprind monocite și macrofage. În acest subset special, ontologia genelor țintă miR- 155-5p a dezvăluit îmbogățirea căilor de îmbinare a premRNA. Interesant, Janssen et al. a raportat că inflamația pulmonară a indus căi de splicing pre-mARN în macrofagele alveolare. Mai mult decât atât, activarea pre-mRNA de îmbinare a diferit în macrofagele rezidente în țesuturi în comparație cu macrofagele derivate din monocite (recrutate cu sânge). Au fost raportate modificări ale metabolismului central la macrofagele recrutate, cu eflux crescut prin glicoliză și eflux scăzut prin ciclul acidului tricarboxilic (ciclul TCA, adică ciclul Krebs) (47). În ceea ce privește miR-150-5p, am constatat că supraexpresia sa în timpul MVI a fost asociată cu calea NF-kB din grupul de limfocite care cuprinde atât celulele NKT înnăscute, cât și celulele T adaptive. Interesant, miR-150-5p este crucial pentru a genera celule NK mature și funcționale (48), iar celulele CD8 plus T cu deficit de miR{-150-5p au fost raportate a fi mai puțin citotoxice (49). În plus, celulele T CD8 pot secreta, de asemenea, miR-150-5p în exozomi (50), care ar putea, la rândul lor, să promoveze activarea fibroblastelor în celulele epiteliale tubulare și ulteriorrenalfibroza, așa cum sugerează rapoartele recente (51, 52).

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Studiul nostru are unele limitări. Ne-am concentrat cercetările pe 6 miRNA-uri, identificate în mod consecvent în proiectarea noastră în mai multe etape. Cu toate acestea, am procedat cu o selecție pas cu pas de miARN, cu doar o fracțiune din toate miARN-urile cunoscute cuantificate în cohorta de validare. Calea statistică pentru selecția miARN-urilor s-a bazat pe designul inițial al BIOMARGIN, potrivit pentru a identifica biomarkeri de diagnostic pentru mai multe obiective (ABMR, dar și TCMR și IFTA). Prin urmare, deși a crescut semnificativ în cohortele de descoperire și selecție (Figura 2A), miR-146a nu a fost cuantificat în cohorta de validare. Prin urmare, miR-146a a fost exclus de facto din procesul nostru de selecție, deși literatura sugerează un rol în ischemie/reperfuzie în transplantul de rinichi (53) și în controlul mediat de Treg al răspunsurilor aloimune (54). Mai mult, nu putem exclude faptul că o dimensiune a eșantionului mai puternică ar fi produs mai multe miARN, cum ar fi miR-138 (jos) și miR-511 (sus), care au fost exprimate diferențiat în cazurile ABMR ale cohortei de selecție și a arătat o tendință în aceeași direcție în cohorta de descoperire. În plus, nu am efectuat analize sc-RNAseq pe propriile noastre probe de biopsie, ci am folosit un set de date sc-RNAseq disponibil online. La momentul proiectării studiului și al recoltării probelor de biopsie, tehnologia scRNAseq nu era încă disponibilă, iar nevoia de probe proaspăt colectate nu permitea utilizarea retrospectivă a probelor congelate sau încorporate în parafină. În mod similar, profilarea ARNm a fost realizată folosind microarrays, tehnologia de referință la acea vreme, care a fost acum depășită de ARN-seq de generația următoare. Utilizarea unui set de date sc-RNAseq disponibil online limitează capacitatea noastră de a raporta caracteristicile demografice de bază ale pacienților. Această informație lipsă ar putea ridica îngrijorări cu privire la reprezentativitatea grupurilor de populație. Mai mult, nu am controlat niciun aspect tehnic al secvențierii. Prin urmare, la rezoluția aleasă, analiza noastră sc-RNAseq nu a detectat niciun grup de neutrofile sau celule NK în aceste probe. Prin urmare, analizele noastre din aval ale miR-142-3p și miR{-223-3p au fost limitate la construirea rețelei și ontologiei respective a genelor țintă (Figura suplimentară S2) și nu au permis nicio explorare a rezoluției cu o singură celulă. Cu toate acestea, rețeaua de gene și ontologia celor 27 de gene țintă ale miR-223-3p au dezvăluit îmbogățirea ciclului TCA (Figura suplimentară S2) împreună cu semnalizarea ERBB. Astfel, putem specula că atât miR-155-5p în monocite, cât și miR-223-3p în neutrofile joacă un rol în metabolismul și răspunsul inflamator angajat de aceste celule în timpul MVI. În plus, miR-142-3p s-a dovedit deja a fi crescut în respingerea alogrefei de rinichi (9, 55, 56), dar până acum nu a fost asociat în mod specific cu ABMR. O altă limitare a studiului nostru este că modificările specifice ale expresiei genelor în celulele rare care se infiltrează ar putea fi mascate în analiza expresiei genice în vrac. Sunt necesare studii suplimentare care să includă mai multe probe pentru a permite investigarea adecvată a tuturor, chiar și a subtipurilor de celule rare, dar sunt în prezent limitate de costul relativ ridicat al tehnicii.

În concluzie, am investigat aici căile moleculare asociate cu MVI, principala leziune histologică legată de ABMR. Abordarea omică integrată utilizată ne-a permis să descoperim noi căi implicate în MVI și sugerează că modificările metabolismului epitelial tubular apar ca o consecință a ABMR, dincolo de compartimentul endotelial din apropiere. Studiul nostru ilustrează marele potențial al multi-omicelor de a dezlega mecanismele bolii și deschide calea către noi investigații pentru a elucida în continuare interacțiunea dintrerenalsubseturi de celule rezidente și alogrefe infiltrate.