Interacțiunile dintre antioxidanții polifenolici quercetină și naringenină dictă comportamentul chimic și biologic distinctiv legat de redox al amestecurilor lor Partea 1

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Cercetări efectuate în ultimele două decenii pe baza moleculară a bolilor cronice neinfecțioase precumateroscleroza, hipertensiune, diabetul și, în special, cancerul, care atrag interesul major, au dezvăluit că toate aceste boli au un factor de risc comun, care este perturbarea homeostaziei redox denumită adesea stres oxidativ12. Apare ca urmare a unui nivel endogen crescut al speciilor reactive de oxigen (ROS) din cauza eșecului barierei antioxidante a organismului și se crede că promovează dezvoltarea tuturor acestor boli.3. Astfel, a urmat presupunerea că factorii exogeni capabili să neutralizeze SRO, de exemplu antioxidanții din plante, ar putea contracara sau încetini dezvoltarea bolilor cronice și pot sprijini tratamentul acestora. Verificarea acestei ipoteze a inițiat studii detaliate asupra antioxidanților prezenți în alimentele care ar putea prezenta potențial preventiv4. Într-adevăr, mai multe studii rezumate în meta-analiză care compară consumul de alimente și bolile cronice legate de dietă au evidențiat un risc scăzut în cazul dietelor bogate în fructe și legume, cereale integrale, precum și băuturi precum vin, cafea și ceai. deci produse bogate în fitochimice antioxidante. Deloc surprinzător, s-a presupus că aceste substanțe odată izolate din sursele lor naturale, purificate și apoi consumate sub formă de suplimente alimentare care conțin doze mai mari decât cele realizabile în dietă ar putea deveni puternici agenți chimiopreventivi. Această presupunere a fost confirmată de un număr mare de dovezi provenite din studii care exploatează diferite modele experimentale in vitro și in vivo de boli cronice, inclusiv cancer. . De exemplu, două meta-analize ale investigațiilor de cohortă umană și caz-control cu ​​vitamina E8 sau preparate cu micronutrienți” au concluzionat că nivelurile scăzute de antioxidanți nu au avut niciun efect, în timp ce dozele mari ar putea crește atât incidența cât și mortalitatea cancerului și a bolilor cardiovasculare. suplimentele s-au bazat pe plante reale, cum ar fi un amestec specific de alimente concentrate bogate în polifenoli (rodie, ceai verde, broccoli și turmeric), a fost observat un efect protector semnificativ la bărbații cu cancer de prostată1.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Efectele promițătoare ale alimentelor integrale, în contrast cu compușii izolați, sunt în conformitate cu conceptul de sinergie alimentară, care este definit ca un aditiv sau mai mult decât influența aditivă a combinației diferitelor ingrediente alimentare asupra sănătății umane. Studiul nostru anterior a verificat acest concept prin compararea bioactivităților alimentelor reale cu antioxidantul major izolat al acestora. Acest lucru a arătat că efectele biologice ale extractelor din fructe de pădure diferă foarte mult de cele prezentate de antocianidin-3-O-glucozid. Alte rapoarte au indicat, de asemenea, importanța interacțiunilor dintre diferiți compuși bioactivi și componente ale matricei alimentare care s-au dovedit a fi factori cooperanți, care determină bioactivitatea finală a alimentelor3-1. Investigațiile noastre mecanice recente care implică reconstituirea treptată a compoziției de cacao a bioactivului au susținut, de asemenea, ideea de sinergie alimentară, dar au demonstrat că efectele biologice ale probelor cu compoziții complexe nu sunt doar o combinație a activităților afișate de componentele individuale3. Toate aceste observații au sugerat că atunci când se iau în considerare bioactivitățile legate de redox ale antioxidanților izolați față de amestecurile acestora, trebuie luate în considerare interacțiunile dintre componente. Complexitatea tot mai mare a unui amestec defitochimicepărea să creeze un nousubstanță redox-activămai degrabă decât să îmbogățească amestecul cu noi activități caracteristice compusului adăugat, ceea ce este dedus de conceptul de sinergie alimentară.

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

În cercetarea actuală, am simplificat sistemul experimental limitându-l la doar două structuri de bază pentru a aprofunda detaliile interacțiunilor lor în contextul structurii chimice, al reactivității redox și al bioactivităților legate de redox, astfel încât să permitem o mai bună înțelegere și Predicția potențialului chimiopreventiv al antioxidanților. „Fitochimicele utilizate în acest scop au fost antioxidanți obișnuiți prezenți în diferite plante, legume și fructe, în special în citrice, și anume: flavonoli reprezentați de quercetină (O) și ramno-side-rutina acesteia ( R) și flavanone de către naringenina (N-) și eineohesperidozidnaringină (N plus) precum și două amestecuri ale acestor compuși (QN-, RN plus). Compoziția chimică a studiului a cuprins determinări care au oferit o perspectivă asupra termodinamicii și cineticii proceselor oxidative, adică testul DPPH, titrarea potențiometrică și voltametria impulsului diferenţial (DPV). Testele biologice au examinat impactul probelor studiate asupra creșterii celulare (testul MTT), activității antioxidante celulare (testul CAA), genotoxicitatea (testul cometei), nivelul global de metilare a ADN-ului (versiunea epigenetică a testului cometă) și expresia 84 redox. -gene înrudite (tehnologii bazate pe matrice PCR în timp real). Experimentele biologice au fost efectuate folosind linia celulară recomandată pentru studiile nutriționale adenocarcinomului de colon HT29 ca model al epiteliului intestinal care poate fi expus la concentrații relativ mari de antioxidanți ingerați.

Rezultate

Investigațiile noastre anterioare care au comparat proprietățile legate de redox ale pudrei de cacao și ale constituenților săi principali au subliniat importanța interacțiunilor dintre componentele polifenolice ale amestecului asupra activității antioxidante generale. În cercetarea actuală, am simplificat sistemul experimental pentru a examina astfel de interacțiuni mai detaliat pentru o pereche de flavonoide care sunt componente alimentare comune. S-au ales doi flavonoizi, ambele sub formă de agliconi și glicozide. Flavonolii au fost reprezentați de quercetină (Q) și earamnozidă-rutină(R) șiflavanonede naringenina(N-) și naringina sa neohesperidozidă (N plus). Acești polifenoli diferă prin numărul și locația grupărilor hidroxil active redox, precum și prin capacitatea de a forma legături H intramoleculare, adică trei caracteristici structurale care pot interfera cu reducerea proprietăților compușilor antioxidanti. După cum se arată în Fig. 1, radicalii semichinonici intermediari s-au format în prima etapă de oxidare a fragmentului catecol din inelul B

de Q sau R poate fi stabilizat în două moduri:8,19. Prima modalitate este conjugarea atât a structurii miez peste inelele B și C, cât și formarea legăturii a doua H cu gruparea OH vicinală sau substituenții din ciclul C, în special în R. prezența grupărilor hidroxil în substituentul de zahăr în poziția 3 al inelului C poate spori și mai mult acest efect de stabilizare datorită mai multor posibilități de formare a legăturilor H (direct sau prin intermediul moleculei de apă), în contrast, radicalul fenoxil intermediar în N plus sau N- nu este stabilizat nici prin legături duble conjugate care implică și ciclul C sau H-legatură cu substituenții vecini. Mai mult, în N plus, fragmentul de zahăr este atașat de inelul A și, prin urmare, este prea departe pentru a forma legătura H cu radicalul din inelul B. Se poate aștepta ca aceste caracteristici structurale să influențeze activitatea redox a flavonoidelor studiate.

Activitate antioxidantă prin teste chimice.

Determinarea proprietăților reducătoare pentru polifenolii studiați și amestecurile acestora a fost efectuată prin două teste chimice la 37 grade C pentru a se potrivi condițiilor celulare ale proceselor redox. Prima metodă a fost testul DPPH spectrofotometric pe lot utilizat în mod obișnuit; rezultatele pentru flavonoidele individuale și amestecurile acestora sunt prezentate în Fig. 2A. Ele sunt exprimate ca valori ale stoichiometriei n unde cifra 10 se referă la durata reacției—10 min. Prin introducerea parametrului de timp în măsurători, un aspect cinetic a fost încorporat în evaluarea activității antioxidante, așa cum a fost descris mai devreme13. În aceste determinări, ambii agliconi au prezentat proprietăți reducătoare mai puternice decât glicozidele corespunzătoare, așa cum a fost demonstrat anterior și cu acest test2021, în timp ce flavonolii au fost mai puternici. active decât flavanone. O a fost compusul cel mai eficient în eliminarea radicalului DPPH și a fost urmat de R. În ciuda reactivității neglijabile față de DPPH, ambele flavanone, inclusiv N care în sine nu au prezentat proprietăți redox în perioada de 10 minute a reacției, au crescut semnificativ activitatea antioxidantă totală a amestecuri, atât în ​​cazul agliconilor ON- cât și al glicozidelor RN plus .

A doua metodă a implicat titrarea potențiometrică (PT) care permite măsurarea potențialului standard de reducere (E) și, astfel, a evaluat capacitatea termodinamică a compușilor puri de a câștiga electroni. Valorile determinate de Confirmat că Q și R sunt compuși reducători puternici (Fig. 2B). Cu toate acestea, în PT, R a acceptat electronii donatori mai binevoitor decât Q. Determinarea lui E pentru N- și N plus nu a fost posibilă din cauza transferului foarte lent de electroni în timpul procesului de oxidare (mai lent pentru N plus). PT măsoară diferența de potențial dintre electrodul de referință și electrodul de măsurare după adăugarea fiecărei porțiuni de titrant. Potențialul constant înseamnă că raportul de reacție (Q) dintre titrant și analit este stabil (Q= constant). Dacă rata de transfer a sarcinii în timpul unei reacții este scăzută (curenți scăzuti în voltametrie), atunci este nevoie de mult timp pentru a stabiliza Q în PT. În consecință, pentru reacții foarte lente, curba potențiometrică de titrare este dificil de obținut și astfel, valoarea găsită a lui E" este mai puțin sigură.

Activitatea antioxidantă prin voltametrie diferenţială cu impulsuri,

Testele chimice utilizate au sugerat că elucidarea acțiunii antioxidante a polifenolilor trebuie să țină cont de aspectele cinetice, în care stabilitatea radicalilor intermediari ar putea juca un rol. După cum este ilustrat în Fig. 1, radicalii semichinonici formați în prima etapă a oxidării flavanolului sunt mult mai bine stabilizați decât radicalii fenoxil care apar la oxidarea flavanonei. Această relație este ilustrată în Fig. 1 și poate afecta rata proceselor redox. Prin urmare, proprietățile de reducere-oxidare ale antioxidanților puri studiati și ale amestecurilor acestora au fost analizate în continuare cu ajutorul voltametriei diferenţiale cu impulsuri (DPV). Deoarece această tehnică permite monitorizarea atât a aspectelor termodinamice, cât și cinetice ale reacțiilor de oxidare, ambele sunt în cele din urmă combinate într-un parametru numit putere antioxidantă (AOP)15.

Observațiile făcute cu măsurători DPV (Fig.2B-F) le contrazic pe cele obținute cu testul DPPH (Fig.2A). În mod surprinzător, DPV a dezvăluit că Q descris în literatură ca un reductor excelent, luând în considerare doar aspectele termodinamice (potenţial de vârf anodic, E.), sa dovedit cel mai slab antioxidant (Fig.2B, C). Din punct de vedere termodinamic, R a fost un antioxidant puțin mai puternic. Interesant este că N-și N plus sunt considerați în literatură ca antioxidanți slabi, prezentând termodinamic cele mai mari valori ale E, ceea ce înseamnă că erau agenți reducători foarte puternici. Pentru ambele clase de flavonoide, porțiunea glicozidă a crescut activitatea antioxidantă a agliconilor. Cu toate acestea, parametrii legați de cinetică (Fig. 2E, F), adică curentul anodic (I,.) și densitatea de sarcină (Q), au arătat că oxidarea N plus este procesul mai lent în comparație cu oxidarea Q și R. În mod similar , curentul anodic (I) a fost mai mic pentru N- decât pentru Q și R, dar transferul de sarcină pentru acest compus a atins cea mai mare valoare.

În cazul amestecurilor, s-au detectat două vârfuri anodice (1 și 2) pe curbele voltametrice, așa cum era de așteptat pentru amestecul cu două componente. Valorile determinate ale potențialelor de vârf anodice (E.) au indicat că primul vârf observat reflectă oxidarea flavonolilor, în timp ce 2" d vârful oxidarii flavanonelor (Materiale suplimentare-Fig. S1). În cele mai multe cazuri, prezența celeilalte componente în un amestec a influențat termodinamica și/sau cinetica procesului redox în comparație cu oxidarea compușilor puri.De exemplu, pentru QN-, valoarea lui E., pentru primul vârf de oxidare a fost egală cu potențialul de vârf anodic al lui Q oxidare. Cu toate acestea, vârful anodic de 2" corespunzător oxidării N și potențialul acestei tranziții a fost mai mare decât potențialul anodic al N- pur (Fig.2C). S-a observat situația opusă pentru cinetica acestei reacții. Picul anodic I și Q al lui 1s al QN au fost aproape de parametrii cinetici ai oxidării componentelor pure (Fig. 2E, F), în timp ce sarcina schimbată în timpul etapei 2n de oxidare ON a fost mult mai mică decât cea pentru N-oxidare (Fig.2F). Aceste efecte termodinamice și cinetice combinate au dus la îmbunătățirea AOP (Fig. 2D) a acestui amestec, ceea ce este în acord cu rezultatele testului DPPH.

Evaluarea citotoxicității.

Impactul agliconilor flavonoizi studiati (Q, N-), glicozidelor (R, N plus ) și al amestecurilor acestora (QN-, RN plus ) asupra creșterii celulelor intestinale a fost evaluat prin testul MTT. Linia celulară de adenocarcinom de colon uman HT29 a fost aleasă ca model de epiteliu al tractului alimentar, adică țesutul aflat în contact direct cu ingredientele alimentare ingerate precum polifenolii. Celulele au fost tratate cu flavonoide individuale și amestecurile lor la concentrații fiziologice care pot apărea în sânge (0.01-1 uM)22-2 sau concentrații atinse în tractul digestiv (10-100 uM) după ingerarea alimentelor25-27. Curbele doză-răspuns pentru tratamentele de 6, 24 și 72 de ore sunt prezentate în Fig.3.

Compușii individuali nu au influențat semnificativ creșterea celulelor la niciuna dintre concentrațiile investigate, nici pentru tratamente scurte, nici prelungite. Excepția a fost cea mai mare concentrație de N-care după 72 de ore a inhibat creșterea celulelor cu până la 75 la sută în comparație cu martor. În schimb, amestecurile investigate (QN-, RN plus) au stimulat în mod semnificativ creșterea celulară într-o manieră dependentă de concentrație pentru toți timpii de expunere testați. Acest efect a fost observat la concentrații scăzute (0.01-1 uM) fiind accesibil în fluxul sanguin și a fost și mai puternic la concentrații mai mari ({10-100 uM) la care celulele epiteliale ale tractului digestiv poate fi expus. Doar în cazul celei mai mari concentrații de QN-, după 72 de ore de tratament, stimularea a încetat, probabil din cauza efectelor inhibitoare observate în astfel de condiții pentru N-. Activitate antioxidantă celulară. Eficiența flavonoidelor purificate și a amestecurilor lor în susținerea barierei antioxidante endogene a celulelor HT29 a fost verificată cu ajutorul testului CAA. Această metodă se bazează pe capacitatea unei probe care conține compuși redox-activi de a inhiba sau de a promova oxidarea sondei absorbite. de către celule la forma sa fluorescentă. Atenuarea oxidării sondei, observată ca stingerea fluorescenței, este o măsură a capacității reducătoare a antioxidanților din celule (valori pozitive CAA), în timp ce creșterea oxidării sondei denotă activitatea lor pro-oxidativă (valori CAA negative)28 . Determinările au fost efectuate pentru agliconi și glicozide la concentrații care reflectă atât expunerile intestinale fiziologice – endogene – cât și derivate din alimente – exogene. Incubarea cu flavonoide studiate a fost efectuată pentru o perioadă standard recomandată de 1 h18 pentru agliconi și glicozide. Tratamentele prelungite (3 și 6 ore) care vizează monitorizarea cineticii răspunsului redox în modelul celular aplicat au fost utilizate numai în cazul agliconilor, datorită impactului lor mai proeminent asupra activității antioxidante celulare.

Flavanone și flavonolii investigați au fost diferite în ceea ce privește impactul lor asupra stării redox a celulelor HT29. În cazul agliconilor individuali, răspunsurile definite dependente de concentrație au fost observate după 1 oră de expunere. Cu toate acestea, activitatea antioxidantă a flavonolului-Q a crescut cu concentrația aplicată, în timp ce în cazul flavanonei-N-a fost observată creșterea treptată a efectului pro-oxidativ (Fig. 4A). Dependența de doză a glicozidelor individuale a fost mai puțin evidentă; numai R la cea mai mare concentrație a crescut în mod convingător activitatea antioxidantă celulară (Fig. 4A). Interesant este că ambele amestecuri au prezentat o activitate antioxidantă îmbunătățită, aparent nefiind influențată de efectul pro-oxidativ observat pentru compuși individuali.

Figura 4B prezintă cinetica modificărilor valorilor CAA determinate după tratamentul l,3 și 6h al celulelor HT29 cu agliconi. Pentru cea mai mică concentrație (1 μM), expunerile fiziologice potrivite, dependența de timp nu a fost observată nici pentru agliconi individuali, nici pentru amestecul acestora. Cu toate acestea, influențele concentrației mai mari asupra valorilor CAA au fost în mod clar dependente de timp. Expunerea prelungită a scăzut atât efectul pro-oxidant al N-, cât și activitatea antioxidantă a Q și QN-.

Agliconii investigați au prezentat activitate nutrigenomică diferită, modificată suplimentar de concentrația aplicată celulelor.

Flavanone N-la 1 μM a scăzut semnificativ expresia CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Această flavanonă aplicată celulelor HT29 la 10 uM a influențat expresia a 5 gene, care au fost, de asemenea, reglate în jos de doza sa mai mică, și anume: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutarea radicalilor superoxid în peroxid de hidrogen şi oxigen6. Creșterea ușoară a expresiei cauzată de N-la 10uM a fost observată doar pentru gena VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Acest articol este extras de pe www.nature.com/scientificreports