Amplificarea intramusculară cu HIFN-Alpha 2b îmbunătățește protecția indusă de BCGphipps într-un model murin de lepră

Abstract:

Imunitatea gazdei la Mycobacterium leprae cuprinde un spectru de mecanisme care variază de la protecția determinată de imunitatea celulară la deteriorarea asociată cu imunitatea umorală, ca în reacțiile de tip-2 lepră. Deși interferonii de tip I (IFN) participă la eliminarea agenților patogeni intracelulari, contribuția lor la producerea de anticorpi și CD3 plus FOXP3 plus celule T reglatoare (Tregs) în protecția mediată de vaccin BCG în lepră este necunoscută. Amorsarea BCGphipps (BCGph) urmată de hIFN- 2b intramuscular stimulează dimensiunea redusă semnificativ a leziunii și creșterea Mycobacterium lepraemurium în piele. Celulele reglatoare foliculare T (TFR), un subset de Treg induse de imunizare sau infecție, rezidă în centrele germinale (GC) și modulează producția de anticorpi.

Am găsit inducerea Treg afectată și GC îmbunătățite în ganglionii limfatici de drenare ai șoarecilor amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b. În plus, acești șoareci au provocat cantități semnificative de IL-4 și IL-10 în ser. Astfel, rezultatele noastre susțin proprietățile adjuvante ale hIFN- 2b în contextul amorsării BCGph pentru a îmbunătăți imunitatea protectoare împotriva lepra cutanată.

Imunitatea de protecție se referă la capacitatea organismului de a se apăra împotriva agenților patogeni infecțioși prin producerea de anticorpi, celule T etc. și este unul dintre mecanismele importante pentru rezistența organismului la boli. Imunitatea se referă la capacitatea organismului de a recunoaște și de a răspunde la diferite substanțe străine (inclusiv agenți patogeni, corpi străini, celule tumorale etc.), inclusiv imunitatea celulară și imunitatea umorală. Imunitatea protectoare este o parte a imunității, iar cele două sunt strâns legate. O bună imunitate poate promova îmbunătățirea imunității protectoare, pentru a preveni mai bine apariția bolilor. În același timp, îmbunătățirea imunității de protecție poate crește și imunitatea, permițând organismului să facă față mai bine diferitelor provocări externe. Prin urmare, menținerea unui sistem imunitar sănătos, inclusiv o bună imunitate protectoare, este foarte importantă pentru menținerea sănătății bune. Din acest punct de vedere, imunitatea este, de asemenea, foarte importantă. Dacă vrem să ne îmbunătățim imunitatea, Cistanche ne poate îmbunătăți semnificativ imunitatea umană. Polizaharidele din Cistanche pot regla răspunsul imun al sistemului imunitar uman și pot îmbunătăți celulele imunitare. Capacitatea de stres, sporește efectul bactericid al celulelor imune.

Faceți clic pe beneficiile pentru sănătate ale cistanche

Cuvinte cheie:

Mycobacterium lepraemurium; lepra murină; interferon alfa; BCGphipps; centre germinative; celule T reglatoare.

1. Introducere

Mycobacterium leprae și Mycobacterium lepromatosis, agenții etiologici ai leprei umane [1,2], afectează pielea și nervii periferici [3]. Deși sunt disponibile tratamente cu mai multe medicamente (MDT) pentru lepră, numărul de cazuri noi rămâne stabil (700,000 pe an).

În plus, lipsa unei proceduri de diagnosticare eficientă face dificilă urmărirea transmiterii M. leprae [4–7]. Predispoziția genetică la lepră precoce [8] subliniază necesitatea unui diagnostic oportun și a dezvoltării unor imunoterapii cu costuri reduse pentru a reduce incidența lepră în țările dezvoltate [9,10]. Spectrul de manifestări clinice în lepră se corelează cu tipul de răspuns imun provocat. De exemplu, lepra tuberculoidă (TT), caracterizată printr-un răspuns Th1 dominant, restricționează creșterea bacililor prin activarea determinată de IFN a funcțiilor microbicide ale macrofagelor. În schimb, producția de citokine Th2 clasice (IL-4 și IL{-10) a fost asociată cu pierderea protecției și creșterea bacilară îmbunătățită în lepra lepromatoasă diseminată (LL) [10]. Există, de asemenea, subtipuri intermediare care reprezintă un amestec de răspunsuri Th1 și Th2 [10].

Infecția șoarecilor cu M. lepraemurium (MLM) [11,12] a fost folosită pentru a studia mecanismele imunologice ale leprei umane [11-13], chiar dacă MLM nu prezintă tropism pentru nervii periferici [11,13] ca M. leprae. face [14]. Cu toate acestea, ambele micobacterii sunt necultivabile și cresc lent în gazdă, dublându-și numărul în 1-3 săptămâni.

Infecția subcutanată experimentală cu doze mici de bacterii imită îndeaproape boala naturală care apare de obicei atunci când ruperea barierelor facilitează colonizarea micobacteriană, declanșând o reacție imună la nivel periferic [13,15–17]. În timp ce imunitatea mediată celular (CMI) este afectată, imunitatea umorală este practic neafectată în lepra umană și murină [18]. În plus, celulele Th1- sau Th{2-, alte limfocite T, modelează imunitatea gazdei la infecția cu M. leprae [18,19].

Este intrigant modul în care M. leprae influențează imunitatea gazdei în diferitele subtipuri de boli micobacteriene. O ipoteză este că agentul patogen reglează în jos imunitatea umorală și celulară a gazdei pentru a infecta pielea și nervii periferici [3,14,15]. Există, de asemenea, dovezi că bacilul afectează activarea macrofagelor. De asemenea, scade expresia TNF-alfa și a moleculelor precum prostaglandinele care induc producția de IL-1 și intermediari reactivi de oxigen și azot (ROI și RNI), critici în funcțiile micobactericide ale macrofagelor [20-22].

Răspunsurile umorale generate în GC-urile țesuturilor limfoide secundare și terțiare participă la imunitatea protectoare împotriva agenților patogeni [23-26]. Un raport recent despre lepră a evidențiat rolul critic al Tregs în inhibarea răspunsurilor celulelor Th1 și Th17 [19]. Într-adevăr, echilibrul dintre aceste subseturi de celule T la nivelul GC [27–29] dictează rezultatele protectoare sau patologice ale bolilor infecțioase și autoimune [30,31] și este esențial pentru dezvoltarea terapiilor pentru inducerea imunității protectoare [26,27] ].

În special, celulele foliculare T helper (TFH) și în special celulele T foliculare reglatoare (TFR) modulează răspunsul GC pentru a induce răspunsuri imune umorale de lungă durată, prevenind în același timp producerea de autoanticorpi [32,33]. Având în vedere că IFN de tip I este asociat atât cu generarea de TFH, cât și de Treg, acesta apare ca un adjuvant promițător pentru a stimula răspunsurile TFH în GC în contextul vaccinării BCG [34].

Administrarea mucoasei a IFN-urilor de tip I induce maturarea celulelor dendritice și generarea de CXCR5 plus CD4 plus TFH, facilitând dezvoltarea GC și producerea de anticorpi de mare afinitate în ganglionii limfatici [34]. În schimb, IFN-urile de tip I abrogă imunitatea gazdei în tuberculoza umană prin inhibarea producției de oxid nitric sintetazei inductibile (iNOS), IL-12p40, IL-1A și IL-1 în timp ce induc Antagonişti IL-10 şi IL{-1R [35–38]. Astfel, participarea IFN-urilor de tip I este dependentă de context [38–42]. IFN-urile de tip I sunt produse la un nivel constant, dar odată ce un agent patogen intracelular invadează gazda, sunt induse mai multe răspunsuri înnăscute antivirale sau antibacteriene eterogene și complexe [43–48], inclusiv schimbarea clasei de anticorpi, hipermutația somatică și îmbunătățirea. disponibilitatea antigenului în GC care va duce la răspunsuri puternice și eficiente de anticorpi [34,49].

Am raportat anterior protecția conferită de stimularea succesivă intramusculară de IFN la șoareci vaccinați cu Mycobacterium bovis BCG și provocați cu MLM [42] sau împotriva provocării aerosolizate cu M. tuberculosis [41]. La șoarecii provocați cu MLM, protecția s-a corelat cu producția îmbunătățită de iNOS, oxid nitric și anticorpi IgG3 [42]. În contextul provocării cu M. tuberculosis, șoarecii protejați au provocat un răspuns Th1 [41].

Într-un studiu mai recent, IFN-urile de tip I au modulat autofagia și metabolismul în lepră [50]. Am decis, în acest studiu, să investigăm în continuare protecția împotriva leprei murine induse de vaccinarea cu M. bovis BCGphipps (BCGph) și o prezentare farmaceutică a IFN- 2b uman [51]. În studii recente, un BCG recombinant care exprimă IFN- 2b uman a fost utilizat pentru a trata cu succes cancerul vezicii urinare [51–55]. În concordanță cu aceste date, scopul nostru în acest studiu a fost să analizăm protecția indusă de amorsarea BCGph și stimularea hIFN- 2b într-un model murin de lepră. În total, rezultatele noastre au în vedere potențialul amorsării subcutanate cu BCGph și stimularea intramusculară a hIFN- 2b pentru a induce imunitatea protectoare împotriva lepra umană.

2. Material și Metode

2.1. Animale

Șoarecii Balb/c fără agenți patogeni specifici au fost crescuți și găzduiți în facilitățile pentru animale ale Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional din Mexico City.

Toate experimentele pe animale au fost efectuate după aprobarea (07 martie 2014) de către Comitetul Instituțional de Îngrijire și Management al Animalelor (CIE-ENCB ZOO 016/2014).

2.2. Microorganisme

Tulpina BCG Phipps (ATCC® 35744™) (BCGph) este o variantă a tulpinii BCG care a pierdut regiunea RD1 care codifică ESAT-6 și CFP1{0, cu cel mai mic număr de epitopi de celule T , 316, față de BCG Tokyo, 359 și BCG Pasteur, 331, (Zhang și colab., 2013) [51] și a fost furnizat de Dr. Hernández-Pando (INCMNSZ, Mexico City, MX). Suspensiile de vaccin au fost apoi păstrate la –80 ◦C până la utilizare. Tulpina necultivabilă Mycobacterium lepraemurium (MLM) a fost izolată din splina șoarecilor care suferă de o infecție de patru luni printr-o procedură descrisă de Prabhakaran și colab., 1976 [56], urmată de purificare folosind procedura de izolare personală descrisă de Draper P. , 1980 [57]. Pe scurt, 4 g de țesut splenic au fost suspendate în 20 ml de zaharoză 0,2 M și măcinate într-un omogenizator de sticlă de tip Potter-Elvehjem. Suspensia rezultată a fost centrifugată timp de 20 de minute la 150 x g pentru a îndepărta resturile celulare (Sorvall RV5B, rotor HB4) (Sorvall Instruments, Wilmington, DE, SUA). Apoi, 9 ml de supernatant au fost suprapuse pe 12 ml de zaharoză 0,3 M și tuburile au fost centrifugate la 3500 x g timp de 10 minute la 4-10 °C (Sorvall RC5B). Peletul bogat în bacili rezultat a fost resuspendat în 20 mL de zaharoză 0,2 M, iar alicote de 9 mL au fost suprapuse pe 12 mL de KCI 1,5 M.

Apoi, tubul a fost centrifugat la 4 ◦C timp de 10 min la 3500× g. Bacilii au fost colectați, spălați de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (0,01 M Na/K fosfat, 0,15 M NaCI, pH 7,4) și resuspendați în 40 mL dintr-o soluție care conține un amestec de Percoll (3 părți) și 0,1 procente Tween 80 (7 părți). Suspensia a fost centrifugată la 23,000× g. Peletul bacilar a fost colectat și spălat de cinci ori cu PBS până la eliminarea Percoll. Puritatea preparatului bacilar a fost confirmată prin colorația Ziehl-Neelsen. Suspensia bacilară purificată a fost preparată în mediu sintetic 7H9 Middlebrook brothOADC (DIFCO, Detroit, MI, SUA) (mediu 7H9-OADC) și cuantificată printr-o curbă de referință nefelometrică preparată cu cantități cunoscute de bacterii. Suspensia bacilară a fost alicotată și congelată la -20 ◦ C, până când este gata de utilizare.

2.3. Imunizări

Grupuri de șoareci Balb/c în vârstă de opt săptămâni (n=6) au fost imunizate subcutanat cu 8 × 103 unități formatoare de colonii (CFU) de BCGphipps în 200 uL PBS steril. O lună mai târziu, fiecare grup de șoareci a fost stimulat intramuscular timp de trei zile consecutive (30, 31 și 32 de zile după vaccinare) cu 100 µL de PBS sau cu 100, 200 sau 300 de unități internaționale (UI) de hIFN{{14} }b (Urifron, Probiomed, Azcapotzalco, Mexico City, Mexic).

2.4. M. lepraemurium Challenge

Pentru experimentele de provocare, șoarecii au fost inoculați intradermic cu 2 × 106 MLM viabil în 20 µL de PBS. Apoi, șoarecii au fost găzduiți în condiții standard și furnizați cu apă purificată și chipsuri de mâncare pentru rozătoare Purina (Cuautitlan Izcalli, Mexic) ad libitum. Șoarecii infectați au fost monitorizați timp de opt săptămâni, momentele în care leziunile au fost evidente în pielea animalelor infectate. Progresia bolii a fost variabilă la șoareci și a fost corelată cu terapiile experimentale (PBS, BCGph sau hIFN- 2b).

2.5. Teste imunosorbente legate de enzime (ELISA)

Anticorpii din serurile șoarecilor infectați cu MLM au fost măsurați prin teste imunosorbente indirecte legate de enzime (ELISA). Pe scurt, plăcile de godeuri (Nunc, Rochester, NY, SUA) au fost acoperite peste noapte la 4 ◦C, cu 1,0 µg de peptidoglicolipide dizolvate în etanol [38]. După evaporarea etanolului la temperatura camerei [37], legarea nespecifică a fost blocată cu 3% lapte degresat în PBS de la 2 la 3 ore. După eliminarea soluției de blocare, 0,1 ml de ser diluat (1:100) în 1% lapte degresat în PBS a fost adăugat în godeuri și incubat peste noapte la 4 ◦C.

Apoi, plăcile au fost spălate extensiv cu PBS și anticorpii legați au fost detectați cu {{0}},1 ml de IgG anti-șoarece (1:4{000, BD 550487, BD Pharmingen, San Diego, CA, SUA), IgG1-HRP (1:2500, ab 97240, Abcam, Cambridge, MA, SUA), IgG2a-HRP (1:2500, ab97245, Abcam), IgG2b-HRP (1: 2500, ab97250, Abcam) sau IgG3-HRP (1:2500, ab97260, Abcam) sau anticorp monoclonal IgA anti-șoarece de șobolan conjugat cu biotină (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen), urmat de Anticorp Ig anti-șoarece de șobolan conjugat cu peroxidază de hrean (HRP) (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen) sau avidin-HRP (ab 59653, abcam) Substratul cromogen, tetrametil-benzidină în 0,05 M tampon citrat-Hrean 5.2), suplimentat cu 0,01% peroxid de hidrogen (H2O2), a fost adăugat în godeuri pentru dezvoltarea culorii. Reacţia a fost oprită cu H3PO4 1 M. Densitățile optice au fost măsurate la 450 nm într-un cititor ELISA de microplăci (LabSystems Multiskan Plus, LabX, Midland, ON, Canada). IFN-, IL-4, IL{-17, IL{-6, TNF- și IL{{-10 au fost măsurate în ser cu truse ELISA specifice sandwich (PEPROTEC Inc., Cranbury , NJ, SUA). conform instructiunilor producatorului.

2.6. Măsurătorile NO în serul șoarecilor

Pe scurt, serurile au fost tratate cu etanol (1:1) pentru a precipita proteinele și alți factori de interferență. După centrifugare la 3000 rpm timp de 20 de minute, 20 µL de ser recuperat au fost plasați în godeurile unei plăci ELISA împreună cu 100 µL de reactiv Griess și 80 µL de apă distilată. Reactivul Griess este un amestec volum-volum de soluție A (2% sulfanilamidă în 5% acid fosforic) și soluție B (0,1% N-(1-naftil) etilendiamină, diclorhidrat. După o incubare de 30 de minute la 25◦ C, culoarea roz dezvoltată a fost înregistrată într-un cititor ELISA la 595 nm. Valorile au fost extrapolate la o curbă standard de nitrit de sodiu în intervalul 1–100 µM.

2.7. Imunofluorescență

Anticorpii primari au fost obținuți de la următoarele companii: Goat anti-iNOS (clona M-19, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SUA), Rabbit anti-nitrotyrosine (AB 5411, EMD, Millipore, Burlington, MA, SUA) ), biotină șobolan Ly6C/Ly6G (clona RB6-8C5, BD Pharmingen), capră anti-CD3 epsilon (Clone M{-20, Santa Cruz Biotechnology), șobolan antișoarece FoxP3 (clona FJK{{12} }s, eBioscience, San Diego, CA, SUA), antigen nuclear de capră anti-proliferare celulară (clona C-20, Santa Cruz Biotechnology), FITC-aglutinină de arahide (L{7381- 1MG, SIGMA, St. Louis, MO, SUA) și CD45R anti-șoarece APC-șobolan (clona RA3-6B2, BD Pharmingen).

Anticorpii primari au fost descoperiți cu următorii anticorpi secundari: Alexa Fluor 568 IgG anti-capră de măgar (A11057, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), Alexa Fluor 488 IgG anti-iepure de măgar (711-546, Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove, PA, SUA) și Alexa Fluor 680 streptavidină (S32358, Thermo Fisher Scientific).

Secțiunile parafinate fixate cu formalină de cinci µm au fost incubate la 60 ◦C peste noapte pentru deparafinizare. Secțiunile de țesut au fost transferate rapid în xilen (247642-2.5L, SIGMA) și hidratate prin imersarea secvențială a lamelor în alcool absolut, 96% alcool, 70% alcool și apă. Lamele au fost scufundate într-o soluție de extragere a antigenului, fierte timp de 30 de minute și răcite timp de 10 minute la temperatura camerei (RT). Lamele au fost clătite de mai multe ori cu apă și transferate în PBS. Legarea nespecifică a fost blocată cu 5% ser normal de măgar în PBS care conține 0,1% Tween 20 și 0,1% Triton-X-100, timp de 30 de minute la temperatura camerei într-o cameră umedă. Anticorpii primari au fost adăugați la lame și incubați peste noapte într-o cameră umedă la temperatura camerei. Lamele au fost spălate ușor în PBS și anticorpii secundari marcați fluorescent au fost incubați timp de 2 ore, la RT sau peste noapte într-o cameră umedă.

În cele din urmă, lamele au fost clătite timp de 1 oră în PBS și montate cu mediu de montare antidecolorare Vectashield cu DAPI (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA). Fotografiile au fost realizate cu un microscop Zeiss Axioplan. Toți centrii germinali (GC) dintr-o secțiune de ganglioni limfatici au fost măsurați cu un instrument automat al microscopului Carl Zeiss, iar dimensiunea medie a GC a fost calculată folosind software-ul Prism. CD3 plus FoxP3 plus Tregs au fost numărate în 5 câmpuri aleatoare de 200 × pe țesut pentru a calcula numărul mediu de celule pozitive pe câmp.

2.8. Analize statistice

Diferențele semnificative statistic între grupuri au fost calculate prin ANOVA unidirecțională, comparații multiple Newman-Keuls, testul t Student cu două cozi nepereche/împerecheat și valorile P < 0.05 au fost considerate a fi semnificative statistic. Diferențele statistice au fost calculate cu Graph Pad Prism.

3. Rezultate

3.1. Amorsarea BCGphipps (BCGph) urmată de stimularea intramusculară succesivă a hIFN- 2b protejează șoarecii Balb/c de provocarea intradermică cu M. lepraemurium.

Am dezvoltat anterior un protocol de prime-boost bazat pe stimularea intramusculară succesivă a IFN după vaccinarea BCG a șoarecilor [42] cu rezultate promițătoare de protecție. Studii recente au folosit un recombinant BCG care exprimă IFN- 2b uman pentru a trata cancerul vezicii urinare [51,53]. Prin urmare, în studiul de față, scopul nostru a fost să analizăm protecția indusă de amorsarea BCGph urmată de stimularea hIFN- 2b într-un model murin de lepră, urmând schema prezentată în Figura 1.

Figura 1. Protocolul Prime-boost pentru a evalua protecția șoarecilor împotriva provocării intradermice cu M. lepraemurium. Grupuri de șoareci Balb/c (n=6) au fost vaccinați subcutanat cu o doză mică de BCGph (8 × 103 CFU). Șoarecii din fiecare grup au fost stimulați intramuscular în zile consecutive (30, 31 și 32 de zile după vaccinare) cu PBS sau hIFN- 2b. Șoarecii au fost provocați cu 2 × 106 MLM viabil la opt săptămâni după ultima stimulare. După aceea, șoarecii au fost sacrificați și biospecimenele au fost colectate la opt săptămâni după provocare. Dezvoltarea leziunilor cutanate a fost monitorizată și măsurată așa cum este descris în Material și Metode.

Pe scurt, șoarecii au fost provocați intradermic cu MLM, la opt săptămâni după a treia intensificare cu 300 UI de hIFN- 2b. Progresia bolii a fost monitorizată în următoarele opt săptămâni. La sfârșitul acestei perioade, am colectat ganglioni limfatici inghinali pentru a detecta GC și a enumera Treg și alte populații de celule prin imunofluorescență. De asemenea, am folosit imunofluorescența pentru a vizualiza producția de iNOS de către macrofagele activate, locația reziduurilor de nitrotirozină (NT) și acumularea de celule Gr-1 plus mieloide în pielea șoarecilor noștri experimentali. În plus, am colectat serul pentru a măsura citokinele și anticorpii la glicolipidele MLM prin ELISA (Figura 1).

În primul rând, pentru a evalua efectul protector al amorsării cu BCGph și al stimulării hIFN{{0}}b împotriva provocării intradermice a șoarecilor cu MLM, am măsurat leziunile pielii și am vizualizat colonizarea cu bacili a pielii prin colorația Ziehl-Neelsen. (Figura 2A–E). Pielea șoarecilor neamorși care au primit doar vehicul (PBS), fără provocare MLM, nu a prezentat bacili (Figura 2A). Șoarecii inoculați cu vehiculul și provocați cu MLM au prezentat cantități mari de bacili MLM în piele (Figura 2B), în timp ce amorsarea șoarecilor cu BCGph a condus la o reducere a creșterii micobacteriene (Figura 2C). Administrarea succesivă de hIFN- 2b a redus, de asemenea, creșterea micobacteriană în piele, în comparație cu șoarecii provocați cu MLM (Figura 2D). Șoarecii amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b au avut cea mai scăzută creștere micobacteriană (Figura 2E). În concordanță cu aceste date, șoarecii sănătoși provocați cu MLM care au primit doar vehicul (PBS) au dezvoltat cele mai extinse leziuni ale pielii (35 ± 9,9 mm2), în timp ce șoarecii care au fost amorsați cu BCGph au avut leziuni cutanate de dimensiuni similare cu cele dezvoltate în șoarecii au inoculat vehiculul și au provocat MLM (13,5 ± 4,24 mm2) (Figura 2F). Șoarecii injectați subcutanat cu hIFN- 2b au prezentat leziuni cutanate mai mici (20 ± 1,77 µm2). De notat, șoarecii care au fost amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b au arătat o reducere semnificativă a dimensiunii leziunii cutanate (5 ± 7,07 mm2) (p < 0,05) (Figura 2F).

\

Figura 2. Leziuni cutanate și creștere micobacteriană la Balb/c provocate cu M. lepraemurium. Protecția șoarecilor a fost evaluată prin dezvoltarea leziunilor cutanate și vizualizarea creșterii micobacteriene în leziunea cutanată la opt săptămâni după provocarea cu MLM. Leziunile cutanate au fost colorate cu Ziehl-Neelsen. Imagini reprezentative de 400× măriri ale (A) șoareci neamorși și șoareci necontestați; (B) șoareci inoculați cu PBS și provocați cu MLM; (C) șoareci amorsați cu BCGph și provocați cu MLM; (D) șoareci inoculați intramuscular cu hIFN- 2b și provocați cu MLM; (E) șoareci amorsați cu BCGph, stimulați cu hIFN- 2b și provocați cu MLM; (F) Protecția eficientă este echivalentă fie cu absența leziunilor cutanate, fie cu o reducere semnificativă a dimensiunii leziunilor cutanate, exprimată în mm2, n=6 șoareci/grup. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

3.2. Patologia cutanată minimă la șoareci amorsați cu BCGphipps și stimulați cu hIFNa 2b se corelează cu scăderea acumulării de nitrotirozină și infiltrarea afectată de neutrofile

Oxidul nitric este esențial pentru uciderea agenților patogeni intracelulari. Cu toate acestea, producția excesivă de oxid nitric, radical superoxid (O,- și peroxid de hidrogen duce la generarea de peroxinitrit toxic și instabil, o moleculă care reacționează cu reziduurile de tirozină de pe proteine ​​pentru a forma NT stabil 56-601. Deși peroxinitrit ucide micobacteriile, de asemenea, dăunează celulelor imune [57-59].

Astfel, am decis să căutăm celule producătoare de iNOS și neutrofile în pielea șoarecilor noștri experimentali prin imunofluorescență. Am văzut semnale de fundal pentru iNOS și NT și foarte puține celule Gr-1 plus în pielea șoarecilor care primesc doar PBS (Figura 3A). Creșterea încărcăturii micobacteriene și leziunile necrotice mărite în piele au corelat cu acumularea de reziduuri NT în zona cutanată necrotică (58,59 de șoareci nevaccinați (Figura 3B) și amorsați cu BCGph provocați cu MLM (Figura 3C) În concordanță cu un răspuns inflamator local mai echilibrat și ameliorarea patologiei pielii, infiltrarea NT și neutrofile au fost scăzute la șoarecii care au primit inoculări succesive cu hIFN- 2b (Figura 3D) sau șoarecii BCGph amorsați și stimulați cu hIFN 2b (Figura 3E). }} plus neutrofile și zone reduse de NT au coincis cu cea mai mică zonă inflamatorie din secțiunile histologice ale pielii de șoareci amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b (Figura 3F).

Figura 3. Protecția este asociată cu acumularea scăzută de nitrotirozină, acumularea afectată de neutrofile și inflamația ameliorată a pielii. Secțiunile de leziuni ale pielii au fost colorate cu o combinație de anticorpi specifici pentru iNOs (roșu), NT (verde) și Gr-1 (alb). Imagini reprezentative de 200× de la (A) Pielea de șoareci neamorsați și necontestați, (B) șoareci inoculați cu PBS și provocați cu MLM, (C) șoareci amorsați cu BCGphipps și provocați cu MLM, ( D) șoareci inoculați intramuscular cu hIFN- 2b și provocați cu MLM și (E) șoareci amorsați cu BCGph, stimulați cu hIFN- 2b și provocați cu MLM; (F, G) cuantificarea zonei inflamatorii cu instrumente automate ale microscopului Zeiss Axioplan, leziunile cutanate au fost colectate la opt săptămâni după provocarea cu MLM, graficele arată suprafața medie ocupată de celulele inflamatorii în leziunile pielii de lepră, exprimată în µm2. Bară de scară=100 µm. n=6 șoareci/grup * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 a fost considerat semnificativ statistic.

Producția de NO nu a fost semnificativă statistic în comparație cu celelalte grupuri experimentale, totuși, în grupul de șoareci amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b, concentrația de NO a fost mai mare (68,28 µM/L ± 0 .889) decât în ​​grupurile PBS și MLM (62,79 µM/L ± 1.04), BCGph (63,37 µM/L ± 0,225), hIFN{- 2b (62,57 µM/L ± 1,028 ) (Figura 3G).

3.3. Citokinele antiinflamatorii sunt crescute în serul șoarecilor amorsați cu BCGphipps și stimulate cu hIFN- 2b

Citokinele pro și antiinflamatorii au fost măsurate în serul șoarecilor Balb/c după provocarea cu MLM. În concordanță cu starea imunosupresoare cauzată de MLM, concentrațiile de citokine proinflamatorii au fost scăzute în serul șoarecilor Balb/c inoculați cu PBS și provocați cu MLM (IFN- , 625 ± 442 pg/mL; TNF- , 697 ± 436 pg/ mL; IL-6, 68 ± 48 pg/mL; IL{-17, 95 ± 67 pg/mL). În schimb, au avut niveluri moderate de citokine antiinflamatorii în ser (IL-10, 1763 ± 124 pg/mL și IL{-4, 1250 ± 173 pg/mL). Deși șoarecii au fost protejați prin amorsarea BCGph și stimularea succesivă cu hIFN- 2b, cantitățile sistemice de citokine proinflamatorii nu au fost diferite din punct de vedere statistic de cele la șoarecii inoculați cu PBS și provocați cu MLM. În mod neașteptat, concentrația de IL-4 (1875 ± 352 pg/mL, p < 0,05) și IL-10 (4250 ± 271 pg/mL) a fost semnificativ crescută în serul acestor șoareci în comparație. cu șoareci inoculați cu PBS și provocați cu MLM (Tabelul 1). Aceste rezultate sugerează că protocolul nostru de vaccinare ar putea activa căile antiinflamatorii pentru a preveni deteriorarea țesuturilor.

3.4. Acumularea Treg afectată în ganglionii limfatici de drenaj (DLN) ai șoarecilor amorsați cu BCGphipps sau stimulați cu hIFN- 2b

Având în vedere că Tregs produc IL-10 [61,62], am decis să cuantificăm CD3 plus FOXP3 plus Treg în ganglionii limfatici de drenaj (DLN), situat în apropierea locului de vaccinare. La șoarecii neinfectați (PBS), Tregs erau încă prezenți (113 ± 9,8 CD3 plus FOXP3 plus Treg/200 × câmp) (Figura 4A). După cum era de așteptat, Treg-urile au crescut semnificativ la șoarecii provocați cu MLM care nu au primit vaccinul (BCGph) sau hIFN- 2b (214 ± 30 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × câmp) (Figura 4B). În mod congruent, au fost observate niveluri mai scăzute de Treg la șoarecii amorsați cu BCGph (160 ± 26 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × câmp) (Figura 4C) și la șoarecii care au primit hIFN- 2b (162 ± 33 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × câmp) (Figura 4D); șoarecii amorsați cu BCGph și stimulați cu hIFN- 2b (127 ± 16 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × câmp) (Figura 4E) au avut o densitate similară de Treg decât șoarecii nevaccinați fără hIFN- 2b stimularea. Cu toate acestea, după ce am numărat orbește CD3 plus FOXP3 plus Treg în DLN-urile șoarecilor noștri experimentali, am constatat că Treg-urile au fost reduse semnificativ în DLN-urile șoarecilor după amorsarea BCGph (p=0.0013), hIFN- 2 b inoculare (p=0.0074) sau amorsarea combinată cu BCGph și stimularea hIFN- 2b (p=0.0013) în comparație cu șoarecii provocați cu MLM (Figura 4E).

Figura 4. Acumularea afectată a celulelor T reglatoare (Tregs) în ganglionii limfatici de drenaj (DLN) ai șoarecilor amorsați cu BCGphipps și stimulați cu hIFN- 2b. Șoarecii au fost sacrificați, iar DLN-urile au fost colectate la opt săptămâni după provocare cu MLM. DLN a fost colorat cu anticorpi specifici pentru CD3 (roșu) și FOXP3 (nuclei verzi) pentru a detecta CD3 plus FOXP3 plus Tregs prin imunofluorescență. (A) Acumularea bazală de Treg în DLN-urile șoarecilor nevaccinați; (B) Treg-urile din DLN au fost crescute după provocarea MLM și reduse comparativ în (C) amorsat cu BCGph, (D) hIFN- 2b inoculat și (E) amorsat cu BCGph-hIFN- 2b șoareci stimulați; (F) analiza morfometrică arată o reducere semnificativă a Treg-urilor în DLN-urile șoarecilor amorsați cu BCGph/hIFN- 2b. Bară de scară=100 µm, n=6 șoareci/grup * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

3.5. Amorsarea BCGphipps și creșterea hIFN- 2b influențează răspunsurile GC în DLN-urile mouse-ului

Există Treg-uri speciale localizate în GC, cunoscute sub numele de celule reglatoare foliculare T (TFFR), acestea modulează atât răspunsurile GC-urilor și previn generarea de celule plasmatice autoreactive (28, 33). Scăderea Treg-urilor din DLN-uri a sugerat că răspunsurile GC-urilor ar putea fi declanșate la șoareci. amorsat cu BCGph și stimulat cu hlFN-a 2b. În concordanță cu absența stimulării antigenice, nu am detectat GC-uri în DLN-urile șoarecilor neinfectați Figura 5A). GC-urile mici au fost prezente în DLN-urile șoarecilor neamorși, provocate cu MLMLigure 5B).

Figura 5. Amorsarea BCGphipps și stimularea hFN-a 2b influențează răspunsurile GC în DLN după provocarea MLM. Șoarecii au fost sacrificați la opt săptămâni după provocare cu ML M. Ganglionii limfatici de drenaj (DLN) au fost colorați cu antigenul nuclear celular proliferant (PCNA, nuclei roșii), aglutinină de arahide (PNA, verde) și CD45R (B22{13). }}, alb) pentru a identifica GC-uri care conțin clustere compacte de PCNA*PNA plus * B220celule B GC scăzute. Celulele GC B în DL N-urile (A) de șoareci neamorsați și necontestați; (B) șoareci inoculați cu PBS și provocați cu MLM; (C) șoareci amorsați cu BCGph și provocați cu MLM; (D) șoareci stimulați intramuscular cu hlFN-a 2b și provocați cu MLM; (E) șoareci amorsați cu BCGphboosted cu hlFN-a 2b și provocați cu ML M; (F) GC au fost măsurate în DL N-uri individuale ale șoarecilor experimentali, calculează dimensiunea medie GC. Bară de scară=100 um.=6 șoareci/grup. " p < 0,05, * p < 0,005; *** y < 0,0005 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

Figura 5. Amorsarea BCGphipps și stimularea hlFN-a 2b influențează răspunsurile GC în DLN după provocarea ML M. Șoarecii au fost sacrificați la opt săptămâni post-provocare cu ML M. Ganglionii limfatici de drenaj (DLN) au fost colorați cu anticorpi specifici pentru antigenul nuclear celular în proliferare (PCNA, nuclei roșii), aglutinină de arahide (PNA, verde) și CD45R (B22{{ 13}}, alb) pentru a identifica GC-uri care conțin clustere compacte de PCNAPNA plus plus B220celule B GC scăzute. Celulele GC B în DL N-urile (A) de șoareci neamorsați și necontestați; (B) șoareci inoculați cu PBS și provocați cu MLM; (C) șoareci amorsați cu BCGph și provocați cu MLM; (D) șoareci stimulați intramuscular cu hlFN-a 2b și provocați cu MLM; (E) șoareci amorsați cu BCGphboosted cu hlFN-a 2b și provocați cu MLM; (F) GC au fost măsurate în DLN-uri individuale ale șoarecilor experimentali pentru a calcula dimensiunea medie GC. Bară de scară=100 um. 1=6 șoareci/grup. " y < 0.05. * y < 0,005, *** y < 0,0005 a fost considerat a fi semnificativ statistic.

Interesant, șoarecii amorsați cu BCGph au avut GC semnificativ mai mari decât șoarecii provocați cu MLM (Figura 5C). Șoarecii imunizați cu hlFN-a 2b (Figura 5D) au avut GC cu o dimensiune comparabilă cu cele de la șoarecii provocați cu MLM. Șoarecii amorsați cu BCGph și stimulați cu hlFN-a 2b au avut GC-uri cu o dimensiune intermediară (Figura 5E). Pentru a avea o evaluare mai cantitativă a răspunsurilor GC în DLN, am calculat dimensiunea medie GC în secțiunile DLN individuale. În concordanță cu observațiile noastre, am găsit o reducere semnificativă a dimensiunii medii GC în DLN-uri după injectarea hlFN-a 2b și în protocolul de stimulare a BCGph/hIFN-a 2b (Figura 5E).

3.6. Niveluri comparabile de anticorpi specifici pentru glicolipide la șoareci provocați cu M. lepraemurium după amorsarea BCGphipps și stimularea hIFN- 2b

În funcție de diferențele observate în formarea și organizarea GC, am măsurat concentrația de anticorpi specifici glicolipidelor extrase din MLM. La nivel global, rezultatele noastre arată că cantitățile sistemice ale diferitelor clase și izotipuri de anticorpi specifici pentru glicolipide nu au fost afectate de vaccinare, administrarea succesivă de hIFN- 2b sau protocolul de amorsare BCGph/hIFN- 2b ( Masa 2). Șoarecii stimulați numai cu hIFN- 2b au provocat o cantitate mai mare de anticorpi IgG și IgG1 în ser. Cu toate acestea, nivelurile de anticorpi IgG și Ig G1 nu au fost semnificative statistic în comparație cu celelalte grupuri experimentale (Tabelul 2).

4. Discutie

În studiul de față, am arătat că protocolul nostru de stimulare a primelor bazat pe amorsarea subcutanată a BCGphipps și stimularea intramusculară succesivă cu cantități tot mai mari de hIFN- 2b a protejat șoarecii de provocarea intradermică cu MLM.

Protocolul de stimulare primară a prevenit creșterea MLM în piele și a ameliorat patologia locală prin scăderea producției de NT și a inflamației neutrofile (Figura 3E). De asemenea, a dus la inducerea de citokine antiinflamatorii (IL-4 și IL{-10) care probabil au contracarat inflamația excesivă a pielii și s-au manifestat sistemic. În mod neașteptat, deși regimul terapeutic a scăzut CD3 plus FOXP3 plus Treg în DLN (Figura 4E), răspunsurile GC nu au fost îmbunătățite drastic (Figura 5E), iar concentrațiile serice ale anticorpilor specifici pentru glicolipide au fost similare în toate grupurile experimentale, cu excepția celor șoareci inoculați numai cu hIFN- 2b (Tabelul 2). Cu toate acestea, datele noastre experimentale susțin utilizarea potențială a amorsării BCG cu adjuvant cu stimularea intramusculară de IFN 2b, ca imunoterapie promițătoare care merită explorată în lepra umană.

Manifestările clinice ale leprei se corelează cu spectrul imunologic detectat la pacienți și variază de la LL la TT [2,4,14,18]. În general, imunitatea gazdei la M. leprae este caracterizată în principal printr-un răspuns T helper polarizat (Th1/Th2). Pe o parte a spectrului, deși LL este caracterizată prin energie, există încă o anumită reactivitate la antigenele micobacteriene și producerea de IL-4 și IL{-10. În schimb, în ​​TT, un răspuns predominant Th1 duce la activarea macrofagelor determinată de IFN, ceea ce accelerează eliminarea bacililor. Șoarecii infectați cu MLM dezvoltă de obicei lepră asemănătoare lepromatoasă, fără o dominanță clară pentru imunitatea umorală sau celulară [18-20].

Anticorpii protectori provocați de infecție sau vaccinare [63] sunt produși printr-un proces numit maturare a afinității, care are loc în centrii germinali formați în organe limfoide secundare (splină, ganglioni limfatici) sau terțiare (TLO) generate în țesuturile periferice [23,25] . Este tocmai în GC-urile în care producția de celule B de memorie și celule plasmatice cu viață lungă care secretă anticorpi contribuie la generarea de imunitate pe termen lung la întâlnirile viitoare cu agenți patogeni. Inducerea eficientă a răspunsurilor GC depinde de colaborarea mai multor tipuri de celule, inclusiv celulele B, celulele T folicular helper (TFH), macrofagele corpului tingible și celulele dendritice foliculare (FDC) [64]. Într-adevăr, vaccinurile declanșează răspunsuri de succes GC și centrii germinali ectopici în ganglionii limfatici [24,25,31,49].

Mai mult, celulele T helper foliculare și celulele T foliculare reglatoare [27–30] mențin echilibrul delicat între inducerea răspunsurilor eficiente de anticorpi și autoimunitate. Deși nu am exclus inducerea autoimunității în studiul nostru, ne-am concentrat în continuare asupra efectelor protocolului de prim-boost cu BCGph și hIFN- 2b asupra Treg-urilor din DLN. Șoarecii protejați au avut semnificativ mai puțini CD3 plus FOXP3 plus Treg în DLN-urile lor. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a determina dacă unele dintre aceste Treg sunt celule T helper foliculare care reglează reacțiile GC [27-30]. Aceste rezultate ar putea implica faptul că inducerea eficientă a imunității protectoare combinată cu o scădere ușoară a Tregs în DLN este necesară pentru a controla creșterea micobacteriană și pentru a preveni inflamația patologică a pielii.

Studiile anterioare au raportat efectele sistemice și mucoase ale IFN de tip I asupra celulelor foliculare auxiliare T și a celulelor reglatoare foliculare T [19,32,64]. Într-adevăr, IFN de tip I crește indirect TFH în ganglionii limfatici prin stimularea amorsării celulelor T de către celulele dendritice [34]. IFN de tip I promovează, de asemenea, comutarea izotipului în GC. În plus, un studiu recent a arătat că IFN de tip I declanșează formarea TLO condusă de CXCL13-în plămâni [49].

Astfel, inducerea CXCL13 de către IFN de tip I ar putea îmbunătăți recrutarea celulelor B naive în organele limfoide secundare și ar putea crește producția de celule plasmatice secretoare de anticorpi, îmbunătățind la nivel global memoria de lungă durată și răspunsurile imunologice ale celulelor plasmatice [23–25,64]. ], în special în prezența adjuvanților cum ar fi poli IC [65]. În plus, administrarea de IFN de tip I induce formarea de GC în plămânii pacienților afectați de boli autoimune [31] sau tuberculoză [66,67]. Astfel, blocarea CXCL13 ar putea ajuta la tratarea acestor tulburări inflamatorii cronice [49]. În acest context, am observat o scădere foarte ușoară a dimensiunii GC în DLN-urile șoarecilor protejați cu boost prime (Figura 5E). Cu toate acestea, este nevoie de cercetări suplimentare pentru a defini mai bine corelația dintre formarea GC și protecția indusă la acești șoareci stimulați cu prim-boost. În setările experimentale de amorsare cu BCGph și stimularea intramusculară a hIFN- 2b (51), șoarecii din studiul nostru au experimentat o protecție mai mare prin administrarea BCGph-hIFN{- 2b (80 la sută) decât numai prin BCGph (60 la sută), așa cum este determinat de absența sau dimensiunea mică a leziunilor cutanate (Figura 2) și o cantitate comparabilă de anticorpi IgG și IgG1 specifici pentru glicolipidele MLM (Tabelul 2). Rezultatele noastre contrastează cu cantitatea crescută de IgG la șoarecii protejați prin vaccinare cu o tulpină diferită de BCG (Pasteur) [41]. Aceste date sugerează că tipul de tulpină BCG utilizată pentru a formula vaccinul ar putea influența rezultatul răspunsului imun umoral împotriva MLM sau M. leprae [51].

Mai mult, mai multe studii în tuberculoză au arătat efectele potențiale și benefice ale strategiei heterologe prime-boost în inducerea răspunsurilor imune protectoare [68–70]. Mai mult, este bine cunoscut faptul că tipul și calea de imunizare influențează amploarea anticorpilor și a răspunsurilor imune celulare. În mod surprinzător, șoarecii protejați prezintă IL-4 și IL-10 semnificativ mai mari în ser în comparație cu șoarecii tratați numai cu PBS, BCGph sau hIFN- 2b singur (Tabelul 1). Modul în care citokinele antiinflamatorii influențează imunitatea protectoare la lepră este în prezent investigat în laboratorul nostru. Cu toate acestea, mai multe studii au arătat că imunitatea celulară eficientă la micobacterii se bazează pe un echilibru delicat între protecția și prevenirea patologiei [71]. În plus, există dovezi ale inducției ambelor tipuri de citokine în alte modele experimentale [72–75].

Rezultatele noastre colective sugerează că succesul protocolului nostru prime-boost depinde de inducerea unui răspuns imunitar echilibrat care elimină eficient MLM din piele și limitează afectarea țesuturilor prin inducerea citokinelor antiinflamatorii (IL-4 și IL10) care protejează probabil celulele imune [76,77]. Într-adevăr, IL-10 produsă de Treg induse modulează inflamația la suprafețele mucoasei, în special cele legate de boala inflamatorie intestinală [77,78]. Aceste descoperiri justifică un studiu cinetic detaliat al activării celulelor B, formării și reglării GC, generării celulelor reglatoare foliculare T și activării NF-κB în sistemul nostru de prim-boost cu BCGph și hIFN- 2b urmate de infecția cu MLM la au o înțelegere mai mecanică a rolurilor celulelor imune și căilor NF-κB în inducerea imunității protectoare în piele și ganglioni limfatici după provocarea MLM.

5. Concluzii

Din aceste date, putem concluziona că stimularea intramusculară succesivă cu hIFN- 2b îmbunătățește vaccinarea M. bovis BCG, protejând împotriva provocării intradermice cu MLM și dezvăluind proprietățile adjuvante promițătoare ale IFN-a 2b uman în contextul BCG. vaccinarea pentru prevenirea infectiilor cu lepra in zonele endemice. Din câte cunoștințele noastre, acesta este primul raport al eficacității terapeutice a BCGphipps în combinație cu o prezentare farmaceutică a hIFN- 2b într-un model preclinic de boală asemănătoare lepra.

Contribuții ale autorului:

Proiectarea studiului, GGG, OR-E., SOI-T. şi JR-M.; conduita studiului, GGG, OR-E., SOI-T. şi JR-M.; analiza datelor: GGG, OR-E., SOI-T. şi JR-M.; interpretarea datelor, GGG, OR-E., SOI-T. şi JR-M.; redactare manuscris, GGG, OR-E., SOI-T. și JR-M.;revizuirea conținutului manuscrisului, GGG, OR-E., SOI-T. şi JR-M.; GGG, OR-E., SOI-T. și JR-M. să-și asume responsabilitatea pentru integritatea analizei datelor. Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:

GGG și OR-E. au fost susținute de SNI, CONACYT (Mexico City, Mexic). GGG a primit sprijin de la Perfil Prodep 2019–2022 și JR-M. a fost susținută de fonduri interne de la Departamentul de Medicină al Universității din Rochester Medical Center și RO1AI111914.

Declarația Comisiei de revizuire instituțională:

Toate experimentele pe animale au fost efectuate după aprobarea de către Comitetul instituțional de îngrijire și management al animalelor (ZOO-010-2020). Grădina Zoologică CIE-ENCB 016/2014, 07 martie 2014.

Declarație de consimțământ informat:

Nu se aplică.

Declarație de disponibilitate a datelor:

Datele vor fi partajate conform ghidurilor instituționale.

Mulțumiri:

Suntem recunoscători lui Ricardo Villalobos pentru ajutor cu IHC și lui Rogelio Hernandez Pando (INCMNSZ, Mexico City), care a furnizat tulpina BCGphipps.

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Referințe

1. CINE. Organizația Mondială a Sănătății: Tuberculoza — Fapte globale 2011/2102. Geneva: OMS Stop TB Dep. 2012. Disponibil online: http://www.who.int/tb/publications/2011/factsheet_tb_2011.pdf (accesat la 1 februarie 2021).

2. Bine, PE Lepra: Ce se „elimină”? Taur. Organul Mondial al Sănătății. 2007, 85, 1–2. [CrossRef]

3. Rambukkana, A. Cum vizează Mycobacterium leprae sistemul nervos periferic? Tendințe Microbiol. 2000, 8, 23–28. [CrossRef]

4. Rodriguez, JIA; Triellato, GL; Meirelles, NML; Teixeira, CC; Lyon, S.; Esteves, ARM Metode de clasificare a leprului: un studiu comparativ cu caracter de referință în Brazilia. Int. J. Infectează. Dis. 2016, 45, 118–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Geluk, A.; van der Ploeg, J.; Teles, OBR; Kees, L.; Franken, MC; Prins, C.; Wouter, DJ; Sarno, NE; Sampaio, EP; Otenhoff, THM Combinația rațională de peptide derivate din diferite proteine ​​Mycobacterium leprae îmbunătățește sensibilitatea pentru imunodiagnosticul infecției cu M. leprae. Clin. Vacc. Imunol. 2008, 15, 522–533. [CrossRef] [PubMed]

6. Geluk, A.; Bobosha, K.; Schip, JJVDP-V.; Spencer, JS; Banu, S.; Martins, MVSB; Cho, SN; Franken, KLMC; Kim, HJ; Bekele, Y.; et al. Noi biomarkeri cu relevanță pentru diagnosticul de lepră aplicabili în zonele hiperendemice pentru lepră. J. Immunol. 2012, 188, 4782–4791. [CrossRef]

7. Geluk, A. Biomarkeri pentru lepră: ați prefera T (celule)? lepr. Rev. 2013, 84, 3–12. [CrossRef] [PubMed]

8. Alcaïs, A.; Alter, A.; Antoni, G.; Orlova, M.; Nguyen, VT; Singh, M.; Vanderborght, PR; Katoch, K.; Mira, MT; Vu, HT; et al. Replicarea treptată identifică o alelă de limfotoxină cu producție scăzută ca un factor de risc major pentru lepra cu debut precoce. Nat. Genet. 2007, 39, 517–522. [CrossRef] [PubMed]

9. Avanzi, C.; Singh, P.; Truman, RW; Suffys, PN Epidemiologia moleculară a leprei: o actualizare. Infecta. Genet. Evol. 2020, 86, 104581. [CrossRef]

10. Lastoria, JC; Abreu, MA Revizuirea lepră a aspectelor epidemiologice clinice și etnopatogene-partea 1. Bras. Dermatol. 2014, 89, 205–218. [CrossRef]

11. Rojas-Espinosa, O. Subiecte curente privind profilurile răspunsului imunologic al gazdei la infecțiile micobacteriene; Cartea de recenzii; Tomioka, H., Ed.; Indicator de cercetare: Trivandrum, India, 2009; p. 97–140.

12. Adams, LB; Pena, TM; Sharma, R.; Hagge, AD; Schurr, E.; Truman, RW Perspective de la modele animale despre imunogenetica leprei. Un comentariu. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2012, 107, 197–208. [CrossRef]

13. Rojas-Espinosa, O.; Becerril-Villanueva, E.; Wek-Rodriguez, K.; Arce-Paredes, P.; Reyes-Maldonado, E. Paralizia membrelor posterioare la șoarecii infectați cu Mycobacterium lepraemurium rezultă din leziuni osoase și nu din implicarea nervilor. Clin. Exp. Imunol. 2005, 140, 436–442. [CrossRef]

14. Modlin, LR Răspunsul imun înnăscut în lepră. Curr. Opinează. Imunol. 2010, 22, 48–54. [CrossRef]

15. Oliveira, RB; Ochoa, MT; Sieling, PA; Rea, TH; Rambukkana, A.; Sarno, EN; Modlin, RL Expresia receptorului Toll-Like 2 pe celulele Schwann umane: un mecanism de deteriorare a nervilor în lepră. Infecta. Imun. 2003, 71, 1427–1433. [CrossRef] 16. MacMicking, J.; Xie, QW; Nathan, C. Oxidul nitric și funcția macrofagelor. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 323–350. [CrossRef]

17. Evans, T.; Unt, L.; Dulgher, A.; Springall, DR; Polak, J.; Cohen, J. Neutrofilele umane tratate cu citokine conțin sintază de oxid nitric inductibil care produce nitrarea bacteriilor ingerate. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 1996, 93, 9553–9554. [CrossRef] [PubMed]

18. Fonseca, AB; Simon, MD; Cazzaniga, RA; de Moura, TR; de Almeida, RP; Duthie, MS; Reed, SG; de Jesus, AR Influența răspunsurilor imune înnăscute și adaptative asupra rezultatelor clinice diferențiate ale leprei. Infecta. Dis. Sărăcia 2017, 6, 5–13. [CrossRef] [PubMed]

19. Sadhu, S.; Khaitan, BK; Joshi, B.; Sengupta, U.; Nautiyal, Alaska; Mitra, DK Reciprocitatea dintre celulele T de reglementare și celulele Th17: relevanța pentru imunitatea polarizată în lepră. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016, 10, e0004338. [CrossRef] [PubMed]

20. Rojas-Espinosa, O.; Wek-Rodríguez, K.; Arce-Paredes, P. Efectul peroxidazei exogene asupra evoluției leprei murine. Int. J. Lepr. Alte Mycobact. Dis. 2002, 70, 191–200.

21. Ischiropoulos, H. Nitrarea biologică a tirozinei: o funcție patofiziologică a oxidului nitric și a speciilor reactive de oxigen. Arc. Biochim. Biophys. 1998, 356, 1–11. [CrossRef]

22. Tânăr, lipidele DB Leprosy furnizează cheia pentru intrarea în celulele Schwann. Tendințe Microbiol. 2001, 9, 52–54. [CrossRef]

23. Bannard, O.; Cyster, JG Centre germinale: Programate pentru maturarea afinității și diversificarea anticorpilor. Curr. Opinează. Imunol. 2017, 45, 21–30. [CrossRef] [PubMed] 24. Victora, DG; Nussenweig, MC Centrele germinale. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 429–457. [CrossRef] [PubMed]

25. Cirelli, KM; Crotty, SH Îmbunătățirea centrului germinal prin disponibilitate extinsă a antigenului. Curr. Opinează. Imunol. 2017, 47, 64–69. [CrossRef]

26. Good-Jacobson, KL; Szumilas, CG; Chen, L.; Sharpe, AH; Tomayko, MM; Shlomchik, MJ PD-1 reglează supraviețuirea celulelor B din centrul germinativ și formarea și afinitatea celulelor plasmatice cu viață lungă. Nat. Imunol. 2010, 11, 535–542. [CrossRef]

27. Wollenberg, I.; Agua-Doce, A.; Hernández, A.; Almeida, C.; Oliveira, VG; Faro, J.; Graca, L. Reglarea reacției centrului germinal de către Foxp3 plus celulele T de reglare foliculară. J. Immunol. 2011, 187, 4553–4560. [CrossRef] [PubMed]

28. Litterman, MA; Pierson, W.; Lee, SK; Kallies, A.; Kawamoto, S.; Rayner, TF; Srivastava, M.; Divekar, DP; Beaton, L.; Hogan, JJ; et al. FOXP3 plus celulele T reglatoare foliculare controlează răspunsul centrului germinal. Nat. Med. 2011, 17, 975–982. [CrossRef]

29. Miles, B.; Connick, E. Controlul Centrului Germinal de către celulele T de reglare foliculară în timpul infecției. Față. Imunol. 2018, 9, 2704–3710. [CrossRef]

30. Fu, W.; Liu, X.; Lin, X.; Feng, H.; Soare, L.; Li, S.; Chen, H.; Tang, H.; Lu, L.; Jin, W.; et al. Deficiența celulelor reglatoare foliculare T promovează autoimunitatea. J. Exp. Med. 2018, 215, 815–825. [CrossRef]

31. Pitzalis, C.; Jones, GW; Bombardieri, M.; Jones, SA Structuri asemănătoare limfoidelor ectopice în infecții, cancer și autoimunitate. Nat. Rev. Immunol. 2014, 14, 447–462. [CrossRef]

32. Aloulou, M.; Carr, EJ; Gador, M.; Bignon, A.; Liblau, RS; Fazilleau, N.; Linterman, MA Celulele T reglatoare foliculare pot fi specifice pentru antigenul de imunizare și derivă din celule T naive. Nat. comun. 2016, 7, 10579–10589. [CrossRef]

33. Vinuesa, CG; Sanz, I.; Cook, MC Dereglarea centrilor germinali în bolile autoimune. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 845–857. [CrossRef]

34. Cucak, H.; Yrlid, U.; Reizis, B.; Kalinke, U.; Johansson-Lindborn, B. Semnalizarea interferonului de tip I în celulele dendritice stimulează dezvoltarea celulelor helper foliculare rezidente în ganglioni limfatici T. Imunitatea 2009, 31, 491–501. [CrossRef]

35. Desvignes, L.; Wolf, AJ; Ernst, JD Rolurile dinamice ale IFN-urilor de tip I și tip II în infecția precoce cu Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 2012, 188, 6205–6215. [CrossRef]

36. Teles, MBR; Graeber, GT; Krutzik, RS; Montoya, D.; Schenk, M.; Lee, JD; Komisopoulou, E.; Kelly-Scumpia, K.; Chun, R.; Iyer, SS; et al. Interferonul de tip I suprimă răspunsurile umane anti-micobacteriene declanșate de interferonul de tip II. Știință 2013, 339, 1448–1453. [CrossRef]

37. Ji, DX; Yamashiro, LH; Chen, KJ; Mukaida, N.; Kramnik, I.; Darwin, KH; Vance, RE, susceptibilitatea la Mycobacterium tuberculosis determinată de interferon de tip I este mediată de IL-1Ra. Nat. Microbiol. 2019, 4, 2128–2135. [CrossRef]

38. Manca, C.; Tsenova, L.; Bergtold, A.; Freeman, SH; Tovey, M.; Musser, MJ; Barry, EC, al 3-lea; Freedman, HV; Kaplan, G. Virulența unui izolat clinic de Mycobacterium tuberculosis la șoareci este determinată de eșecul de a induce imunitatea de tip Th1 și este asociată cu inducerea IFN-/. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 2007, 98, 5752–5757. [CrossRef] [PubMed]

39. Telesca, C.; Angelico, M.; Piccolo, P.; Nosotti, L.; Morrone, A.; Longhi, C.; Carbone, M.; Baiocchi, L. Tratamentul cu interferon-alfa al hepatitei D induce exacerbarea tuberculozei la un imigrant. J. Infectează. 2007, 54, e223–e226. [CrossRef] [PubMed]

40. Giacomini, E.; Remoli, ME; Gafa, V.; Pardini, M.; Fattorini, L.; Coccia, EM IFN- îmbunătățește imunogenitatea BCG acționând asupra maturării DC. J. Leukoc. Biol. 2008, 85, 462–468. [CrossRef] [PubMed]

41. Rivas-Santiago, CE; Guerrero, GG IFN- Amplificarea Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Güerin- Vaccinul promovat Răspunsul celular de tip Th1 și protecția împotriva infecției cu M. tuberculosis. BioMed Res. Int. 2017, 2017, 6760. [CrossRef]

42. Guerrero, GG; Rangel-Moreno, J.; Islas-Trujillo, S.; Rojas-Espinosa, O. Amplificarea intramusculară succesivă cu IFN-Alfa protejează șoarecii vaccinați cu Mycobacterium bovis BCG împotriva infecției cu M. lepraemurium. BioMed Med. Res. Int. 2015, 2015, 414027.

43. McNab, F.; Mayer-Barber, K.; Sher, A.; Wack, A.; O'Garra, A. Interferon de tip I în bolile infecțioase. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 67–103. [CrossRef]

44. O'Shea, JJ; Visconti, R. IFN-urile de tip I și reglarea răspunsurilor TH1: Enigmele s-au rezolvat și au apărut. Nat. Imunol. 2000, 1, 17–19. [CrossRef]

45. González-Navajas, JM; Lee, J.; David, M.; Raz, E. Funcții imunomodulatoare ale interferonilor de tip I. Nat. Rev. Immunol. 2012, 12, 125–135. [CrossRef]

46. ​​Le Bon, A.; Dur, interferon DF de tip I ca stimul pentru amorsarea încrucișată. Cytokine Growth Fact Rev. 2008, 19, 33–40. [CrossRef]

47. Bracci, L.; Canini, I.; Puzelli, S.; Sestili, P.; Venditti, M.; Spada, M.; Donatelli, I.; Belardelli, F.; Proietti, E. IFN de tip I este un adjuvant puternic al mucoasei pentru o vaccinare intranazală selectivă împotriva virusului gripal la șoareci și afectează captarea antigenului la nivelul mucoasei. Vaccin 2005, 23, 2994–3004. [CrossRef]

48. Canapea, RB; Atmar, RL; Cate, TR; Quarles, JM; Keitel, WA; Arden, NH; Wells, J.; Niño, D.; Wyde, PR Efecte contrastante ale interferonului de tip I ca adjuvant al mucoasei pentru vaccinul gripal la șoareci și oameni. Vaccin 2009, 27, 5344–5348. [CrossRef] [PubMed]

49. Denton, AE; Innocentin, S.; Carr, EJ; Bradford, BM; Lafouresse, F.; Mabbott, NA; Mörbe, U.; Ludewig, B.; Groom, JR; Good-Jacobson, KL; et al. Interferonul de tip I induce CXCL13 să susțină formarea centrului germinativ ectopic. J. Exp. Med. 2019, 216, 621–637. [CrossRef]

50. Toledo, PTG; Batista-Silva, LR; Medeiros, RCA; Lara, FA; Moraes, MO de interferoni de tip I, autofagie și metabolismul gazdei în lepră. Față. Imunol. 2018, 23, 806–817. [CrossRef]

51. Zhang, W.; Zhang, Y.; Zheng, H.; Pan, Y.; Liu, H.; Du, P.; Wan, L.; Liu, J.; Zhu, B.; Zhag, G.; et al. Secvențierea genomului și analiza tulpinilor de vaccin BCG. PLoS ONE 2013, 8, e071243. [CrossRef]

52. Wek-Rodriguez, K.; Silva-Miranda, M.; Arce-Paredes, P.; Rojas-Espinosa, O. Efectul intermediarilor reactiv de oxigen asupra viabilității și infecțiozității Mycobacterium lepraemurium. Int. J. Exp. Pathol. 2007, 88, 137–145. [CrossRef]

53. Kim, SH; Cohen, B.; Novick, D.; Rubinstein, M. Receptorii de interferon de tip I de mamifere constă din două subunități: IFN-R1 și IFN-R2. Gene 1997, 196, 279–286. [CrossRef]

54. Luo, Y.; Chen, X.; Han, RA; O'Donnell, M. Bacilul recombinant Calmette-Guérin (BCG) care exprimă interferon-alfa 2B uman demonstrează o imunogenitate sporită. Clin. Exp. Imunol. 2001, 123, 264–270. [CrossRef] [PubMed]

55. Soare, E.; Nian, X.; Liu, C.; Ventilator, X.; Han, R. Construcția de IFN uman recombinant -2b BCG și efectele sale antitumorale asupra celulelor canceroase ale vezicii urinare in vitro. Genet. Mol. Res. 2015, 14, 3436–3449. [CrossRef] [PubMed]

56. Prabhakaran, K.; Harris, EB; Kirchheimer, WF Legarea dopa marcată cu 14C de către Mycobacterium leprae in vitro. Int. J. Lepr. Alte Mycobact. Dis. 1976, 44, 58–64.

57. Draper, P. Purification of Mycobacterium leprae. În lucrările anexei 4 din Raportul celei de-a cincea reuniuni a Grupului de lucru științific pentru imunologia leprei (IMMLEP), Geneva, Elveția, 24–26 iunie 1980; Organizația Mondială a Sănătății: Geneva, Elveția, 1980.

58. Ischiropoulos, H.; Nelson, J.; Duran, D.; Al-Mehdi, A. Reacții de oxid nitric și peroxinitrit cu molecule organice și peroxidază de hrean: interferență cu determinarea peroxidului de hidrogen. Radic liber. Biol. Med. 1996, 20, 373–381. [CrossRef]

59. Schön, T.; Hernandez-Pando, R.; Negesse, Y.; Leekassa, R.; Sundqvist, T.; Britton, S. Expresia sintetazei oxidului nitric inductibil și a nitrotirozinei în leziunile limită de lepră. Br. J. Dermatol. 2001, 145, 809–815. [CrossRef]

60. Silva-Miranda, M.; WeK-Rodriguez, K.; Martinez, CE; Rojas-Espinosa, O. Expresia ciclooxigenazei-2, alfa 1-glicoproteinei acide și oxid nitric sintetazei inductibile în leziunile în curs de dezvoltare ale leprei murine. Int. J. Exp. Cale. 2006, 87, 485–494. [CrossRef]

61. Hernández-Pando, R.; Schön, T.; Orozco, EH; Serafín, T.; Estrada-Garcia, I. Exprimarea sintetazei oxid nitric inductibile și a nitrotirozinei în timpul evoluției tuberculozei pulmonare experimentale. Exp. Toxic. Pathol. 2001, 53, 257–265. [CrossRef]

62. Izcue, A.; Coombes, JL; Powrie, F. Limfocite reglatoare și inflamație intestinală. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 313–338. [CrossRef]

63. Sakaguchi, S.; Miyara, M.; Costantino, CM; Hafler, DA FOXP3 plus celule T reglatoare în sistemul imunitar uman. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 490–500. [CrossRef]

64. Plotkin, SA Corelates of Protection Induced by Vaccination. Clin. Imunol vaccin. 2010, 17, 1055–1065. [CrossRef] [PubMed]

65. Wu, H.; Chen, Y.; Liu, H.; Xu, L.-L.; Teuscher, P.; Wang, S.; Lu, S.; Dent, AL Celulele T reglatoare foliculare reprimă producția de citokine de către celulele T auxiliare foliculare și optimizează răspunsurile IgG la șoareci. EURO. J. Immunol. 2016, 46, 1152–1161. [CrossRef] [PubMed]

66. Jeyanathan, M.; Damjanovic, D.; Shaler, CR; Lai, R.; Wortzman, M.; Yin, C.; Zganiacz, A.; Lichty, D.; Xing, Z. Imunitatea înnăscută imprimată diferențial prin vaccinarea de stimulare a mucoasei determină rezultatele de protecție imunitară antituberculoză, independent de imunitatea celulelor T. Imunol mucoase. 2013, 6, 612–625. [CrossRef] [PubMed]

67. Jeyanathan, M.; Shao, Z.; Yu, X.; Harkness, R.; Jiang, R.; Li, J.; Xing, Z.; Zhu, T. AdHu5Ag85A Imunizarea de stimulare a mucoasei respiratorii îmbunătățește protecția împotriva tuberculozei pulmonare la primatele non-umane amorsate cu BCG. PLoS ONE 2015, 10, e0135009. [CrossRef]

68. Afhami, S.; Drumond, VA; D'Agositnio, MR; Jeyanathan, M.; Gillgrass, A.; Xing, Z. Advancing Imunoterapeutic Vaccine Strategies Against Pulmonary Tuberculosis. Față. Imunol. 2020, 11, 557809. [CrossRef]

69. Torrado, E.; Robinson, RT; Cooper, AM Răspunsul celular la micobacterii: echilibrarea protecției și patologiei. Trends Immunol. 2011, 32, 66–72. [CrossRef]

70. Xu, X.; Gao, W.; Cheng, S.; Yin, D.; Li, F.; Wu, Y.; Soare, D.; Zhou, S.; Wang, D.; Zhang, Y.; et al. Mecanisme antiinflamatorii și imunomodulatoare ale atorvastatinei într-un model murin de leziuni cerebrale traumatice. J. Neuroinflamaţie. 2017, 14, 167–182. [CrossRef]

71. Azeem, W.; Maukon, BR; Appel, S.; Maegrete, AO; Kalland, KH Caracteristici duale pro și antiinflamatorii ale celulelor dendritice derivate din monocite. Față. Imunol. 2020, 11, 438–453. [CrossRef]

72. Sultana, S.; Bishay, B. Neutralizarea TNFR-1 și TNFR-2 modulează artrita septică indusă de S. aureus prin reglarea nivelurilor de citokine proinflamatorii și antiinflamatorii în timpul progresiei bolii. Imunol. Lett. 2018, 196, 33–51. [CrossRef]

73. Pornografie, D.; Gilligan, MM; Huang, S.; Gartung, A.; Cortes-Puch, I.; Sime, PJ; Phipps, RP; Serhan, CHN; Hammock, BD Rezolvarea inflamației: O abordare dublă pentru evitarea furtunilor de citokine în metastaza cancerului COVID-19 Rev. 2020, 39, 337–340. [CrossRef]

74. Longhi, MP; Trumpfheller, C.; Idoyaga, J.; Caskey, M.; Matos, I.; Kluger, C.; Salazar, AM; Colonna, M.; Steinman, RM Celulele dendritice necesită un răspuns sistemic de interferon de tip I pentru a se maturiza și a induce imunitatea CD4 plus Th1 cu poli IC ca adjuvant. J. Exp. Med. 2009, 206, 1589–1602. [CrossRef]

75. Khader, SA; Guglani, L.; Rangel-Moreno, J.; Gopal, R.; Junecko, BAF; Fântână, JJ; Martino, C.; Pearl, JE; Tighe, M.; Lin, Y.-Y.; et al. IL-23 este necesar pentru controlul pe termen lung al Mycobacterium tuberculosis și al formării foliculilor de celule B în plămânul infectat. J. Immunol. 2011, 187, 5402–5407. [CrossRef] [PubMed]

76. Choreño-Parra, JA; Bobba, S.; Rangel-Moreno, J.; Ahmed, M.; Mehra, S.; Rosa, B.; Martin, J.; Mitreva, M.; Kaushal, D.; Zúñiga, J.; et al. Infecția cu Mycobacterium tuberculosis HN878 induce foliculi cu celule B asemănătoare omului la șoareci. J. Infectează. Dis. 2020, 221, 1636–1646. [CrossRef] [PubMed]

77. Schmidt, EG; Haribhai, D.; Williams, JB; Aggarwal, P.; Jia, S.; Charbonnier, LM; Yan, K.; Lorier, R.; Turner, A.; Ziegelbauer, J.; et al. IL-10 produs de celulele iTreg controlează colita și ex. patogen. Celulele Treg în timpul imunoterapiei. J. Immunol. 2012, 189, 5628–5648. [CrossRef]

78. Rubtsovo, YP; Rasmussen, JP; Chi, Y.; Fontenot, J.; Castelli, I.; Da, X.; Treuting, P.; Siewe, I.; Roers, A.; Henderson, WRJ; et al. Interleukina reglatoare derivată din celulele T-10 limitează inflamația la interfețele mediului. Imunitatea 2018, 28, 546–558. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com