Investigarea toxicității ifosfamidei induce un regulator comun în amonte în ficat și rinichi

Contact: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, și colab

Abstract:

Ifosfamida este un agent de alchilare, un analog sintetic al ciclofosfamidei, utilizat pentru a trata diferite tipuri de cancer solide. În acest studiu, toxicitatea ifosfamidei a fost evaluată utilizând administrarea intraperitoneală în doză unică și multiplă la șobolani în conformitate cu ghidurile bunelor practici de laborator și a fost urmat un experiment suplimentar cu microarray pentru a susține constatările toxicologice. O singură doză de ifosfamidă (50 mg/kg) nu a indus nicio modificare patologică. Între timp, toxicitate renală severă a fost observată în grupurile de 7 și 28 de zile administrate consecutiv, cu creșteri semnificative ale azotului ureic din sânge și ale creatininei. În analiza listei toxice, genele legate de sinteza colesterolului au fost afectate în principal în ficat, iar genele legate de insuficiența renală au fost afectate înrinichidupă administrarea de ifosfamidă. Mai mult, factorul de reglare a interferonului 7 a fost selectat ca principalul regulator din amonte care s-a schimbat atât în ​​​​ficatșirinichi, și s-a descoperit că interacționează cu alte gene țintă, cum ar fi peptidaza 18 specifică ubiquitinului, domeniul radical S-adenosil metionină care conține 2 și gena stimulată de interferon 15, ceea ce a fost confirmat în continuare prin analiza RT-PCR în timp real. În concluzie, a reconfirmat toxicitatea organelor ifosfamidei predispusă la rinichi și a identificat gene modificate identic în ambeleficatșirinichi. Sunt necesare studii toxicogenomice cuprinzătoare suplimentare pentru a dezvălui relația exactă dintre genele induse de ifosfamidă și toxicitatea organelor.

Cuvinte cheie:ifosfamidă; hepatotoxicitate; nefrotoxicitate; toxicitate intraperitoneală

Cistanche este bun pentru ficat și rinichi

1. Introducere

Ifosfamida este un agent de alchilare, un analog sintetic al ciclofosfamidei, utilizat pentru a trata diferite tipuri de cancer solide, inclusiv sarcoame și limfoame. Ifosfamida este un medicament anticancer nespecific al ciclului celular care interferează cu replicarea ADN-ului și producția de ARN [1]. Deși ifosfamida este relativ bine tolerată în comparație cu alți agenți toxici de alchilare, se știe că este asociată cu numeroase efecte adverse care pun viața în pericol și care îi limitează utilizarea clinică [2]. Efectele secundare majore ale ifosfamidei includ leziuni renale severe rezultate din speciile toxice reactive de la ifosfamidă, inclusiv acută.rinichi rănire, nefrită interstițială, cistita hemoragică și sindromul Fanconi [3]. În clinici, toxicitatea multiplă severă a fost raportată la pacienții care au prezentat toxicitate renală precoce și insuficiență de organ indusă de ifosfamidă în doze mari repetate, care a dus la insuficiență de organ ulterioară [4,5].

Metabolitul toxic al ifosfamidei, acroleinei și cloracetaldehidei este un factor responsabil major pentru toxicitatea organelor ifosfamidei. Studiile anterioare s-au concentrat în principal pe factorii care afectează conversia ifosfamidei în metaboliți toxici, în special pe citocromul P450 (CYP) [6]. CYP3A4 și CYP3A5 relativ abundente în rinichi duce la modificări toxice ale ifosfamidei și induc nefrotoxicitate [7]. Acroleina este o aldehidă foarte reactivă care poate activa calea genelor oxidative reactive intracelulare și poate deteriora organele celulare. Cloroacetaldehida a raportat suprimarea activării complexului I în lanțul respirator mitocondrial care ar putea duce la epuizarea glutationului intracelular (GSH) și moartea celulelor [8].

Un studiu toxicologic pe mai multe organe este mai util pentru înțelegerea efectelor sistemice ale medicamentelor decât vizarea unor organe specifice pentru studii de toxicitate. Ficatul și rinichii sunt organe majore care participă la metabolismul și excreția medicamentelor, iar aceste organe majore sunt predispuse la reacții adverse la medicamente; deseori urmează toxicitatea organelor. Mai mult, evaluarea toxicologică integrativă poate prezenta diverse constatări patologice care pot ajuta la înțelegerea și prezicerea toxicității induse de medicament în sistem.

Multe studii au folosit profiluri de expresie genetică pentru a prezice potențialele efecte negative ale substanțelor chimice. Cu toate acestea, majoritatea studiilor anterioare s-au concentrat pe evaluarea toxicității unui singur organ țintă, cu doar simptome patologice limitate [9]. Mai mult decât atât, combinată cu profilarea genelor bazată pe microarray, va produce o înțelegere cuprinzătoare la nivel de sistem a toxicității care poate preveni potențiala toxicitate legată de medicamente [10]. În acest sens, abordări integrative toxicologice multi-organe cu profilarea expresiei genelor au fost utilizate în studiile modelelor de predicție a toxicității pentru a depăși datele de toxicitate derivate din evaluarea toxicității unui singur organ, care este insuficientă pentru a înțelege mecanismele toxice ale medicamentelor din sistem [11].

În acest studiu, descriem toxicitatea ifosfamidei înrinichișificatdupă expunere acută și repetată la șobolani Sprague-Dawley (SD). Au fost efectuate teste de susținere a profilului expresiei genelor pentru a dezvălui gena țintă comună care a fost modificată de ifosfamidă atât în ​​ficat, cât și înrinichi, sugerând o perspectivă asupra toxicității integratoare a ifosfamidei.

2. Rezultate

2.1. Studiu de toxicitate în doză unică

Nu a fost observată nicio toxicitate în grupurile de ifosfamidă de 12,5, 25 și 50 mg/kg - nu deces, simptome toxice, modificări ale greutății corporale sau constatări histopatologice.

Între timp, în studiul de hematologie, numărul relativ de reticulocite (RET) și numărul absolut de neutrofile (NEUA) și limfocite (LYMA) au scăzut într-o manieră dependentă de doză.

2.2. Studiu de toxicitate cu doze repetate de o săptămână

Greutatea corporală totală a scăzut după 1 săptămână de administrare de ifosfamidă, iar valorile medii ale pierderii în greutate în grupul de 100 mg/kg au fost mai mari decât cele din grupul de 75 mg/kg (Tabelul 1). Între timp, greutatea relativă a organelor a crescut treptat la grupurile tratate cu ifosfamidă (Tabelul 2).

O săptămână de administrare consecutivă de ifosfamidă IP a suprimat indicele hematologic, inclusiv RBC, HGB, HCT, MCV și PLT, într-o manieră dependentă de doză (Tabelul 3). Mai mult, BUN și CREA au crescut de 1,2 ori în grupul de control în comparație cu grupul cu ifosfamidă (Tabelul 4).Rinichirănirea fost susținută în continuare de un studiu histopatologic.

Nu au fost observate semne histopatologice în ficatul șoarecilor din grupele de ifosfamidă de 75 și 100 mg/kg (Figura 1A). Între timp, celrinichidin grupurile de ifosfamidă de 75 și 100 mg/kg s-au constatat că au un grad minim până la ușor de alterare patologică, inclusiv degenerare/dilatație tubulară (1 moderată în grupul de 100 mg/kg), necroză unicelulară, hiperplazie urotelială și hemoragie focală. /congestie (Tabelul 5). În plus, a fost observată o creștere evidentă a expresiei KIM-1 în zona tubului renalrinichidin grupul de 100 mg/kg (Figura 1B).

2.3. Studiu de toxicitate cu doze repetate de patru săptămâni

Mortalitatea a fost observată în grupurile tratate cu 50 (5/10) și 70 (10/10) mg/kg după 21 și, respectiv, 10 zile de administrare consecutivă. Mai mult, greutatea corporală scăzută cu greutatea relativă crescută a organelor,ficat, șirinichi, în toate grupurile tratate cu ifosfamidă, acceptă 4-toxicitatea după doze repetate pe săptămână.

Au fost efectuate analize hematologice și biochimice serice subiecților supraviețuitori. Câțiva parametri ai sângelui, inclusiv RET, RBC, MONA, EOSA și LUCA, au scăzut semnificativ după 4 săptămâni de administrare de ifosfamidă.

Comparativ cu grupul martor, analizele biochimice au arătat diferențe statistice după 4 săptămâni de administrare de ifosfamidă. De exemplu, nivelurile de AST și CK au fost semnificativ crescute, iar raportul A/G, GLU și GGT au fost scăzute (p < 0,01)="" în="" grupul="" tratat="" cu="" 50="" mg/kg,="" în="" comparație="" cu="" controlul="">

2.4. Analiza expresiei genelor induse de ifosfamidă

DEG-urile induse de ifosfamidă au fost identificate în ficat șirinichițesuturi (Tabelul 6). Pentru ficat, genele exprimate diferențial au inclus 2672 de gene la 100 mg/kg BW/zi, 1283 de gene au fost reglate în sus și 1389 de gene au fost reglate în jos. În rinichi, 401 gene au fost exprimate diferențial la 100 mg/kg BW/zi - 149 de gene au fost reglate în sus și 252 de gene au fost reglate în jos. Atât în ​​ficat, cât și în rinichi, numărul de gene reglate în jos a fost mai mare decât numărul de gene reglate în sus. Acest lucru ar putea sugera că tratamentul cu ifosfamidă pare să inhibe expresia genelor.

Rezultatele analizei funcției biologice sunt enumerate în Tabelul 7. Sa constatat că administrarea de 1-săptămână de ifosfamidă modifică genele legate de dezvoltarea organelor, mai ales în ficat. Înrinichi, s-a confirmat că genele legate de localizarea celulelor imune au fost în mare parte afectate.

În analiza căii canonice a DEG, modificările în sinteza colesterolului și genele legate de calea de prezentare a antigenului au fost evidente înficatșirinichițesuturi, respectiv (Figura 2). Mai mult decât atât, LXE/RXR și semnalizarea răspunsului în fază acută au fost calea canonică obișnuită reglată în partea superioară înficatșirinichi, care au fost implicate în homeostazia lipidelor și, respectiv, în semnalizarea citokinelor inflamatorii.

În analiza listei de toxicitate hepatică, genele legate de sinteza colesterolului au fost în cea mai mare parte afectate, urmate de proteinele de răspuns pozitiv la faza acută și panoul de insuficiență renală acută (Tabelul 8). În plus, rezultatele listei de rinichi au arătat că genele legate de insuficiența renală au fost în general afectate de ifosfamidă, inclusiv biomarkerii glomerulonefritei reversibile și panoul de insuficiență renală acută.

Pe baza bazei de cunoștințe IPA, un regulator comun în amonte reglează expresia genelor în ficat și rinichi după tratamentul cu ifosfamidă (Figura 3). IRF7 a fost principalul regulator care s-a schimbat atât în ​​ficat, cât și în rinichi și s-a descoperit că interacționează cu alte gene țintă, cum ar fi USP18, RSAD2 și ISG15. În plus, analiza RT-PCR în timp real a confirmat expresia IRF7, USP18, RSAD2 și ISG15. Deși amploarea modificărilor fiecărei gene a fost diferită între ficat și rinichi, expresia a fost suprimată atât în ​​țesuturile hepatice, cât și în cele ale rinichilor după 1 săptămână de administrare de ifosfamidă. RSAD2 și USP18 au gene modificate în cea mai mare parte prin tratamentul cu ifosfamidă în ficat și, respectiv, rinichi.

3. Discuție

În acest studiu, toxicitatea cuprinzătoare a ifosfamidei în mai multe organe a fost explorată cu diferite doze și termeni de expunere prin calea IP la șobolani în conformitate cu standardul GLP. În clinici, ifosfamida poate exercita o acțiune antitumorală bimodală cu efecte citotoxice și imunomodulatoare combinate cu imunoterapia adoptivă [12]. Se știe că ifosfamida este eliminată în principal pe cale renală și aproximativ 80% din doză este sub formă nemodificată, nefrotoxicitatea este un efect secundar cunoscut în mod obișnuit al ifosfamidei, iar metaboliții precum cloroacetaldehida și acroleina sunt responsabili pentru utilizarea sa clinică [13, 14].

În studiul de față, un studiu de toxicitate repetat de 1-săptămână a fost potrivit pentru a explora toxicitatea organelor derivate de ifosfamidă. O săptămână de administrare de ifosfamidă a suprimat indicele sanguin într-o manieră dependentă de doză, ceea ce ar putea reflecta mielosupresia tipică derivată de ifosfamidă. Alături de nefrotoxicitate, mai multe rapoarte au indicat că mielosupresia este una dintre toxicitățile majore ale ifosfamidei limitatoare de doză, iar leucopenia este în general mai severă decât trombocitopenia [15,16]. Nefrotoxicitatea ifosfamidei poate duce la sindromul Fanconi, în care există o afectare a funcției tubului proximal având ca rezultat leziuni ireversibile, iar metabolitul toxic acroleină provoacă urotoxicitate cu cistita hemoragică [17]. Acest lucru este în conformitate cu rezultatele studiului de față. În studiul histopatologic, rinichii și ficatul au fost examinați pentru a explora modificările patologice derivate de ifosfamidă. Atât în ​​grupurile administrate cu ifosfamidă de 75, cât și în cele de 100 mg/kg, au fost detectate zone mari de degenerescență și dilatare tubulară cu hiperplazie a uroteliului în zona pelvisului renal. În plus, expresia KIM-1, o moleculă de leziune a tubului proximal renal, a susținut prezența nefrotoxicității legate de ifosfamidă. Între timp, în ficat s-a observat doar o vacuolizare periportală minimă. Mai mult, deși valorile AST și ALT au scăzut într-o manieră dependentă de doză, modificările au fost în intervalul de referință [18]. Motivele mai profunde pentru scăderea nivelului enzimelor hepatice vor trebui studiate în continuare. Este în general acceptat că ifosfamida este un agent alchilant care este rar asociat cu hepatotoxicitatea și doar câteva cazuri au fost raportate că induc leziuni hepatice, în special atunci când este combinată cu alte medicamente chimioterapeutice, cum ar fi doxorubicină [19].

Recent, progrese notabile în datele de exprimare a genelor în toxicologie cu tehnologii de înaltă performanță au condus la generarea de seturi de date suficient de mari în studiile de toxicitate și s-au făcut multe încercări de a aplica profilul genei la predicția toxicității chimice [10,20]. În acest studiu, analiza microarray a fost efectuată pentru a analiza răspunsul transcriptomului indus de administrarea de ifosfamidă și au fost selectate DEG cu o schimbare de ori mai mare sau egală cu 1,5 ca genă țintă și au fost utilizate funcția biologică, calea canonică și analiza listei Tox. pentru a înțelege funcția genelor induse de ifosfamidă. O analiză suplimentară a regulatorului în amonte a fost efectuată pentru a evalua posibilitatea de toxicitate multi-organă în ficat și rinichi.

În acest studiu, DEG-urile s-au schimbat de 1 ori au fost selectate, iar genele reglate în jos au fost puțin mai dominante decât genele reglate în sus atât în ​​ficat (52 la sută ) cât și în rinichi (62 la sută ). Rezultatele analizei funcției biologice au indicat că ifosfamida modifică genele, cu funcții biologice legate de dezvoltarea țesuturilor care sunt observate în mod obișnuit atât în ​​ficat, cât și în rinichi.

Un studiu anterior al lui Snouber et al. [21] s-a constatat că tratamentul cu ifosfamidă reduce în jos căile de răspuns oxidativ la stres mediate de Nrf-2 în cultura microfluidică [21]. În conformitate cu studiile anterioare, calea de răspuns la stresul oxidativ mediată de NRF2-a fost modulată în mod semnificativ de rețelele de top, ceea ce a fost confirmat atât de calea canonică actuală, cât și de analiza listei de toxine. Actualele căi de răspuns oxidativ la stres mediate de Nrf-2 modificate ar putea fi strâns legate de metabolitul toxic al ifosfamidă. Multiplii metaboliți toxici ai ifosfamidei pot reacționa cu GSH, un antioxidant puternic, pentru a forma conjugați în diferite locuri de-a lungul căii, iar o scădere a nivelului de GSH are ca rezultat o toxicitate crescută, ceea ce indică implicarea stresului oxidativ în toxicitatea organelor ifosfamidei [8,22]. ]. În acest sens, mesna și N-acetilcisteina au fost folosite pentru a atenua toxicitatea organelor ifosfamidei. Mesna servește ca un detoxifiant regional prin legarea de metabolitul toxic al ifosfamidă, în principal împotriva acroleinei, printr-un adaos de Michael pentru a forma o substanță mai puțin dăunătoare [23]. În plus, se raportează că N-acetilcisteina are activitate antioxidantă și îmbunătățește epuizarea GSH în condiții de stres oxidativ [24]. Sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida relația exactă dintre antidotul ifosfamidă și calea reglată în condiții nefrotoxice. Putem specula că ameliorarea toxicității ifosfamidei de către mesna sau N-acetilcisteină ar putea fi urmată de căi îmbunătățite de răspuns oxidativ la stres mediat de Nrf-2-.

În acest studiu, semnalele legate de inflamație au fost în mod obișnuit suprareglate atât în ​​ficat, cât și în rinichi, ceea ce poate fi recunoscut prin semnalizarea fazei acute în analiza căii canonice. Acest rezultat a indicat implicarea reacției inflamatorii în patofiziologia toxicității organelor ifosfamidei în ambele țesuturi, ceea ce a fost susținut în continuare de analiza regulatorului din amonte. În analiza regulatorului din amonte, genele legate de semnal IRF7 și interferon (IFN), inclusiv USP18, RSAD2 și ISG15, au fost selectate ca regulatori comuni în amonte în ficat și rinichi. IRF7 este un factor specific limfoid, care este exprimat constitutiv în citoplasma celulelor imune și poate fi, de asemenea, indus de interferon de tip I, infecție cu virus și stimuli externi în diferite celule [25]. Un studiu anterior a raportat proprietăți controversate pro- sau anti-oncogene ale IRF7 în diferite celule tumorale, iar modificările expresiei IRF7 au fost asociate cu deteriorarea ADN-ului [26-28].

Pe lângă rolul său regulator important în IFN de tip I pentru funcțiile antivirale, IRF7 a fost raportat că suprimă răspunsurile inflamatorii prin calea de semnalizare TLR4 [29]. Mai mult, Stout-Delgado et al. [30] au raportat că creșterea oxidativă indusă de îmbătrânire afectează activitatea IRF7, în timp ce reducerea stresului de către agenții antioxidanti a îmbunătățit activitatea IRF7. În acest studiu, administrarea de ifosfamidă a suprimat expresia regulatorilor din amonte, iar modelele de expresie au fost identice atât în ​​ficat, cât și în rinichi. Modificările actuale ale expresiei IRF7 ar putea avea legătură cu reacția inflamatorie și proprietatea agentului de alchilare citotoxic a ifosfamidei, ceea ce ar putea sugera IRF7 ca o țintă promițătoare pentru toxicitatea organului ifosfamidei.

În acest studiu, am găsit o genă care a fost inhibată identic atât în ​​ficat, cât și în rinichi după administrarea de ifosfamidă, dar interpretarea semnificației sale toxicologice s-a concentrat doar pe rinichi, ceea ce limitează descoperirea actuală. Mai mult, studii de confirmare suplimentare legate de efectul antidotului ifosfamidă disponibil comercial asupra genei modificate în prezent ar putea susține descoperirile prezente.

În concluzie, s-a constatat că un studiu de toxicitate repetat (1 săptămână) al administrării ifosfamidei a avut mai degrabă nefrotoxicitate părtinitoare decât hepatotoxicitate. În plus, rezultatele prezente oferă dovezi pentru hepatotoxicitatea indusă de ifosfamidă și mecanismul de nefrotoxicitate care implică inhibarea IRF-7. Sunt necesare studii toxicogenomice suplimentare ale organelor înrudite cu imunitatea pentru a elucida mecanismul toxicologic sistemic al ifosfamidei și pentru a susține relația dintre toxicitatea genelor și a organelor.

4. Materiale și Metode

4.1. Studiu pe animale

Șobolani Sprague-Dawley (SD) (n=140) fără patogeni specifici masculului în vârstă de opt săptămâni au fost obținuți de la Orient Bio Inc. (Seongnam, Coreea). Animalele au fost examinate și aclimatizate la condițiile de mediu de laborator timp de o săptămână înainte de experiment. Toate animalele au fost găzduite în cuști de plastic în condiții controlate de laborator (temperatură, 23 ± 3 ◦C; umiditate, 55 ± 10 la sută; și ciclu lumină/întuneric 12/12-h) cu mâncare de laborator și apă ad libitum. Studiul pe animale a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Institutului de Toxicologie din Coreea (Daejeon, Coreea), iar toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Ghidurile de testare pentru evaluarea siguranței medicamentelor de la Administrația Coreeană pentru Alimente și Medicamente. Studiul pe animale a fost împărțit în trei secțiuni: studiu de toxicitate cu doză unică (acută) și doză repetată (1 săptămână și 4 săptămâni) administrare consecutivă. Patruzeci de șobolani au fost repartizați aleatoriu în patru grupuri (control, t1,t2 și t3) folosind sistemul Path/Tox (versiunea 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, SUA) în fiecare studiu de toxicitate.

4.2. Experiment de toxicitate

Studiul de toxicitate a fost împărțit în trei secțiuni: studii de toxicitate cu doză unică (acută) și două doze repetate (doză consecutivă de 1 săptămână sau 4 săptămâni). Pentru fiecare studiu de toxicitate, șobolanii au fost repartizați aleatoriu în grupuri adecvate (control, doza 1, doza 2 și doza 3 pentru studiile de toxicitate unică și 4-săptămânală; martor, doza 1 și doza 2 pentru 1- studiu de toxicitate pe săptămână) prin utilizarea sistemului Path/Tox (versiunea 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, SUA). În studiul de toxicitate, ifosfamida a fost administrată pe cale intraperitoneală (IP), iar grupul de control a primit apă distilată (DW). Doza de ifosfamidă utilizată în studiul de toxicitate a fost următoarea: studiu de toxicitate acută (12,5, 25 și 50 mg/kg), 1-studiu de toxicitate pe săptămână (75 și 100 mg/kg BW/zi) și {{19 }}studiu de toxicitate pe săptămână (25, 50 și 70 mg/kg BW/zi). Simptomele clinice generale ale animalelor, greutatea corporală și mortalitatea au fost înregistrate zilnic în timpul administrării și toate animalele au fost sacrificate la 24 de ore după ultima administrare de ifosfamidă. Au fost colectate probe de sânge și plasate în tuburi de microcentrifugă și tuburi EDTA-K2 pentru biochimia serului și, respectiv, analiza hematologică. Țesuturile hepatice și renale au fost fixate în formaldehidă și supuse analizei histopatologice. Au fost efectuate imunohistochimie suplimentare, analize cu microarray și RT-PCR în timp real pe țesuturile hepatice și renale din studiul de toxicitate subacută (100 mg/kg BW/zi).

4.3. Analize hematologice și biochimice serice

Testele hematologice standard au fost efectuate folosind un sistem hematologic ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Germania). Au fost utilizați următorii indicatori: număr de globule albe (WBC), număr de globule roșii (RBC), hematocrit (HCT), concentrație de hemoglobină, volum corpuscular mediu (MCV), hemoglobină corpusculară medie (MCH), număr de trombocite (PLT), numărul de limfocite (LYM), monocite (MON), neutrofile (NEU), bazofile (BAS), eozinofile (EOS) și celule mari necolorate (LUC) și reticulocite (RET).

Testul de biochimie a fost efectuat folosind un analizor automat (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japonia) cu ser centrifugat. Principalii indicatori biochimici au fost alanina aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), fosfataza alcalina (ALP), azotul urinar din sange (BUN), creatinina (CREA), glucoza (GLU), colesterolul total (TCHO), raportul albumina/globulina. (A/G), trigliceride (TG), bilirubină totală (TB), gamma-glutamil transferază (GGT), fosfolipide (PL), calciu, clorură, sodiu anorganic, fosfor și potasiu.

4.4. Examen histopatologic și imunohistochimic

Țesuturile încorporate în parafină au fost secționate la 5-µm grosime, colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și examinate microscopic.

Țesutul renal a fost supus imunohistochimiei. Secțiunile deparafinate și spălate au fost preincubate cu 10% ser de capră pentru a bloca colorarea nespecifică. Lamelele au fost apoi incubate peste noapte cu anticorpul anti-KIM1 primar (1:750; Santa Cruz, CA, SUA). După îndepărtarea anticorpilor primari, secțiunile au fost procesate cu VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, Marea Britanie), iar expresia KIM1 a fost examinată la microscop cu lumină.

4.5. Analiza Microarray și Analiza Interacțiunii Proteină-Proteină (PPI).

Ficatul și rinichii din grupul 1-săptămână (100 mg/kg) au fost omogenizate, iar ARN-ul total a fost extras cu un mini kit de RNază (Qiagen). Sinteza cADN a fost realizată utilizând un kit de sinteză cADN (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA) și a fost supusă analizelor microarray și PPI.

Analiza microarray a fost efectuată utilizând Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 cu GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, SUA) și rezultatele au fost procesate folosind software-ul de analiză GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Genele exprimate diferențial (DEG), care s-au modificat de mai mult de 1.5-ori după administrarea ifosfamidei, au fost selectate utilizând o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) cu testul post-hoc al lui Tukey. Funcțiile biologice și căile canonice ale DEG-urilor selectate au fost analizate utilizând software-ul Ingenuity Pathway Analysis (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, SUA) și a fost efectuată o analiză a regulatorului din amonte pentru a identifica regulatorii din amonte care ar putea să fie responsabil pentru DEG derivate din toxicitatea ifosfamidei. Analiza suplimentară a rețelei de interacțiune proteină-proteină (PPI) a DEG-urilor a fost efectuată folosind software-ul STRING (versiunea 10), iar interacțiunea a fost confirmată când scorul mediu de încredere a fost peste 0,4. Interacțiunea proteinelor este probabilitatea aproximativă ca o legătură prezisă să existe între două proteine ​​în calea Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

4.6. Studiu cantitativ RT-PCR în timp real

Expresia genelor regulatoare comune în studiul cu microarray a fost confirmată utilizând RT-PCR cantitativ în timp real. Primerii specifici genei au fost obținuți de la Bioneer (Daejeon, Coreea). Secvențele de primer au fost după cum urmează: factorul de reglare a interferonului 7 (IRF7): înainte, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 și invers, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; peptidaza 18 specifică ubiquitinei (USP18): înainte, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 și inversă 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; domeniul radical S-adenozil metionină care conține 2(RSAD2): înainte, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 și invers, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; Gena 15 stimulată de interferon (ISG15): înainte, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3și inversă, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

ARN-ul total a fost transcris invers la ADNc folosind SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, SUA) și primeri oligo-dT, conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile de expresie ARNm ale genelor de reglementare din amonte au fost analizate utilizând sistemul StepOnePlus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SUA) cu amestecul principal anSYBR Green (Applied Biosystems), conform protocolului producătorului. Primerul de ARN ribozomal 18S a fost utilizat ca control intern, iar rezultatele au fost exprimate ca schimbare de ori față de grupul de control normal.

4.7. Analize statistice

Datele au fost analizate statistic folosind mai multe metode de comparare. Când testul lui Bartlett nu a arătat abateri semnificative de la omogenitatea varianței, analiza varianței (ANOVA) a fost utilizată pentru a determina dacă vreuna dintre mediile grupului a diferit la nivelul de semnificație al p < {{0}}.05.="" în="" plus,="" testul="" dunnett="" a="" fost="" utilizat="" pentru="" a="" determina="" diferențele="" de="" date="" între="" grupurile="" de="" control="" și="" de="" tratament="" atunci="" când="" datele="" s-au="" dovedit="" a="" fi="" semnificative="" din="" testul="" anova.="" în="" plus,="" când="" s-au="" observat="" abateri="" semnificative="" de="" la="" omogenitatea="" varianței="" de="" la="" testul="" lui="" bartlett,="" a="" fost="" efectuat="" un="" test="" de="" comparație="" neparametric,="" testul="" kruskal-wallis="" (h),="" pentru="" a="" determina="" dacă="" vreuna="" dintre="" mediile="" grupului="" a="" fost="" diferită="" la="" p="">< 0,05.="" când="" a="" fost="" observată="" o="" diferență="" semnificativă="" în="" testul="" kruskal–wallis="" (h),="" a="" fost="" efectuat="" subtestul="" dunn’s="" rank="" pentru="" a="" cuantifica="" perechile="" specifice="" de="" date="" de="" grup="" care="" au="" fost="" semnificativ="" diferite="" de="" medie.="" testul="" exact="" al="" lui="" fisher="" a="" fost="" efectuat="" pentru="" a="" compara="" perechi="" de="" date="" (inclusiv="" prevalența="" și="" procentul).="" nivelul="" de="" probabilitate="" a="" fost="" setat="" la="" 1="" sau="" 5="" procente.="" analizele="" statistice="" au="" fost="" efectuate="" prin="" compararea="" datelor="" din="" diferitele="" grupuri="" de="" tratament="" cu="" cele="" ale="" grupului="" de="" control="" folosind="" path/tox="" (versiunea="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Declarație de disponibilitate a datelor:

Datele sunt conținute în articol sau în Materiale suplimentare.

Conflicte de interes:

Autorii declară că nu au interese concurente.

Referințe

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Doze mari de ifosfamidă la pacienții cu osteosarcom de grad înalt recidivat și nerezecabil: o serie retrospectivă. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Efecte secundare ale ifosfamidei. Oncologie 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Durerile în creștere ale ifosfamidei. Clin. Kidney J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Ilie, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., a 3-a; Antman, KH Ifosfamidă/carboplatină/etoposidă în doză mare cu suport pentru celule stem hematopoietice autologe: siguranță și direcții viitoare. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Cursul secvențial și managementul prospectiv al toxicității multi-organe induse de ifosfamidă. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Citocromul P450 3A și 2B6 în rinichiul în curs de dezvoltare: Implicații pentru nefrotoxicitatea ifosfamidei. Pediatr. Nefrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB rezumat: Căile Ifosfamidei, farmacocinetică și farmacodinamică. Farmacogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acroleină și cloroacetaldehidă: O examinare a biomarkerilor de toxicitate celule și fără celule. Chim. Biol. Interacționa. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Un model integrativ de predicție a toxicității induse de droguri cu mai multe organe folosind date despre expresia genelor. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Evoluții în toxicogenomics: înțelegerea și prezicerea toxicității induse de compus din datele despre expresia genelor. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Construirea unui model predictiv pentru evaluarea toxicității multiple de organe. Mol. Toxicol celular. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamidă și ciclofosfamidă: Efecte asupra imunosupravegherii. Oncologie 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Moartea indusă de cloroacetaldehidă și acroleină a celulelor tubului proximal uman. Pediatr. Nefrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Palet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Nefrotoxicitatea ifosfamidei la pacienții adulți. Clin. Kidney J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. O revizuire a activității sale antineoplazice, a proprietăților farmacocinetice și a eficacității terapeutice în cancer. Drugs 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Plantare, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Studiu de fază I privind docetaxelul și ifosfamidă la pacienții cu tumori solide avansate. Br. J. Cancer. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Nefrotoxicitate cronică a ifosfamidei la copii. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Sobolanul de laborator; CRC Press: Boca Raton, FL, SUA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Toxicitate hepatică acută cu ifosfamidă în tratamentul sarcomului: raport de caz. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Utilizarea transcriptomicelor în înțelegerea mecanismelor de toxicitate indusă de medicamente. Pharmacogenomics 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Analiza transcriptomică a efectului ifosfamidei asupra celulelor MDCK cultivate în biocipuri microfluidice. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Conjugarea glutationului a medicamentului citostatic ifosfamidă și rolul glutationului S-transferazelor umane. Chim. Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoetan sulfonat de sodiu) funcționează ca un regulator al mieloperoxidazei. Radic liber. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; Ioan, A.; Raza, H. N-acetil cisteina atenuează stresul oxidativ și dezechilibrul redox dependent de glutation cauzat de tratamentul cu glucoză ridicată/acid palmitic ridicat în celulele Rin-5F pancreatice. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, un nou factor de reglare a interferonului asociat cu latența virusului Epstein–Barr. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Viruși și limfoame. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Roluri distincte pentru factorul de reglare IFN (IRF)-3 și IRF-7 în activarea proprietăților antitumorale ale macrofagelor umane. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Activare, reglare, modificare și funcționare. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 atenuează răspunsurile inflamatorii printr-o cale de semnalizare TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, NOI; Tesar, BM; Goldstein, DR Îmbătrânirea afectează reglarea în sus a factorului de reglare IFN 7 în celulele dendritice plasmacitoide în timpul activării TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]