Impactul nefrotoxinei ocratoxinei A asupra celulelor renale umane studiate de un model nou de co-cultură este influențat de prezența fibroblastelor

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract:Therinichieste amenințată de o mulțime de substanțe potențial toxice. Pentru a studia influența nefrotoxinei ocratoxinei A (OTA) am stabilit un model de co-cultură celulară constând din umanrenal celule tubulare proximale și fibroblaste. Am studiat efectul OTA asupra supraviețuirii celulelor, expresiei genelor și/sau proteinelor legate de moartea celulară, matricea extracelulară și homeostazia energetică. Necroza indusă de OTA a fost îmbunătățită în ambele tipuri de celule în prezența celuilalt tip de celule respectiv, în timp ce apoptoza indusă de OTA a fost independentă de aceasta. În fibroblaste, dar nu și în celulele tubulare, a fost vizibil un efect de co-cultură în ceea ce privește expresia proteinei p21 legate de ciclul celular. Expresia proteinei vimentinei care indică tranziția epitelială la mezenchimală a fost independentă de starea de cultură. Expresia lncRNA WISP1-AS1 indus de OTA a fost îmbunătățită în co-cultură. Expunerea la OTA a dus la modificări ale expresiei genelor legate de metabolismul energetic cu efect de mobilizare a glucozei și o expresie redusă a proteinelor mitocondriale. Împreună demonstrăm că reacția celulelor poate fi diferită în prezența celulelor care sunt în mod natural apropiate, permițând astfel o diafonie celulară. Prin urmare, pentru a evalua toxicitatea unei substanțe, ar fi un avantaj să se ia în considerare utilizarea co-culturii în loc de monoculturi.

Cuvinte cheie:ochratoxină A; cultură de celule; metabolismul energetic; echilibrul apoptoză-necroză; mitocondriile; rinichi; renal

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ

Introducere

Datorită funcției sale excretoare,rinichieste amenințată de o varietate de substanțe dăunătoare, cum ar fi medicamentele sau contaminanții alimentari, cum ar fi micotoxinele, care duc la apariția acută sau – și mai rău – cronică.boli de rinichicu o prevalență de aproximativ 10 la sută [1,2]. Pentru a înțelege mecanismele acțiunii nefrotoxice este util să găsim strategii pentru a atenua aceste scenarii dăunătoare și au fost efectuate multe studii pentru a rezolva întrebarea de ce și cum.rinichisunt pe cale de dispariție [3–5]. Pentru a studia influențele unei substanțe asupra unui organism, este adesea dificil să folosiți animale întregi din cauza preocupărilor etice și a cerințelor prealabile organizaționale, costisitoare și elaborate. Mai mult, un transfer de cunoștințe către situația umană este asociat cu incertitudini. Prin urmare, modelele de cultură celulară au fost stabilite și sunt utilizate pe scară largă și au avantajul că un anumit tip de celulă și răspunsul acestuia la o substanță sau la un tratament pot fi studiate în condiții controlate. Deși multe și importante descoperiri au fost făcute folosind această abordare, unele dezavantaje sunt inerente: celulele unei linii celulare au fost adesea imortalizate prin mutageneză sau prin alte metode - uneori drastice - [6]. Acest lucru permite o manipulare ușoară și o utilizare îndelungată, dar cu pericolul că rezultatele găsite într-un anumit sistem model ar putea să nu fie transferabile la situația din întregul organ sau organism. Pentru a depăși acest dezavantaj, în loc de linii celulare imortalizate, pot fi folosite celule primare, dar generarea de celule primare este adesea foarte dificilă și necesită abilități tehnice avansate. În plus, celulele primare adesea nu supraviețuiesc pentru o perioadă lungă de timp și au nevoie de condiții speciale de cultură individuale. Dar celulele primare sunt cu un pas mai aproape de condițiile naturale și cel puțin uneori s-a dovedit că sunt mai sensibile, de exemplu, la stimuli toxici, așa cum sunt liniile celulare [7], ceea ce înseamnă că liniile celulare ar putea fi mai robuste. Un alt dezavantaj este faptul că celulele sunt adesea ținute în monocultură, adică fără influențele altor tipuri de celule, care în organul lor de origine sunt de obicei în apropiere. Prin urmare, ar putea fi un pas către o situație mai realistă să studiem răspunsul unui tip de celulă la o substanță sau un tratament în prezența acelor celule, care se află în organul nativ în imediata apropiere.

Înrinichi, celulele tubulare proximale sunt înconjurate de fifibroblaste și se poate presupune o influență – probabil reciprocă. Acesta este și cazul înafectarea rinichilorscenarii care conduc în majoritatea cazurilor la inflamație tubulo-interstițială și fibroză [8,9] și sunt decisive pentru declinulrinichifuncţie. Datorită capacităților lor de transport și enzimatice,renalcelulele tubulare proximale sunt puse în pericol de o varietate de substanțe toxice potențiale, cum ar fi, de exemplu, medicamentele sau rămășițele acestora sau micotoxinele. Un rol al fibroblastelor din jur este de a furniza matricea extracelulară prin eliberarea de colagen și alte componente ale matricei și, prin urmare, de a participa la integritatea țesutului [10]. Dar ele sunt, de asemenea, împreună cu celulele epiteliale, implicate în procese inflamatorii sau fibrotice.boli de rinichi[11] cu risc de dezvoltareinsuficiență renală. 

O micotoxină studiată intens și cu relevanță pentru sănătatea umană este ocratoxina A (OTA) [12,13]. Poate fi găsit într-o varietate de produse alimentare [12,14] și pentru a evita expunerea și absorbția sa este aproape imposibil [9,15]. Acest lucru conduce la observația că OTA este detectată frecvent în sângele uman în concentrații nanomolare scăzute [16]. La animalele expuse, OTA duce lainsuficiență renalăși modificări fifibrotice [17,18]. Se presupune că expunerea la OTA este implicată la omboli de rinichi[19]. În celulele tubului proximal primar uman, a fost demonstrat un efect toxic al OTA, care este observabil și la fifibroblastele primare umane, deși nu este la fel de proeminent ca în celulele tubulare proximale [7]. Mecanismele din spatele acțiunii toxice a OTA nu sunt încă complet înțelese și fac obiectul multor studii în curs. Cât de mult interferează celulele învecinate cu diferite funcții și, prin urmare, modulează funcția celulară nu este aproape cunoscută, dar este de așteptat. Într-un studiu anterior, folosind un model de co-cultură constând din șobolanrinichitubul proximal și celulele fifibroblastice, s-a dovedit că are loc un fel de diafonie între ambele tipuri de celule, conducând la observația că efectele OTA ca tranziție epitelial-mezenchimală (EMT) au avut loc numai în condiții de co-cultură [20]. O altă concluzie care se poate desprinde din acel studiu și din altele a fost că celulele de șobolan sunt mai robuste în ceea ce privește toleranța la OTA în comparație cu celulele tubulare proximale umane [7,20] și, prin urmare, este necesar un sistem model bazat pe celule umane pentru a evalua mai atent situația umană și riscul expunerii la OTA.

Prin urmare, în studiul de față, stabilim un model avansat de cocultură celulară constând din celule tubulare proximale umane (celule HK2) și fibroblaste umane (celule CCD-1092SK) pentru a studia efectele OTA asupra supraviețuirii celulelor (apoptoză). , necroză) și expresia unor gene alese în mod exemplar legate de ciclul celular, moartea celulară, matricea extracelulară și metabolism. Similar cu studiile anterioare folosind celule de șobolan [20], celulele tubulare proximale umane au fost plasate pe dispozitive de filtrare, iar filtrele au fost puse deasupra unui strat de fibroblaste însămânțate pe fundul unei plăci Petri, astfel încât partea bazolaterală a celulelor epiteliale să fie orientată către fibroblastele, permițând un fel de conversație între ambele tipuri de celule.

Rezultate

Proteine, eliberare de lactat dehidrogenază și activitate de caspază-3Pentru a obține o primă impresie despre posibilele efecte ale condițiilor culturii în sine, precum și despre efectele asupra modificărilor induse de OTA, am comparat activitatea caspazei-3 ca măsură pentru apoptoza celulelor crescute în monocultură cu activitatea celulelor crescute în co. -cultură incubată cu sau fără OTA 100 nM timp de două puncte de timp, 24 și 48 de ore. În plus, a fost determinată eliberarea de lactat dehidrogenază (LDH) ca măsură pentru necroză, precum și conținutul de proteine ​​pentru a da o impresie generală asupra stării celulei. Prin urmare, cantități egale de celule au fost plasate fie în fundul godeului (fifibroblaste), fie pe un fifiltru (celule tubulare proximale). După atingerea confluenței, fifiltrele au fost plasate în godeurile în care au fost localizate fifibroblastele (vezi rezumatul grafic). După cum se arată în Figura 1A, aproape niciun efect dependent de condiția culturii asupra conținutului de proteine ​​nu a putut fi observat în ambele tipuri de celule după 24 sau 48 de ore (a se vedea, de asemenea, fișierul suplimentar S1). La fifibroblaste, expunerea la OTA a condus la o creștere mică a conținutului de proteine, în timp ce în celulele tubulare OTA a condus la o scădere ușoară a conținutului de proteine, arătând că OTA ar putea avea un efect negativ asupra celulelor tubulare. Aceste efecte au fost aproape independente de starea culturii în ambele tipuri de celule

Figura 1. Efectele ochratoxinei A (OTA) și/sau condițiilor de cultură asupra conținutului de proteine ​​(A), activității caspazei-3 (B) și eliberării de lactat dehidrogenază (LDH) (C). Celulele au fost cultivate fie în monocultură, fie în co-cultură și au fost expuse la 100 nM OTA timp de 24 sau 48 de ore. N=3–6, n=14–18 (proteine, LDH) sau 8–9 (caspază-3). * indică ap < 0,05="" la="" celulele="" neexpuse="" la="" ota="" (comparând="" efectele="" ota,="" respectiv="" partea="" stângă)="" sau="" la="" celulele="" în="" monocultură="" (comparând="" efectele="" culturii,="" resp.="" partea="" dreaptă).="" pentru="" a="" explica="" în="" continuare="" efectul="" asupra="" conținutului="" de="" proteine,="" am="" studiat="" apoptoza="" și="" necroza.="" în="" comparație="" cu="" fifibroblastele,="" ota="" a="" avut="" un="" efect="" clar="" asupra="" apoptozei="" în="" celulele="" tubulare="" după="" 24="" de="" ore="" de="" expunere="" cu="" o="" creștere="" de="" aproximativ="" 2,5-ori="" a="" activității="" (figura="" 1b).="" după="" 48="" de="" ore="" de="" expunere,="" creșterea="" a="" fost="" încă="" observabilă,="" dar="" nu="" la="" fel="" de="" distinctă="" ca="" după="" 24="" de="" ore.="" cu="" toate="" acestea,="" aceste="" creșteri="" au="" fost="" aproape="" independente="" de="" condițiile="" de="" cultură,="" cu="" excepția="" faptului="" că,="" după="" 48="" de="" ore="" în="" prezența="" fibroblastelor,="" activitatea="" caspazei="" în="" celulele="" tubulare="" a="" fost="" ușor="" redusă,="" indicând="" un="" efect="" protector="" modest="" al="" coculturii.="" cu="" toate="" acestea,="" un="" efect="" protector="" al="" coculturii="" a="" fost="" observabil="" pentru="" fifibroblaste,="" în="" special="" în="" prezența="" ota.="" în="" co-cultură,="" eliberarea="" ldh="" a="" fost="" în="" mod="" clar="" îmbunătățită="" în="" fifibroblaste="" și="" celule="" tubulare="" în="" comparație="" cu="" condițiile="" de="" monocultură="" independente="" de="" prezența="" ota="" (figura="" 1c).="" în="" celulele="" tubulare,="" ota="" a="" condus="" la="" o="" creștere="" a="" ldh="" eliberată="" în="" medii="" în="" special="" după="" 48="" de="" ore="" de="" expunere,="" ceea="" ce="" nu="" a="" fost="" la="" fel="" de="" pronunțat="" în="" fibroblaste.="" luate="" împreună,="" prezența="" celuilalt="" tip="" de="" celule="" respectiv="" a="" condus="" la="" necroză="" sporită,="" dar="" la="" o="" apoptoză="" mai="" mică,="" astfel="" încât="" conținutul="" total="" de="" proteine="" ​​nu="" a="" fost="" modificat="" în="" mod="" remarcabil.="" efectele="" ota="" asupra="" apoptozei="" și="" necrozei="" au="" fost,="" de="" asemenea,="" în="" mare="" parte="" independente="" de="" prezența="" sau="" absența="" celuilalt="" tip="" de="">

Western Blot și expresia ARNm

CDKN1A/p21S-a demonstrat că ciclul celular este influențat de OTA și s-a putut demonstra că proteina p21 care este implicată în ciclul celular a fost reglată în sus de OTA în celulele tubulare [21]. Pentru a investiga cât de mult proteina, precum și expresia ARNm care codifică p21, este influențată de prezența fibroblastelor, am efectuat Western blot și RT-PCR. După cum se arată în figurile 2A, B și 3, expunerea de 48 de ore la OTA 100 nM a condus la o creștere a cantității de proteină p21 în condiții de monocultură, dar și de co-cultură în celulele tubulare. În fibsoblastele în condiții de cocultură, OTA nu a avut niciun efect asupra expresiei proteinei p21-, deși expresia ARNm a fost crescută de OTA independent de prezența celuilalt tip de celulă. Interesant, în condiții de cocultură, expunerea la OTA nu a crescut și mai mult expresia proteinei p21. În celulele tubulare, expresia ARN-ului nu a fost modificată de prezența fibroblastelor, dar în fibroblastele din cocultură, expresia pZlmRNA a fost îmbunătățită nu numai în cazul expuse la OTA, ci și în celulele care nu au fost expuse la OTA (a se vedea, de asemenea, fișierul suplimentar S1). Acest lucru arată că p resenee al celuilalt tip de celule are o influență asupra expresiei proteinei p21, în special în fibroblaste.

Ciclooxigenaza 2 (COX2)S-a demonstrat că proteina ciclooxigenază 2 (COX2), precum și nivelurile de ARNm sunt crescute în timpulinsuficiență renală[22]. După cum se arată în figurile 2C, D și 3, numai în fibroblaste expresia proteinei a fost crescută prin expunerea la OTA. În plus, în prezența celulelor tubulare, expresia proteinei COX2 a fost îmbunătățită atât în ​​celulele netratate, cât și în cele expuse la OTA, demonstrând o influență clară a celulelor tubulare. Expresia ARNm, totuși, nu a fost influențată de OTA și un efect foarte ușor de co-cultură a avut loc prin expunerea la OTA. În schimb, în ​​celulele tubulare, ARNm și expresia proteinei a COX2 a fost complet independentă de OTA sau de prezența fifibroblastelor. Acest lucru arată că celulele tubulare COX2 pot influența fibroblastele, dar fibroblastele nu au nicio influență asupra celulelor tubulare.

FibronectinăInsuficiență renalăeste adesea însoțită de fibroză. În timpul fibrozei, are loc o acumulare de matrice extracelulară și o observație pe lângă alta este o creștere a cantității de proteine ​​​​fifibronectine [23]. Prin urmare, modificarea dependentă de OTA a ARNm care codifică fibronectină și a expresiei proteinei a fost determinată în condiții de mono- sau co-cultură. După cum se arată în figurile 3 și 4A,B, expunerea la 48 de ore a celulelor tubulare la OTA 100 nM a condus la o scădere a fifibronectinei intracelulare atât în ​​monocultură, cât și în co-cultură. Efectul OTA a fost mai scăzut în co-cultură. Mai mult, cantitatea de ARNm care codifică fifibronectină a fost redusă prin expunerea la OTA, independent de condițiile de cultură, iar prezența fifibroblastelor a condus la o expresie mai scăzută a ARNm în celulele martor și expuse la OTA. În schimb, la fifibroblaste expresia fifibronectinei nu a fost aproape modificată nici de OTA și nici de condițiile de cultură din cauza unei mari variații, în special în Western blot. O tendință către expresia indusă de OTA ar putea fi vizibilă în monocultură.

VimentinVimentina este o proteină a cărei abundență crește atunci când are loc tranziția epitelial-mezenchimală (EMT) și dezvoltarea EMT poate duce lainsuficiență renală[23]. Prin urmare, modificarea dependentă de OTA a ARNm-ului vimentinei și a expresiei proteinei a fost determinată în condiții de mono și co-cultură. După cum se arată în figurile 3 și 4C, D, expunerea la 48 de ore a celulelor tubulare la OTA 100 nM a condus la o abundență mai mică de proteină vimentină atât în ​​condiții de monocultură, cât și de co-cultură. Cu toate acestea, în prezența fifibroblastelor, expresia proteinei vimentinei a fost independentă de condițiile de cultură. Expresia ARNm care codifică vimentină nu a fost aproape modificată nici de OTA, nici de condițiile de cultură, cu excepția faptului că expunerea la OTA în cocultură a arătat o ușoară creștere. În fifibroblaste, expresia proteinei vimentinei a fost complet independentă de expunerea la OTA, precum și de prezența celulelor tubulare. În plus, expresia ARNm care codifică vimentină nu a fost aproape modificată

Exprimarea unor gene selectatePentru a testa în continuare în mod exemplar în ce măsură condițiile de cultură pot afecta și expresia altor ARN-uri, am selectat câteva gene, care joacă un rol în apoptoză-necroză, dezvoltarea cancerului sau metabolismul energetic (a se vedea, de asemenea, fișierul suplimentar S1).

WISP1-AS1este un ARN lung necodant (lncRNA) indus de OTA care afectează reglarea transcripțională și joacă un rol în echilibrul apoptoză-necroză și probabil în dezvoltarea cancerului [24]. După cum se vede în Figura 5A, expunerea de 48 de ore la OTA 100 nM a condus, în ambele tipuri de celule, la o creștere semnificativă a expresiei acelui lncARN. Fără OTA, prezența celuilalt tip de celulă respectiv nu a avut aproape nicio influență asupra expresiei. Cu toate acestea, în prezența OTA, expresia sa a fost mai mare în cocultură în comparație cu monocultură.

GDF15Factorul de diferențiere de creștere 15 (GDF15) este un membru al superfamiliei factorilor de creștere transformatori care răspunde la stres. Se discută ca biomarker și pentruboli de rinichisau ca un predictor de supraviețuire alrinichipacienţi cu transplant [25,26]. Expresia ARNm care codifică GDF15 a fost îmbunătățită în ambele tipuri de celule după expunerea la OTA, așa cum se arată în Figura 5B. Acest efect indus de OTA a fost favorizat la fifibroblaste când celulele tubulare se aflau în apropiere. În celulele tubulare, totuși, expresia a fost independentă de prezența fibroblastelor (Figura 5B).CDK2Kinaza 2 dependentă de ciclină (CDK2) a fost identificată prin analiza rețelei de corelație ponderată ca un regulator major al dereglării ciclului celular indus de OTA [21]. În fifibroblastele în monocultură, expresia ARNm care codifică CDK2 nu a fost modificată de OTA. În plus, prezența celulelor tubulare nu a afectat expresia ARNm. Cu toate acestea, în celulele tubulare, OTA a condus la o expresie ușor îmbunătățită numai în prezența fibroblastelor (Figura 5C).

Glicogen și proteine ​​înrudite cu glucoză: PYGM, GYS1 și GLUT1 (SLC2A1)Therinichieste implicat și în homeostazia glucozei și poate furniza organismului glucoză fie prin gluconeogeneză, fie prin mobilizarea rezervelor de glicogen [27]. Glicogen fosforilaza (PYGM) joacă un rol în descompunerea depozitelor de glicogen, mobilizând astfel glucoza [28]. După cum se vede în Figura 6A, expunerea de 48 de ore la OTA 100 nM a condus la o creștere marcată a expresiei ARNm care codifică glicogen fosforilaza, în special în celulele tubulare. Cu toate acestea, în celulele tubulare, această creștere nu a fost dependentă de starea culturii, în timp ce în fibroblaste expresia indusă de OTA a fost mai mare în prezența celulelor tubulare în comparație cu starea fără celule tubulare, glicogen sintetaza 1 (G^YSl) catalizează reacția opusă. și în timp ce expresia fosforilazei a fost reglată în sus, expresia sinttazei a fost reglată în jos de OTA în celulele tubulare și în fibroblaste în co-ctiltură (Figura 6B). Acest lucru indică un efect de mobilizare a glucozei al OTA. În mod interesant, expresia ARNm a transportorului de glucoză GLUTl (SLC2A1) a fost reglată și de OTA (Figura 6C), subliniind ideea unei cereri sporite de glucoză din cauza expunerii la OTA, poate datorită

Proteine ​​legate de mitocondrii: NDUFB10 și MRPS16

Există indicii că expunerea la OTA poate duce la o scădere a potențialului mitocondrial înrinichicelule [24] care arată că funcția mitocondrială poate fi influențată de expunerea la OTA, care ar putea fi influențată suplimentar de prezența fibroblastelor. Prin urmare, reprezentativ pentru alte ARN care codifică proteinele mitocondriale, arătăm aici expresia ARNm-urilor care codifică NDUFB10 și MRPS16. NDUFBt0 codifică NADH mitocondrial: subunitatea B10 de ubichinonă oxidoreductază, care este o parte a complexului respirator mitocondrial I și foarte exprimată în inimă șirinichi(Genă NCBI. Disponibil online: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (accesat la 17 martie 2021)). Gena MRPS16 codifică proteina ribozomală mitocondrială S16, care joacă un rol în sinteza proteinelor mitocondriale. După cum se arată în Figura 7, expunerea la OTA de 24 de ore a condus la ambele tipuri de celule la o expresie scăzută a ambelor ARNm. În celulele tubulare, expresia scăzută a genei NDUFB10 nu a fost influențată de prezența fibroblastelor, în timp ce în fibroblaste reducerea exprimării NDUFB10 indusă de OTA a fost ușor salvată în prezența celulelor tubulare (Figura 7A). În celulele tubulare, expresia deja scăzută a genei care codifică subunitatea ribozomală mitocondrială de către OTA a fost în plus mai mică în prezența fibroblastelor, în timp ce în fibroblaste prezența celulelor tubulare a condus la o expresie puțin mai mare a ARNm MRPS16 (Figura 7B). Acest lucru arată că funcția mitocondrială poate fi afectată de OTA, dar efectul OTA poate fi modificat suplimentar atunci când cele două tipuri de celule sunt apropiate.

Discuţie

Therinichieste pusă în pericol de o varietate de substanțe nefrotoxice cu risc acut sau cronicinsuficiență renală[1]. Pentru studiul impactului substanțelor nefrotoxice asupra diferitelor tipuri de celule și pentru a reduce manipularea animalelor, culturile celulare au fost aplicate pe scară largă. Aceste culturi celulare au avantajul suplimentar că condițiile experimentale pot fi controlate și efectele specifice ale unei substanțe investigate folosind un tip de celulă definit. Pe lângă aceste avantaje incontestabile, rămân câteva considerații: de exemplu, în „organul de origine” un tip de celulă (de exemplu, celulele tubulare proximale dinrinichi) este înconjurat de alte tipuri de celule (de exemplu, fibroblaste) cu interdependențe manifolb. Prin urmare, reacția la o substanță observată atunci când se utilizează un singur tip de celulă poate să nu fie aceeași ca în prezența celulelor din apropiere în țesutul original. Într-un model constând din două tipuri diferite de celule renale de șobolan, s-a demonstrat că există o interacțiune între celulele tubulare și fibroblaste, ceea ce duce la reacții care apar numai atunci când cele două tipuri de celule erau apropiate [20]. Cu toate acestea, când se compară rezultatele acelui studiu cu constatările observate folosind celulele tubulare renale umane, reiese că celulele de șobolan sunt, în mod evident, mai robuste decât spune omul în ceea ce privește reacția lor la tratamentul cu o nefrotoxină omniprezentă, ochrafoxina A (OTA) [7]. Prin urmare, este necesar un model de co-cultură constând din celule umane. Am stabilit un astfel de model utilizând linia celulară a tubului proximal uman HK2 și fibroblaste umane. Celulele HK2 au crescut umede pe inserții de filtru și reunite cu fibroblaste, crescute pe fundul unei plăci 6-godeuri. După înregistrarea parametrilor de bază precum apoptoza și necroza, am folosit acest model pentru a obține date inițiale despre efectul ocratoxinei A asupra experienței unor proteine ​​și ARN legate de ciclul celular, EMT și metabolismul celular.

Supraviețuirea celulară  Pe baza conținutului de proteine, părea că nici OTA și nici condiția de cultură nu au avut un efect remarcabil. Cu toate acestea, relația dintre apoptoză și necroză a fost mutată către necroză în ambele tipuri de celule atunci când celulele au fost cultivate împreună. Se știe că OTA induce apoptoza în celulele tubulare [29] și într-o măsură mai mică și în fibroblaste [7]. Acest lucru se reflectă și în rezultatele prezente. Interesant, prezența celuilalt tip de celulă respectiv a condus la scăderea ratelor de apoptoză în ambele tipuri de celule, dar la o eliberare îmbunătățită de LDH. Acesta este primul indiciu că deja prezența unui alt tip de celule poate influența funcția celulară și că reacția celulelor la o substanță toxică poate fi diferită în co-cultură în comparație cu monocultură.

Expresia proteinelor și a ARN-ului Ne-am extins studiile prin determinarea exprimării proteinelor și ARN a unor proteine ​​alese în mod exemplar și a ARN-urilor care le codifică. Deoarece OTA s-a demonstrat că influențează ciclul celular [21,30], a fost studiată expresia CDKN1A/p21. Conform descoperirilor lui Dubourg et.al [21], OTA a condus la o exprimare îmbunătățită nu numai a ARNm CDKN1A, ci și a proteinei CDKN1A/p21 în celulele tubulare. În aceste celule, prezența fibroblastelor nu a influențat expresia ARNm CDKN1A, în timp ce în fibroblaste un efect clar de co-cultură a fost vizibil cu abundența ARNm îmbunătățită vizibilă numai în co-cultură. Cu toate acestea, această creștere a abundenței ARNm nu a fost oglindită complet de expresia proteinei, sugerând mecanisme de reglare suplimentare. Studiile ciclului celular pot fi adăugate pentru a obține o perspectivă suplimentară asupra impactului asupra ciclului celular. S-a descoperit că kinaza 2 dependentă de ciclină (CDK2) joacă un rol în dereglarea ciclului celular indusă de OTA [21]. În celulele tubulare, expresia sa ARNm a fost îmbunătățită de OTA în co-cultură, în timp ce fibroblastele nu au fost influențate de celulele tubulare. Împreună, rezultatele sugerează că ciclul celular din celulele tubulare este influențat de prezența fibroblastelor.

Un alt efect de co-cultură a fost observat pentru expresia COX2 în fibroblaste. Pentru fibroblaste, prezența celulelor tubulare a condus la o expresie clar îmbunătățită a proteinei (similar cu rezultatele observate în celulele de șobolan [20]), care nu a fost vizibilă pentru celulele tubulare care nu au prezentat nicio dependență de cultură. Acest lucru indică faptul că rolul fibroblastelor în inflamațieboli de rinichipoate fi subestimat de studiile care au folosit fibroblaste în monocultură. Proteina filamentului intermediar vimentina este exprimată constitutiv în fibroblaste și este din ce în ce mai exprimată în timpul tranziției epitelial-mezenchimale (EMT) în celulele epiteliale [10]. Deși s-a demonstrat că expunerea prelungită la OTA poate duce la exprimarea îmbunătățită a colagenului III sau fibronectinei în celulele tubulare [7], în studiul de față expresia proteinei indicatoare de EMT vimentină în celulele tubulare a fost chiar mai mică după expunerea la OTA, independent. a condiţiilor de cultură. În plus, expresia ARNm și a proteinei fibronectinei a fost mai degrabă mai mică și nu a fost îmbunătățită. În plus, în fibroblaste, nicio expresie alterată nu a fost demonstrată, astfel încât aceste constatări nu argumentează în favoarea unei EMT induse de OTA, așa cum au arătat alții [31].

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Pentru a testa în continuare dacă cocultura poate influența răspunsul celular la stresul indus de OTA, am determinat expresia unor ARN aleși în mod exemplar legate de apoptoză-necroză, dezvoltarea cancerului și metabolismul energetic. ARN-urile lungi necodificatoare joacă un rol semnificativ în multe procese de reglare celulară și deraierea lor, precum și în fibroza renală sau cancerul [32]. WISP1-AS1 este un ARN lung necodant indus de OTA și exprimat în celulele tumorale renale [24]. Am descoperit că reglarea sa în sus de către OTA în ambele tipuri de celule și cocultura a îmbunătățit reglarea în sus. Acest lucru permite agravarea efectului WISP1-AS1 asupra echilibrului apoptoză-necroză și probabil formarea tumorii. Eliberarea îmbunătățită de LDH observată în cocultură poate fi, prin urmare, cel puțin parțial explicată prin conținutul îmbunătățit de WISP1-AS1, care s-a dovedit a fi necesar pentru necroza indusă de OTA [24].

WISP1-AS1a fost de asemenea suspectat că joacă un rol în metabolism, inclusiv mitocon dria [24]. În celulele epiteliului gastric, OTA s-a dovedit că provoacă disfuncție mitocondrială [33]. Pentrurinichicelulelor, există rezultate controversate în ceea ce privește dacă expunerea la OTA are sau nu influență asupra potențialului mitocondrial [21,24]. Un potențial mitocondrial redus ar putea fi rezultatul deteriorării mitocondriilor sau ar putea provoca leziuni mitocondriale. Expresia redusă a proteinelor mitocondriale poate duce la o funcție afectată oglindită sau urmată de potențialul mitocondrial alterat. Funcția mitocondrială afectată obligă celula să folosească căi alternative pentru a asigura aprovizionarea cu energie. Aprovizionarea cu energie sub contribuția mitocondrială inadecvată poate fi menținută printr-o utilizare crescută a glicolizei care duce la o producție sporită de lactat. Cu toate acestea, în celulele HEK293, un embrion umanrinichilinia celulară, s-a descoperit că OTA a condus mai degrabă la o reducere a glicolizei, iar cantitatea crescută de lactat datorată producției de lactat din glutamină a fost dependentă de expresia lncRNA WISP1-AS1 [24]. În schimb, în ​​celulele epiteliului gastric, s-ar putea demonstra că expunerea la OTA duce la o reprogramare a metabolismului glucozei către glicoliză și o activitate mai mică a ciclului acidului tricarboxiic [34]. Putem arăta aici că (1) OTA duce la o expresie redusă a ARNm a două proteine ​​mitocondriale alese reprezentativ, care joacă un rol în sinteza proteinelor mitocondriale (MRPS16) și producerea de energie (NDUFB10) și (2) că enzimele de manipulare a glicogenului au fost reglate. într-un mod în care glucoza crescută poate fi mobilizată (GYS1 în jos și PYGM în sus). În plus, pare a fi indusă o capacitate de transport GLUT1 mai mare. Cu toate acestea, aceste modificări induse de OTA au fost aproape independente de condițiile de cultură.

În concluzie, am arătat că în condiții de cocultură, reacția celulelor poate fi diferită de reacțiile observate în monocultură, deși nu toți parametrii studiați aici au fost dependenți de cultură. Cu toate acestea, pe baza constatărilor prezentate aici, utilizarea co-culturii ar trebui să fie preferată dacă este posibil, evitând astfel posibilitatea de a supraveghea efectele care nu au loc atunci când este studiat un singur tip de celulă. Rămâne întrebarea cum comunică celulele între ele. Studiile într-un model de co-cultură la șobolan au dezvăluit un mecanism dependent de COX2-[20], iar la șoareci, acidul retinoic pare să participe la dialogul celular alrinichicelule [35]. În plus, rămâne întrebarea dacă, de ce și cum interferează OTA cu metabolismul energetic celular și cu rolul mitocondriilor în acesta.

Determinarea activităților LDH și a caspazei-3 și a conținutului de proteinePentru liză, celulele au fost spălate de două ori în tampon PBS rece cu gheață, colectate și lizate în tampon MOPSTriton (acid 20 mM 3-(N-morfolino)propansulfonic, pH 7,4, 0. 1 la sută Triton X100). Conținutul de proteine ​​din lizatele celulare a fost determinat folosind acid bicinchoninic [36,37]. Activitatea LDH în medii sau lizate celulare ca măsură pentru necroză a fost determinată conform lui Bergmeyer [38], așa cum este descris în detaliu în [20]. Activitatea caspazei-3 ca măsură a apoptozei a fost determinată folosind substratul caspazei-3 florigenice (DEVD-AFC), așa cum este descris în [39]. Pe scurt, 60 µL de lizat de celule au fost incubați cu 65 µL tampon de reacție (20 mmol/L piperazină-1,4-bis(2etansulfonic acid (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0,2% {{26}) }[({3-colaminopropil)dimetilamonio]-1-propansulfat (CHAPS), 10 mmol/L ditiotreitol (DTT), pH 7,4) care conține 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 36}}amino-4-trifluormetilcumarină, concentrație finală) la 37 ◦C. Fluorescența produsului scindat (AFC) a fost măsurată la excitație de 400 nm și emisie de 505 nm. AFC scindată a fost cuantificată printr-o curbă de calibrare folosind AFC cunoscută concentratii.

RT-PCR  Izolarea acidului ribonucleic total (ARN) a fost realizată utilizând reactiv Trizol (Life Technologies, Darmstadt, Germania). Celulele au fost spălate și apoi lizate cu reactiv Trizol și transferate într-un tub de reacție. După adăugarea de cloroform și centrifugare (12,000xg), faza superioară a fost colectată și amestecată cu izopropanol rece ca gheață. După centrifugare (12,000xg) supernatantul a fost îndepărtat și peletul a fost spălat de două ori cu 75% etanol și în final s-a dizolvat în apă. Transcrierea inversă a fost efectuată folosind un kit comercial de la Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conform instrucțiunilor acestora. PCR în timp real a fost efectuată utilizând un reactiv SYBR Green (Invitrogen). Primerii au fost sintetizați de Microsynth AG, Balgach, Elveția. Secvențele de primer sunt prezentate în Tabelul 1. Schimbarea de ori a expresiei genei a fost calculată prin metoda 2∆∆Ct folosind expresia EEF2 și RPS17 ca referințe. Expresia acestor două gene s-a dovedit a fi cele mai puțin modificate (dacă este deloc) în datele de secvențiere a ARN atunci când se compară OTA tratată cu celule HK2 netratate (rezultate nepublicate).

Western Blots  După separarea proteinelor prin electroforeză pe gel de dodecilsulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE), proteinele au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză. După aceea, locurile libere de legare ale membranei au fost blocate de o soluție de 5% de lapte uscat fără grăsimi în soluție salină tamponată cu TRIS (3 mM bază TRIS, 140 mM NaCl, 0,17 mM Tris -HCI, pH 7,4) conţinând 0,1 procente Tween20. Primii anticorpi diluați în soluție salină TRIS plus 5% albumină serică bovină (TRIS-BSA, pentru diluții vezi Tabelul 2) au fost adăugați și membranele au fost incubate peste noapte. După spălare, s-au adăugat anticorpi secundari cuplați cu fluorescență în TRIS-BSA timp de 90 de minute. Fluorescența celui de-al doilea anticorp a fost înregistrată folosind un sistem de detectare LICOR.

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI