Leziunea renală cauzată de sarcina preeclamptică se recuperează după naștere într-un model de șobolan transgenic

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Sarah M. Kedziora 1,2,3,4,5, Kristin Kräker 1,2,3,4,5 , Lajos Markó1,2,3,4,5, Julia Binder 6, Meryam Sugulle 7,8, Martin Gauster 9 , Dominik N. Müller 1,2,3,4,5, Ralf Decend 1,2,3,4,5,10, Nadine Haase 1,2,3,4,5,† și

Florian Herse 1,2,3,4,*

1 Centrul de cercetare experimentală și clinică (ECRC), O cooperare comună a Charité—UniversitätsmedizinBerlin și Centrul Max Delbruck pentru Medicină Moleculară, 13125 Berlin, Germania;sarah.kedziora@mdc-berlin.de (SMK); kristin.kraeker@charite.de (KK); lajos.marko@charite.de (LM);dominik.mueller@mdc-berlin.de (DNM); ralf.dechend@charite.de (RD); nadine.haase@mdc-berlin.de (NH)

2 Centrul Max Delbruck pentru Medicină Moleculară (MDC) din Asociația Helmholtz, 13125 Berlin, Germania

3 Charité-Universitätsmedizin Berlin, membru corporativ al Freie Universität Berlin și Humboldt-Universitätzu Berlin, 10117 Berlin, Germania

4 Institutul de Sănătate din Berlin de la Charité–Universitätsmedizin Berlin, 10117 Berlin, Germania

5 DZHK (Centrul German pentru Cercetare Cardiovasculară), Partener Site Berlin, 13353 Berlin, Germania

6 Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Universitatea de Medicină din Viena, 1090 Viena, Austria

7 Institutul de Medicină Clinică, Facultatea de Medicină, Universitatea din Oslo, 0318 Oslo, Norvegia

8 Divizia de Obstetrică și Ginecologie, Spitalul Universitar Oslo, 0450 Oslo, Norvegia

9 Divizia de Biologie Celulară, Histologie și Embriologie, Centrul de Cercetare Gottfried Schatz, Universitatea de Medicină din Graz, 8036 Graz, Austria;

10 Helios Klinikum, 13125 Berlin, Germania

† Acești autori au contribuit în mod egal la manuscris.

Abstract:

Preeclampsia (PE) is characterized by the onset of hypertension (≥140/90 mmHg) and the presence of proteinuria (>300 mg/L/24 h urină) sau alte disfuncții ale organelor materne. În timpul PE uman, au fost observate leziuni renale. Unele studii sugerează că femeile cu diagnostic de PE au un risc crescut de a dezvolta boli renale mai târziu în viață. Cu toate acestea, în studiile pe oameni, PE ca o singură cauză a acestei dezvoltări nu poate fi investigată. Aici, ne-am propus să investigăm efectul PE asupra leziunilor renale postpartum într-un model de șobolan PE transgenic stabilit. Șobolanii femele care adăpostesc gena angiotensinogenului uman dezvoltă un fenotip preeclamptic după împerechere cu șobolani masculi care adăpostesc gena reninei umane, dar sunt normotensivi înainte și după sarcină. În timpul sarcinii, șobolanii au dezvoltat modificări tubulare și glomerulare ușoare evaluate prin analiză histologică, expresie genică crescută a markerilor de afectare renală, cum ar firinichirăniremarkerul 1 și factorul de creștere a țesutului conjunctiv și albuminuria în comparație cu șobolanii de tip sălbatic femele (WT). Cu toate acestea, la patru săptămâni postpartum, majoritatea patologiilor renale legate de PE au fost absente, inclusiv albuminuria și expresia crescută a biomarkerului. Doar mărirea ușoară a smocului glomerular a putut fi detectată. În general, funcțiile glomerulare și tubulare au fost afectate în timpul sarcinii la șobolanul transgenic PE. Cu toate acestea, aproape toate aceste patologii observate în timpul PE s-au recuperat postpartum.

Cuvinte cheie: preeclampsie;rinichirănire; postpartum; model de șobolan transgenic

Cistanche previne leziunile renale

Chengdu Wecistanche poate furniza produse cistanche

1. Introducere

Preeclampsia (PE) affects about 5–8% of all pregnancies worldwide, with a high maternal mortality rate due to complications such as eclampsia, HELLP-syndrome, or edema [1–3]. According to the International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy, PE is characterized by the development of gestational hypertension (resting systolic blood pressure (BP) ≥ 140 and/or diastolic ≥ 90 mmHg) at or after 20 weeks of gestation in previously normotensive women [1]. Since proteinuria is present in only 75% of all cases [4], the American College of Obstetrics and Gynecology adapted guidelines for PE established in 2019 stated that "either proteinuria (>300 mg/L per 24-h urină) sau altă disfuncție a organelor materne" ar trebui să fie prezentă [1,5]. Patologia de bază a PE nu este încă pe deplin înțeleasă, dar o origine placentară care prezintă disfuncții imunologice și modificări vasculare joacă un rol important. rol important cu o consecință a riscului cardiovascular și metabolic substanțial pe termen lung pentru mame și copii [6–9] Diverse studii raportează că EP nu este asociată doar cu acută.rinichileziuni, dar poate duce la boală renală substanțială și insuficiență postpartum, precum și mai târziu în viață [10-12]. Leziunea renală în timpul PE uman a fost descrisă pentru prima dată de Spargo și colab. ca endoteline glomerulare, adică glomeruli măriți cu distrugerea lumenului capilar [13], atribuite hipertrofiei celulelor endoteliale sau mezangiale [14]. Prezența sclerozei glomerulare, ocluzia capilarelor din cauza îngroșării peretelui capilar glomerular, infiltrarea macrofagelor și densitatea redusă a fenestrelor endoteliale au fost descrise la femeile preeclamptice [15–18]. Aceste modificări structurale, precum și vasoconstricția și volumul plasmatic redus contribuie la o capacitate de filtrare renală redusă [15,19]. Leziunea structurală renală prezentă în timpul sarcinilor preeclamptice pare a fi reversibilă [19], în timp ce un impact funcțional este prezent postpartum și a fost raportată o asociere între PE și riscul de dezvoltare a bolii renale în stadiu terminal (BRST) mai târziu în viață [19]. 20,21]. Există dovezi că hipertensiunea cronică nedetectată înainte de apariția unei sarcini preeclamptice contribuie la creșterea riscului de boală renală postpartum la om [12,20,21].

Leziunea renală în timpul sarcinii PE a fost caracterizată la multe modele animale. Mecanismele implicate în alterările glomerulare includ un dezechilibru angiogenic [9,22–24]. În modelul de șobolan cu presiune redusă de perfuzie uterină (RUPP) pentru PE, insuficiența renală ar putea fi restabilită prin tratamentul cu factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) [25,26]. În plus, un mecanism important în leziunea renală preeclamptică pare să fie creșterea stresului oxidativ și inflamator, ceea ce duce la creșterea producției de specii reactive de oxigen (ROS) și la activarea complementului [27-30]. Deși aceste mecanisme provoacă modificări renale severe în timpul sarcinii, există o lipsă de cunoaștere a faptului dacă insuficiența renală este prezentă postpartum la modelul animal PE. Au existat doar câteva studii pe animale care s-au concentrat pe afectarea renală postpartum. În modelul RUPP, tensiunea arterială medie și albuminuria au fost restabilite la opt săptămâni după naștere. Nu a fost prezentă nicio afectare glomerulară sau tubulară, dar rata de filtrare glomerulară a fost redusă [31].

Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua efectele postpartum ale PE asuprarinichiîntr-un model uman de șobolan transgenic renină-angiotensinogen. În acest model, femelele de șobolan transgenice pentru angiotensinogenul uman au avut tensiune arterială normală înainte și după sarcină. Au dezvoltat hipertensiune arterială în ultima treime a sarcinii numai după împerecherea cu șobolani masculi care găzduiesc gena reninei umane, așa cum a fost descris mai înainte [32,33]. Femeile au dezvoltat un fenotip preeclamptic în timpul sarcinii [34], inclusiv remodelarea cardiacă postpartum [35]. Am emis ipoteza că leziunea renală pe termen lung, descrisă pentru PE la oameni și modele de rozătoare, este mediată de hipertensiunea arterială (criză hipertensivă) în timpul sarcinii preeclamptice și restabilește postpartum.

Beneficiul extractului de Cistanche: tratarea bolilor de rinichi

2. Rezultate

2.1. Fenotipul preeclamptic în modelul șobolanului transgenic

Femelele de șobolani transgenice gestante au prezentat simptome de PE (Figura 1A), în timp ce șobolanii WT nu au dezvoltat aceste simptome. TA în timpul sarcinii preeclamptice a crescut de la ziua 12 la 14, după un platou, și a scăzut la valori normotensive în două zile după sarcină. Tensiunea arterială a rămas normotensivă până la sfârșitul studiului și la patru săptămâni postpartum (Figura 1B). Șobolanii WT au fost măsurați în zilele individuale (d0, 9, 15, 19, 28, 35, 42, 49) pentru a permite compararea. Tensiunea arterială medie a fost de 105,3 ± 4,6 mmHg la șobolanii WT în timpul sarcinii și, respectiv, de 148,4 ± 2{0,7 mmHg la șobolanii gestante preeclamptice. A fost semnificativ crescută în sarcina preeclamptică (tip sălbatic, WTd19 vs. PEd19; p <0,0001) și="" postpartum="" normalizat="" (ped19="" vs.="" ped49,="" p=""><0,0001; figura="" 1c).="" șobolanii="" pe="" au="" prezentat="" albumină="" urinară="" semnificativ="" mai="" mare="" comparativ="" cu="" creatinina="" urinară="" în="" timpul="" sarcinii="" decât="" wt="" (wtd21="" vs.="" ped21,="" p="0.0024)," iar="" excreția="" de="" albumină="" a="" fost="" restabilită="" postpartum="" la="" șobolani="" pe="" (ped21="" vs.="" ped49,="" p="" {{35}="" }}.0004;="" figura="" 1d).="" deși="" albumina="" urinară="" a="" fost="" mai="" mare="" la="" șobolanii="" wt="" postpartum="" comparativ="" cu="" șobolanii="" pe,="" nu="" a="" existat="" nicio="" diferență="" semnificativă="" (wtd49="" vs.="" ped49,="" p="0.4917)." a="" existat="" un="" efect="" general="" al="" pe="" asupra="" nivelului="" de="" albumină="" la="" diferite="" momente="" de="" timp="" (2w-anova:="" f(1;29)="16.15;" p="">

După cum sa arătat într-unul dintre studiile noastre anterioare, șobolanii preeclamptici au prezentat o greutate corporală placentară și fetală redusă în comparație cu șobolanii martor [35], prin care greutatea corporală a mamei a fost redusă la sfârșitul gestației. Mediulrinichigreutatea dintre șobolanii transgenici și cei WT a fost similară în timpul (WTd{{0}},8 g ± 0.{{10}}6; PEd{{21=0},7 g ± 0,07) și după sarcină (WTd50=0,9 g ± 0,05; PEd{50=1,0 g ± 0,06) (Figura S1A).Rinichigreutatea normalizată la greutatea corporală a mamei a arătat valori semnificativ mai mari în grupul PE comparativ cu WT (WTd21 vs. PEd21 p=0.002; WTd50 vs. PEd50 p {= 0}.001; Figura S1B) Acest efect a fost determinată în principal de scăderea greutății corporale a mamei din grupul PE, care s-a datorat în principal numărului și greutăților scăzute ale puiilor și ale placentelor în grupul PE [35].

2.2. Expresia alterată a genelor marker pentru leziuni renale

Genele specifice pentru leziuni tubulare, angiogeneză, fibroză, inflamație tisulară sau stres oxidativ au fost selectate într-o manieră bazată pe ipoteze și analizate în timpul și după sarcina PE și WT. Cele mai semnificative modificări ale expresiei genelor renale au fost detectate în timpul sarcinii preeclamptice (Figura 2A). Expresia markerilor specifici de leziune tubulară,rinichimolecula de leziune 1 (Kim-1, Figura 2B) și lipocalina 2 asociată cu gelatinaza neutrofilă (Ngal, Figura 2C) a fost semnificativ crescută de 2.5-ori în timpul sarcinii de șobolan preeclamptic. Nefrina (Nphs-1), care face parte din diafragma fantei podocitelor, este exprimată în mod similar la șobolani PE și WT în timpul sarcinii, sugerând că nu există leziuni ale membranei fantei. Majoritatea genelor care sunt asociate cu angiogeneza și vasoconstricția au fost exprimate în mod similar în timpul sarcinii preeclamptice înrinichi. Nici endotelina-1 (Et{-1), factorul de creștere a endoteliului vascular (VEGF-a), nici receptorii acestora (Flt-1, Flk{-1, sare-1 ) au arătat o expresie genetică semnificativ alterată în timpul sarcinii. Pentru a identifica alterările fibrotice înrinichițesut, gene marker, cum ar fi colagenul de tip 1 și 4 (Col-1, Col{4 -1), factorul de creștere a țesutului conjunctiv (GF) și factorul de creștere transformator-beta 1 (Tgf -1) au fost măsurate. Col-1 și Ctgf au fost modificate semnificativ în timpul sarcinii preeclamptice (Figura 2A, D). Genele marker specifice CD68 (cluster de diferențiere 68 de molecule) și Mcp-1 (proteina chimioatractantă monocitară 1) au fost utilizate pentru a caracteriza procesele inflamatorii. Expresia CD68 a fost semnificativ crescută în timpul sarcinii preeclamptice în comparație cu WT. Markerii pentru stresul oxidativ renal includ componente ale NADPH oxidazei 2 (Ncf-1, Ncf{-4, Cyb-a, Cyb-b) și NADPH oxidazei 4 specifice renale (Nox-4 ). Expresia Ncf-4 a fost ușor, dar semnificativ crescută în timpul PE (Figura 2E).

Când ne-am concentrat asupra expresiei genelor după sarcina preeclamptică, au fost prezente doar câteva diferențe semnificative (Figura 2A). Markerul de inflamație CD68 a crescut semnificativ după sarcina preeclamptică în comparație cu WT postpartum. Genele asociate cu afectarea nefronului, angiogeneza și vasoconstricția și fibroza au fost exprimate în mod similar la șobolani PE și WT după sarcină. Markerul de stres oxidativ Ncf-4 a continuat să prezinte o expresie puțin mai mare la șobolani PE comparativ cu WT postpartum (Figura 2E). În plus, expresia Nox-4 a fost crescută semnificativ la șobolanii PE postpartum (Figura 2F). Valorile expresiei genice și p sunt prezentate în Tabelul S2.

beneficiul pudrei de extract de cistanche: antiinflamator

2.3. Insuficiență renală structurală ușoară

Mărirea glomerulilor și creșterea îngroșării peretelui capilar, semnul distinctiv al endotelinelor glomerulare, se asociază cu albuminuria în sarcina preeclamptică la om și șobolan [13,17,27]. În primul rând, am evaluat afectarea glomerulară în timpul sarcinii de șobolan preeclamptic și am determinat caracteristicile glomerulilor, cum ar fi dimensiunea și densitatea. Dimensiunea glomerulară nu a fost modificată în timpul sarcinii PE în analiza histologică (Figura 3A). Prin caracterizarea zonei capilare glomerulare au putut fi detectate îngroșarea peretelui capilar și scleroza glomerulară. Șobolanii PE au avut un procent mai mare de zonă pozitivă pentru acid periodic Schiff (PAS) (WTd21 vs. PEd21, p=0.0293; Figura 3B). Sistemul tubular renal este crucial pentru funcționarea fiziologicărinichi. Evaluarea leziunilor tubulare la șobolanii preeclamptici a fost efectuată prin analiza scorului leziunii tubulare, inflamației și fibrozei perivasculare. Sistemul tubular nu a fost modificat semnificativ în timpul sarcinii PE, totuși a existat o tendință de leziuni tubulare ușoare în timpul acestor sarcini. S-au observat dilatarea tubulară renală și subțierea marginii periei (Figura 3C). Inflamația a fost cuantificată prin numărul de macrofage din medularul renal. Comparația nu a evidențiat nicio diferență semnificativă în timpul sarcinii, deși șobolanii PE au prezentat un număr mai mare, dar nu semnificativ de celule pozitive CD68-, variind între 10 și 50 pe câmp vizual (Figura 3D). Aria fibrotică relativă a fost calculată pentru a cuantifica fibroza perivasculară, deși vasele la șobolani PE și WT au părut similare în timpul sarcinii (Figura 3E).

În plus, a fost efectuată o caracterizare a leziunilor glomerulare și tubulare înrinichidupă sarcina șobolanilor PE și WT. Aria smocului glomerular a fost crescută în ambele loturi postpartum; totuși, în comparație cu WT, glomerulii au fost semnificativ măriți (WTd50 vs. PEd50, p=0.0406; Figura 3A). Zona smocului glomerular nu a fost modificată postpartum la șobolani PE comparativ cu șobolanii WT (Figura 3B). Tendința de afectare tubulară renală a fost prezentă înrinichide la șobolani PE după sarcină, deși nu diferă semnificativ (Figura 3C). Similar cu observațiile din timpul sarcinii, therinichide șobolani PE postpartum au afișat mai multe celule CD68 plus pe câmp de vedere, dar comparația nu a fost semnificativă (Figura 3D). Nu au existat diferențe semnificative postpartum în fibroza perivasculară între șobolanii PE și WT (Figura 3E)

2.4. Funcția renală este ușor alterată în sarcina PE

Parametrii urinei au fost măsurați pentru a caracterizarinichifiltrare și excreție. În cazul leziunii renale, reabsorbția ar putea fi influențată. Într-o comparație la nivel de grup, creatinina urinară a fost redusă semnificativ în timpul și după sarcina preeclamptică în comparație cu WT și în grupul PE în d19 comparativ cu d49 (fiecare comparație cu p < 0.0001;="" figura="">

În mod similar, sodiul a fost semnificativ mai scăzut în PE d19 comparativ cu PE d49 (p=0.0263; Figura 4C). Dintre electroliții măsurați, numai concentrațiile de potasiu și clorură au fost afectate semnificativ în timpul sarcinii preeclamptice (K plus p=0.0063; Cl− p=0.0034; Figura 4D,E). În plus, potasiul a fost semnificativ mai scăzut în WT d19 comparativ cu WT d49 (K plus p=0.0042; Figura 4D). În mod vizibil, șobolanii PE au avut o excreție de urină mai mare în comparație cu WT gestante sau postpartum.

3. Discuție

Am investigat efectul PE asuprarinichiîntr-un model de șobolan transgenic și a analizat dacă modificările renale s-au manifestat postpartum. În timpul PE, expresia genei renale a fost modificată. Au fost prezente modificări glomerulare ușoare cu densitate glomerulară crescută și modificări tubulare. S-a putut detecta o excreție crescută de albumină. Expresia alterată a fost prezentă în genele marker asociate cu afectarea nefronului (Kim-1, Ngal), fibroză (Col{-1, Ctgf), inflamație (CD68) și stresul oxidativ (Ncf{-4) . Expresia biomarkerului de leziune tubulară Kim-1 [36] a fost crescută în timpul PE și a revenit la normal după sarcină, indicândrinichidaune numai în timpul PE. A fost detectată doar o creștere ușoară de 2,5-ori a expresiei Ngal, prin care alții au raportat o creștere rapidă de 1000-ori la leziunea tubulară [37]. Am observat modificări ușoare ale expresiei genelor markerilor de stres oxidativ (Ncf-4, Nox{-4) în rinichi în timpul PE. Aceste observații sunt însoțite de studii care subliniază ROS crescut și funcția mitocondrială afectată în timpul sarcinii înrinichia altor modele PE [28,30]. S-a demonstrat că autoanticorpii agonişti (AT1-AA), care apar în plasma femeilor preeclamptice, sunt asociaţi cu producerea de ROS în diferite ţesuturi, inclusiv înrinichi[28,38]. În modelul nostru de șobolan pentru PE, majoritatea modificărilor renale s-au recuperat postpartum. După PE au persistat doar genele marker de stres oxidativ (Ncf-4, Nox{-4), mărirea glomerulară ușoară și scăderea excreției de creatinine. Greutatea corporală a mamei a fost redusă în timpul PE din cauza greutăților placentare și fetale mai mici, dar nu a fost diferită după naștere, așa cum sa arătat înainte [34,35]. Prin urmare, presupunem că modificările excreției creatininei nu au rezultat din diferențele de masă musculară, ci mai mult din afectarea funcției renale.

Am emis ipoteza că doar o sarcină preeclamptică nu este suficientă pentru a predispune afectarea renală și influențează leziunile cardiovasculare ulterioare, așa cum s-a observat la om. Cele mai multe studii ale altor modele animale PE arată modificări renale în timpul sarcinii, cum ar fi mărirea glomerulară, fibroza, glomeruloscleroza și proteinuria [39-42]. Cu toate acestea, doar câțiva se concentrează pe efectele post-sarcină ale PE asuprarinichi. În modelul RUPP, TA și albuminuria au recidivat la opt săptămâni după naștere și nu a fost detectată nicio afectare glomerulară sau tubulară [31]. La șobolanii Dahl sensibili la sare, leziuni glomerulare și tubulare au fost prezente la femelele de șobolan la opt săptămâni după naștere, detectate ca niveluri crescute de proteine ​​de nefrină și KIM-1 în urină [43]. Împreună cu descoperirile noastre, aceste rezultate susțin dovezile că hipertensiunea arterială persistentă ar putea fi o cauză a leziunilor renale observate la oameni după sarcina preeclamptică. În plus, dependența de presiune arinichiprejudiciul a fost evidențiat de Mori și colab. Ei au folosit un model de hipertensiune indusă de angiotensină II, în care rinichiul a fost protejat de majoritatea leziunilor renale (fibroză, leziuni tubulare) atunci când presiunea arterială renală ridicată era reglată prin servocontrol cronic [44]. Aceste constatări susțin înțelegerea noastră că leziunea renală asociată sarcinii în PE depinde de reversibilitatea hipertensiunii arteriale asociate sarcinii în PE.

Ipoteza noastră inițială a fost condusă de observații la femei cu antecedente de EP, care au arătat un risc mai mare de dezvoltare a IRST sau CKD mai târziu în viață [12,45]. Majoritatea femeilor nu au avutrinichitest de funcționare înainte de PE [45]. Rezultatele noastre arată dovezi că PE singură ar putea să nu fie suficientă pentru a provoca boală renală. Dai și colab. afirmă că femeile cu hipertensiune arterială existentă anterior suprapusă de PE au avut cel mai mare risc de a dezvolta IRST în comparație cu cele cu hipertensiune arterială preexistentă sau PE [20]. Kattah și colab. au arătat că femeile cu antecedente de EP au un risc de patru ori mai mare de a dezvolta ESRD și 20% dintre ele au prezentat o scădererinichifuncția înainte de sarcină [21]. Aceste studii subliniază rolul potențial al hipertensiunii arteriale nedetectate anterior, rezultând în PE suprapusă care contribuie la boala renală. Mai mult, sugerăm că dezvoltarea bolii renale în urma sarcinii preeclamptice se datorează multiplelor boli care afectează funcția renală. Conform unei ipoteze cu lovituri multiple, două sau mai multe evenimente ar contribui la dezvoltarea bolii renale, iar PE ar putea fi doar unul dintre factorii care contribuie.

Studiul nostru prezintă limitări în ceea ce privește procedura experimentală, deoarece am inclus puncte de două ori, la sfârșitul sarcinii și postpartum. Organele au fost recoltate și analizate din ambele momente, respectiv, dar măsurarea longitudinală a TA a putut fi efectuată numai pentru cei sacrificați postpartum. Ambele grupuri au prezentat valori comparabile ale TA în timpul sarcinii. În plus, BP longitudinal a fost măsurat doar ocazional în WT pentru a îndeplini principiul 3R în experimentele pe animale. Studiile anterioare ale grupului nostru au arătat că șobolanii WT nu dezvoltă hipertensiune în timpul sarcinii [34].

În concluzie, modelul de șobolan transgenic pentru PE a arătat insuficiență renală ușoară în timpul sarcinii, care s-a rezolvat în cea mai mare parte postpartum. Leziuni renale minore cu o creștere a biomarkerilor de stres oxidativ și modificări ale filtrării glomerulare au fost prezente în timpul sarcinii preeclamptice de șobolan. Aceste rezultate au evidențiat deteriorarea ușoară arinichidupă sarcina preeclamptică și, prin urmare, nu a putut exclude complet PE ca factor de risc pentru boala renală postpartum. Bănuim că evenimente suplimentare care afectează funcția renală ar fi necesare pentru afectarea renală și insuficiența ulterioară.

Cistanche tubolosa testosteron: Cistanche poate trata bolile renale și poate îmbunătăți funcția sexuală

4. Materiale și Metode

4.1. Studiu pe animale

Femelele șobolani SD transgenici pentru gena angiotensinogenului uman (Tg(hAgt)L1623) au fost împerecheați cu șobolani masculi SD transgenici pentru gena reninei umane (Tg(hRen)L10J) așa cum a fost descris anterior [32,35]. Femelele de șobolan au fost controlate zilnic pentru un dop vaginal, care a fost presupus în prima zi de sarcină (d1). Femelele de șobolan transgenice gestante rezultate din încrucișarea animalelor transgenice au dezvoltat un fenotip preeclamptic (PE) tipic cu hipertensiune arterială și albuminurie și au fost utilizate pentru procedura experimentală [32]. Femelele și masculii de tip sălbatic SD (WT) au fost încrucișați și au servit drept martor. Toți șobolanii au fost ținuți în condiții standard, cu o temperatură controlată de 22 ± 2 ◦ C, umiditate de 55 ± 15 la sută și un ciclu lumină-întuneric de 12:12 h. Animalele au avut hrană (Sniff V1324-300) și apă ad libitum pe tot parcursul experimentului. Șobolanii au fost sacrificați la două obiective diferite, la sfârșitul sarcinii (ziua 21, n=9WT; 8PE) și la patru săptămâni de sarcină postpartum (ziua 50, n=9WT; 11PE) prin decapitare sub izofluran profund anestezie, ultimul punct de timp corespunzând la cca. doi ani la om [46]. Organele și sângele au fost colectate și depozitate la -80 ◦C până la utilizare ulterioară. Capsula renală, stratul adipos și glandele suprarenale au fost desprinse de larinichi, care a fost tăiat transversal în jumătate pentru analiză ulterioară. Studiul a fost aprobat de autoritățile locale (Oficiul de Stat pentru Sănătate și Afaceri Sociale, Berlin).

4.2. Măsurarea tensiunii arteriale

Dispozitivele de telemetrie DSI (HD-T11) au fost implantate sub anestezie prin inhalare cu izofluran (compozit izofluran-aer 2-2,5 la sută) cu 14 zile înainte de împerechere, așa cum s-a descris anterior [34]. Astfel, tensiunea arterială (TA) ar putea fi măsurată înainte, în timpul și postpartum sarcinii la intervale de 5-minute în mod regulat. Animalele au fost adăpostite singure în timpul înregistrărilor BP.

4.3. Măsurarea urinei

Urina de 24-ora a fost colectată în timpul sarcinii în ziua 19 și după sarcină în ziua 49, așa cum a fost descris anterior [47]. Probele de urină au fost analizate cu analizorul de chimie clinică AU480 (Beckman Coulter) urmând instrucțiunile producătorului. Pentru măsurarea concentrației de albumină a fost efectuat un ELISA direct, competitiv (CellTrend, Luckenwalde, Germania). Cantitățile de clorură, potasiu și sodiu au fost detectate folosind electrozi selectivi pentru ioni. Creatinina a fost convertită enzimatic și cuantificată colorimetric (Nr. OSR61204, Beckman Coulter, Krefeld, Germania). Toți parametrii urinari au fost normalizați fie la diureză, fie la concentrația creatininei.

4.4. Analiza expresiei genelor

Analiza expresiei genelor a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [48]. Pe scurt, înghețatrinichițesutul a fost omogenizat cu reactiv de liză Qiazol (Qiagen) și margele ceramice Precellys (Peqlab Biotechnology, Erlangen, Germania). ARN-ul total a fost izolat utilizând kitul RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania) urmând protocolul producătorului. Kitul de transcripție inversă cADN de mare capacitate (Applied Biosystems, Waltham, SUA) ARNm în ADN complementar (ADNc). Pentru a cuantifica expresia relativă a genei, a fost efectuată o reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă (RT-qPCR) folosind sistemul QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems) fie cu TaqManFast Universal PCR Master Mix, fie cu Fast SYBR Green Master Mix ( ambele Thermo FisherScientific, Waltham, MA, SUA). Primerul și sondele au fost proiectate folosind Primer Express3.0 și sintetizate de BioTez, Germania (secvențe de primer: Tabelul S1). Primerii au fost diluați la o concentrație finală de 10 mM, sondele la 5 mM. Expresia ARNm țintă a fost analizată cantitativ cu metoda curbei standard. Toate valorile de expresie au fost normalizate la gena menajeră 18S. Genele au fost selectate într-o manieră bazată pe ipoteze înainte de analiză.

4.5. Imunohistochimie

Rinichifeliile au fost fixate în formol 4% (24 ore), deshidratate și încorporate în parafină. Therinichiau fost tăiate transversal în felii de 2- și 4-µm grosimi cu un microtom rotativ electronic (Thermo Fisher).Rinichifeliile au fost colorate și scanate simultan folosind Slide Scanner Panoramic MIDI cu obiectivul plan-cromat 20×/0.8× (Zeiss) pentru a garanta comparabilitatea așa cum a fost descris anterior [35]. Colorarea Himalayan-eozină (HE) a fost efectuată urmând protocolul producătorului (T865, Carl Roth, Karlsruhe, Germania). Circumferința zonei smocului glomerular-capilar în trei câmpuri corticale de vedere per rinichi (n=5) a fost măsurată pentru a identifica endotelinele glomerulare. Analiza semi-cantitativă a leziunilor tubulare a fost efectuată folosind scorul de leziune descris anterior [49]. Cincisprezece imagini medulare (200 × mărire) au fost marcate într-o manieră oarbă în ceea ce privește procentul de dilatare tubulară, degenerare, necroză, formare a gipsului și pierderea marginii pensulei. Colorația periodică cu acid Schiff (PAS) a fost utilizată pentru a detecta componentele bogate în carbohidrați (glicogen) în glomeruli. Lamelele au fost incubate în acid periodic 0,5% (Sigma Aldrich, 5 min., Steinheim, Germania), clătite și a fost aplicat reactivul Schiff (Merck, Darmstadt, Germania) (10-min de întuneric). Lamelele au fost contracolorate cu Himalayan (Carl Roth, 5 min). Aria PAS pozitivă de 8-10 zone glomerulare per rinichi (n=5) a fost măsurată folosind plug-in-ul pentru pragul de culoare al ImageJ [50]. Colorația cu tricrom Masson-Goldner (MGT) a fost utilizată pentru a măsura fibroza perivasculară. Lamele de rinichi (2 um) au fost colorate în conformitate cu protocolul producătorului (3459, Carl Roth). A fost măsurat perimetrul țesutului conjunctiv, al vasului și al lumenului a trei artere bine încadrate per rinichi. Aria fibrotică a fost calculată în raport cu suprafața totală a vasului. Macrofagele din țesutul renal au fost colorate cu anticorp CD68 anti-șobolan de șoarece (clona ED1; Nr. MCD341R, Bio-Rad, con. 1:100) [51,52]. Anticorpul secundar Cy3- de măgar anti-șoarece-IgG conjugat (nr. 715-165-151, Jackson ImmunoResearch) a fost utilizat (con. 1:300) și nucleii au fost colorați cu mediu de montare Vectashield cu DAPI (40, 6-diamidă-2-fenil-Lindal; Nr. H{-1200; Vector Laboratories, Burlingame, SUA). Celulele CD68-pozitive au fost numărate manual în zece câmpuri vizuale (mărire 200 ×) per rinichi (n=5) atunci când un nucleu a fost colocalizat la un semnal Cy3. Analiza histologică a fost efectuată într-o manieră oarbă utilizând vizualizatorul de caz software (3D Hitech Ltd., Budapesta, Ungaria) și Image J (Institutul Național de Sănătate, Bethesda, MD, SUA).

4.6. Statistici

Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul GraphPad Prism 6 și 7. Valorile sunt prezentate ca medie ± abatere standard (SD). Rezultatele sunt afișate ca n=8–11 pe grup de tratament și punct de timp. Valorile aberante au fost identificate cu metoda ROUT folosind o rată maximă de descoperire falsă de 1 la sută, valorile testate pentru distribuția Gaussiană, iar compararea grupurilor a fost făcută cu o ANOVA obișnuită în două sensuri (analiza varianței) cu un test de comparație multiplă Sidak. Valoarea f este indicată cu grade de libertate respective. Valorile p sunt indicate ca * Mai mici sau egale cu 0.{{10}}5, ** Mai mici sau egale cu 0,01, *** Mai puțin decât sau egal cu 0,001, **** Mai mic sau egal cu 0,0001.

desertliving cistanche: îmbunătățirea funcției renale