Mahanimbina a îmbunătățit deficitele de memorie legate de îmbătrânire la șoareci prin transmiterea colinergică îmbunătățită și stresul oxidativ suprimat, nivelurile de amiloid și neuroinflamația Partea 2

2.6. Evaluarea nivelurilor de malondialdehidă (MDA) și glutation (GSH).

Folosind kituri disponibile comercial, nivelurile de MDA și GSH au fost analizate în probe de creier (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, SUA).

Pe măsură ce știința și tehnologia continuă să avanseze, oamenii de știință încearcă să descopere misterele activităților psihologice umane misterioase și importante, cum ar fi memoria, gândirea și conștiința. Printre acestea, studiul mostrelor de creier este considerat a fi un domeniu de mare îngrijorare deoarece ne poate ajuta să înțelegem mai profund relația dintre memorie și creier.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

În primul rând, ce este un eșantion de creier? Mai simplu spus, se referă la o metodă de captare, conservare și analiză a neuronilor (celulele creierului) și a conexiunilor lor în creier. În termeni profani, este ca o hartă a creierului care poate arăta conexiunile și funcțiile dintre diferite zone.

În continuare, să vorbim despre relația dintre mostrele de creier și memorie. Cercetările științifice au arătat că memoria noastră este strâns legată de structura creierului. Când învățăm noi cunoștințe, în creier se formează noi conexiuni neuronale, iar aceste conexiuni devin mai puternice în timp. Prin studiul mostrelor de creier, oamenii de știință lucrează din greu pentru a studia aceste conexiuni ale creierului și încearcă să înțeleagă cum să îmbunătățească învățarea și memoria prin intermediul lor.

În plus, prin analiza probelor de creier, oamenii de știință pot găsi și câteva lucruri interesante. De exemplu, au descoperit că hipocampul din creierul uman este o zonă strâns legată de memorie. Acest lucru se datorează faptului că hipocampul are o funcție importantă în creierul uman de a converti informațiile din memoria pe termen scurt în memoria pe termen lung.

Prin urmare, valoarea cercetării mostrelor de creier nu este doar să ne ajute să înțelegem mai bine relația dintre creier și memorie, ci și să ne ajute să descoperim cauzele fundamentale ale tulburărilor de memorie sau ale bolilor cognitive, promovând astfel tratamentul și prevenirea bolilor asociate.

În cele din urmă, ar trebui să luăm o perspectivă pozitivă asupra ajutorului cercetării mostrelor de creier asupra memoriei. Deși mai sunt multe probleme științifice de rezolvat, odată cu îmbunătățirea continuă a științei și tehnologiei, credem că vor exista mai multe descoperiri în viitor. Să așteptăm împreună viitorul și să ne facem creierul mai inteligent prin cercetarea științifică! Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria. Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea reacțiilor oxidative și inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea sistemului nervos. În plus, Cistanche poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Nivelurile de MDA și GSH au fost măsurate în nanomoli/miligrame de proteină și micromoli/miligrame de proteină, în mod corespunzător. Tehnica Bradford a fost urmată pentru a estima conținutul de proteine ​​din țesuturile creierului.

2.7. Estimarea activităților acetilcolinei (ACh) și acetilcolinesterazei (AChE)

Nivelurile de ACh și AChE din omogenatul cerebral au fost analizate folosind truse comercializate (BioAssay System, Hayward, CA, SUA), care au fost trusa EnzyChromTM AcetylcholineAssay și, respectiv, trusa QuantiChromTM Acetylcholinesterase Assay.

Intensitatea formării culorii a fost detectată într-un cititor de microplăci la 570 și, respectiv, 412 nm. Nivelul de ACh obținut a fost exprimat ca pM, în timp ce activitatea AChE a fost exprimată ca U/L.

2.8. Măsurarea nivelurilor de amiloid

Trusele ELISA de la Cloud Clone Corp (Katy, TX, SUA) au fost folosite pentru a evalua nivelurile de A 1-40 și A 1-42 în omogenate cerebrale. Un cititor de microplăci setat la 450 nm a fost folosit pentru a măsura formarea culorii.

Concentrația de A 1-40 și A 1-42 din probă a fost invers legată de intensitatea culorii. Rezultatele au fost reprezentate în termeni de proteină totală pg/mLof.

2.9. Evaluarea activității -Secretazei (BACE-1) în creierul șoarecelui

Activitatea BACE-1 în omogenat a fost cuantificată folosind un kit comercializat (SensoLyte® -Secretase Assay Kit de la AnaSpec, Fremont, CA, SUA). Detectarea trusei se bazează pe o peptidă, care este scindată de BACE-1, iar semnalul este detectat utilizând aspectrofotometru cu excitație/emisie la 490/520 nm.

2.10. Măsurarea activității ciclooxigenazei totale (COX).

Activitatea COX totală în omogenatul cerebral a fost estimată utilizând un kit ELISA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, SUA). Formarea culorii a fost direct proporțională cu activitatea totală a COX. A fost utilizat un cititor de microplăci pentru a citi absorbanța la 590 nm.

2.11. Expresia genică a BACE-1 și COX-2

Expresia BACE-1 și COX-2 în ARN-ul creierului izolat a fost analizată folosind RT-PCR. Cele trei etape majore implicate au fost: extracția ARN-ului, conversia ARN-ului în ADNc și reacția în lanț a polimerazei în timp real (RT-PCR).

Toți pașii au implicat truse furnizate de Qiagen Valencia, CA, SUA. În primul rând, ARN-ul a fost extras din proba de creier conservată în ARN. În această etapă, aproximativ 100 mg de probă de țesut cerebral au fost omogenizate utilizând un TissueRuptor în 1 ml de reactiv de liză QIAzol și incubate timp de 5 minute la temperatura camerei.

Amestecul de lizat de creier și reactiv de liză QIAzol a fost adăugat cu cloroform și agitat energic timp de 15 s, urmat de incubare la temperatura camerei timp de 2-3 minute.

Amestecul a fost centrifugat la 12,000×g timp de 15 minute la 4 ◦C, iar cele trei faze au format o fază incoloră (faza superioară), care a constat din ARN și a fost colectată cu 1 volum de etanol 70% adăugat la ea.

Apoi, 700 uL de probă au fost transferați într-o coloană de centrifugare și centrifugat la temperatura camerei la 8000 x g timp de 15 s; curgerea a fost eliminată. După adăugarea a 700 µL de tampon RW1 (furnizat în kit) și centrifugare timp de 15 s la 8000 x g, curgerea a fost eliminată. Etapa a fost continuată cu adăugarea a 500 µL tampon RPE (furnizat în kit) și centrifugare timp de 15 s la 8000 x g.

Acest pas a fost repetat de două ori pentru a spăla orice contaminare organică din ARN. În cele din urmă, ARN-ul a fost eluat prin adăugarea a 50 µL de apă fără ARNază și centrifugat timp de 1 min la 8000 x g.

Concentrația de ARN a fost măsurată folosind ananodrop (nanodrop 2000c, Thermofisher Scientific, Waltham, MA, SUA). ARN-ul extras a fost apoi convertit în cADN, care a fost utilizat pentru a efectua RT-PCR.

În primul rând, s-au adăugat 14 uLof ARN șablon cu amestecul principal de transcripție inversă de 6 ui (1 ui de transcriptază inversă Quantiscript, 4 ui de tampon Quantiscript RT, 1 ui de amestec de primeri RT). După amestecare, a fost incubat timp de 15 minute la 42 ◦ C, urmată de incubare la 95 ◦ C timp de 3 minute pentru a inactiva transcriptaza inversă Quantiscript.

Produsul format a fost ADNc și, în final, a fost efectuată RT-PCR. Condițiile RT-PCR au fost fixate la 95 ◦ C timp de 5 minute, urmate de 40 de cicluri la 95 ◦ C timp de 10 minute și 60 ◦ C timp de 30 de minute.

Expresia genelor BACE-1 și COX{-2 a fost cuantificată și normalizată față de cele două gene menajere (-actina și GAPDH). Primerii secvențelor de nucleotide s-au bazat pe BACE-1 de șoarece (front50-GCATGATCATTGGTGGTATC-30: invers 50-CCATTTGAGATCTTGAC-CA-30) ​​și COX-2 (redirecționează 50-GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA) secvențe de ADNc. -30: înapoi 50-TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG-30), GAPDH (înainte 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: invers 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG{-30) și -actină (înainte 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: inversă 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30).

Au fost obținute măsurători de fluorescență și a fost utilizat software-ul Rotor-Gene 6000 pentru a le evalua (Qiagen, Hilden, Germania).

Rezultatele au fost prezentate ca niveluri de expresie în urma normalizării la gena menajeră, care au fost B-actina și GAPDH utilizând abordarea comparativă CT (ciclu de prag). Ecuația (1) a fost utilizată pentru a calcula expresia genică a probei.

Valoarea CT a fiecărei probe a fost obținută pe baza curbei standard care a fost generată pentru fiecare genă (genă țintă și genă de referință).

∆∆CT=∆CT eșantion − ∆CT control (1)

unde

∆CT eșantion: valoarea CT a genei țintă − valoarea CT a genei de referință

∆CT control: valoarea CT a genei țintă − valoarea CT a genei de referință

2.12. Analiza Statistică

Datele experimentale au fost prezentate ca medie ± SEM. Procedura ANOVA unidirecțională (Graph Pad versiunea 9, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA) și testul Tukey-Kramerpost hoc au fost utilizate pentru a clasifica variațiile statistice. Semnificativ a fost definit ca valoare de aprobare de 0,05.

3. Rezultate

3.1. Memoria îmbunătățită cu Mahanimbine la șoareci în vârstă

Capacitatea de învățare și memorie spațială a mahanimbinei în modelul de șoarece a fost examinată folosind testul MWM. Au fost măsurate latența de evacuare (EL), distanța de evacuare (ED) și timpul petrecut în cadranul țintă.

Mai mult decât atât, activitatea locomotorie a fost luată în considerare, de asemenea, pe baza vitezei medii de înot a șoarecilor. Figura 2A arată că grupul de control în vârstă a avut EL semnificativ mai lung din ziua 1 astăzi 3 (22.05 ± 1.70 s, 21,35 ± 1,85 s, 19,96 ± 2,34 s, respectiv p < 0,001) în comparație cu controlul tânăr (12,75 ± 1,30, respectiv 10,12 ± 0,98, respectiv 7,60 ± 1,31).

Acesta a arătat că șoarecii în vârstă au stabilit un deficit substanțial în funcție de învățare și memorie în testul MWM. Cu toate acestea, tratamentul oral cu diferite doze (1 și 2 mg/kg) de mahanimbine a arătat o inversare a modificărilor menționate mai sus în EL la șoarecii în vârstă.

Valorile EL pentru grupul de mahanimbină de 1 mg/kg au fost 22.01 ± 1,60 s, 15,88 ± 1,54 s (p <0.01) și 8 .26 ± 0.93 s (p < 0.0{01) pentru zilele 1, 2 și 3, în mod corespunzător în comparație cu controlul în vârstă, în timp ce EL valorile pentru grupul de mahanimbină de 2 mg/kg au fost 16,09 ± 0,33 s (p < 0,05), 17,14 ± 0,57 s (p < 0,05), 10,57 ± 0,86 s (p < 0,05), 10,57 ± 0,86 s (p < 0,05). 0,01), respectiv, atunci când este paralel cu controlul în vârstă. În ziua 3, EL a ambelor grupuri (1 și 2 mg/kg) de mahanimbină nu a fost semnificativ diferită de controlul tânăr.

Figura 2. Efectul mahanimbinei asupra (A) latenței de evadare, timpul necesar pentru a găsi platforma ascunsă. (B) Distanța de evacuare, distanța parcursă de la punctul de plecare până la găsirea platformei ascunse; (C) viteza medie, viteza de înot a animalului pentru a găsi platforma ascunsă; (D) testul sondei, procentul de timp al șoarecilor în vârstă petrecut în cadranul țintă folosind testul labirintului cu apă Morris. Au existat îmbunătățiri semnificative ale latenței de evacuare și ale distanței de evacuare cu mahanimbine la șoarecii în vârstă.

În plus, tratamentul a crescut timpul petrecut în cadranul țintă al șoarecilor în vârstă. Toate datele au fost exprimate ca medie ± SEM (n {{0}}). ANOVA unidirecțional (ziua 1: F(3,20)=11,74, p <0.001, ziua 2: F(3,20)=17.38,p < 0.{0{01 și ziua 3: F(3,2{{69 }})=14.88, p < 0.001 pentru latența de evadare ziua 1: F(3,20) {{; 26}}.22, p < 0.001, ziua 2: F(3,20)=28.62, p < 0,001 și ziua 3: F(3,20) {{40 }}.15, p < 0.001 pentru distanța de evacuare ziua 1: F(3,20)=1.939, p > 0.05, ziua 2: F(3,20)=3.467, p > 0,05 și ziua 3: F(3,20)=2,497, p > 0,05 pentru viteza medie F(3,20)=7,185, p < 0,01 pentru testul sondei; Testul de comparații multiple Tukey-Kramer.** p < 0,01 și *** p < 0,001 în comparație cu controlul tânăr, # p < 0,05, ## p < 0,01 și ### p < 0,001 în comparație cu controlul în vârstă.

Figura 2B reprezintă efectul mahanimbinei asupra distanței parcurse de la punctul de plecare până la găsirea platformei ascunse. Grupul de control în vârstă a parcurs cea mai mare distanță înainte de a găsi platforma ascunsă în zilele 1, 2 și 3 (4,79 ± 0,73 m, 4,34 ± {{0}},11 m și 4,38 m ± 0,59 m; p < {{{0}}.0{01) atunci când se raportează la controlul tânăr (1,36 ± 0,31 m, 1,35 ±; 0,24 m, respectiv 0,78 ± 0,14 m).

Șoarecii în vârstă care au fost hrăniți cu 1 mg/kg de mahanimbină au redus semnificativ DE (2,17 ± 0,11 m (p < 0.01), 2,10 ± { {13}},24 m (p < 0.001), 0,89 ± 0,18 (p < 0,001, respectiv) pentru ziua 1 până în ziua 3 conformă cu controlul în vârstă;

O scădere paralelă semnificativă a DE a fost observată la șoarecii cărora li sa administrat 2 mg/kg de mahanimbină în zilele 1, 2 și 3 (2,43 ± 0,28 (p <0.01) , 2,78 ± 0,32(p < 0.001), 1,47 ± 0,30 (p < 0,001);

În ceea ce privește viteza medie de înot în timpul sarcinii, nu au fost observate diferențe între grupuri (Figura 2C). Acest lucru indică faptul că mahanimbina nu a modificat nicio activitate locomotorie legată de funcția motorie la șoarecii în vârstă.

După 24 de ore de la sarcina efectivă, a fost efectuată o sesiune de testare a sondei (ziua 30) pentru a evalua păstrarea memoriei animalelor. Grupul de control în vârstă (Figura 2D) a petrecut mai puțin timp în cadranul țintă (10,1{0 ± 1,14% (p <0,001)) și a arătat un timp petrecut semnificativ redus în cadranul țintă în comparație cu martor tânăr (19,53 ± 2,56%), în timp ce șoarecii vârstnici tratați cu 1 mg/kg (20,27 ± 4,84%, p < 0,01) și 2 mg/kg (17,85 ± 1,56%, p < 0,05) de mahanimbină prin gavaj oral au prezentat o substanță semnificativă. timp petrecut mai mult în cadranul vizat în comparație cu controlul în vârstă.

3.2. Efectul Mahanimbinei asupra nivelurilor de MDA și GSH în creierul în vârstă de șoarece

Nivelurile de MDA la controlul în vârstă (Figura 3A) au fost considerabil mai mari (11,54 ± 0,88 µM; p < 0.001) în raport cu controlul tânăr (4,37 ± 0,09). µM). Creșterea nivelului de MDA în omogenatul cerebral al șoarecilor în vârstă a reflectat o activitate LPO mai mare, ceea ce a indicat o creștere a stresului oxidativ în țesutul cerebral.

În schimb, administrarea de mahanimbine (1 mg/kg, po) a scăzut semnificativ nivelurile de MDA din creier la șoarecii în vârstă (7,56 ± 0,35 µM; p < 0.001) comparativ cu la controlul în vârstă. Nu s-au observat modificări considerabile cu 2 mg/kg de mahanimbină (9,65 ± 0,51 pM).

Cantitatea de glutation (GSH) din omogenatul creierului a sugerat potențialul antioxidant al mahanimbinei. Analiza statistică a GSH (Figura 3B) a arătat o atenuare semnificativă între grupul de control în vârstă (0.0028 ± 0.0004 µmoli/ mg; p < 0,001) când este asociat cu controlul tânăr (0,0447 ± 0,0029 pmol/mg).

Studiul de față a mai constatat că tratamentul cu mahanimbină (1 și 2 mg/kg, po) a inversat nivelul GSH, care a fost semnificativ mai mare (0.0372 ± 0.{{8} }{{10}}38 pmoli/mg, p < 0,001 și respectiv 0,0282 ± 0,0041 pmoli/mg, p < 0,001) conform controlului în vârstă;

3.3. Mahanimbina a îmbunătățit activitatea colinergică a creierului de șoarece în vârstă

Figura 4A arată nivelurile ACh din creierul șoarecelui. ACh a fost redus în mod comparabil (p <0.0{01) la controlul în vârstă (17,79 ± 1,54 µM) în comparație cu controlul tânăr (34,82 ± 0). 31 pM). Administrarea mahanimbinei (1 și 2 mg/kg), totuși, a crescut semnificativ (35,61 ± 0,85 uM, (p < 0,001); 39,42 ± 0,88 uM (p < 0,001); respectiv) nivelul ACh din creier asociat cu controlul în vârstă.

Figura 4B reprezintă efectul mahanimbinei împotriva activității ACHE din creier. Activitatea AChE în grupul de control în vârstă (204,80 ± 1,55 U/L) a fost considerabil crescută (p <0,001) în paralel cu controlul tânăr (51,06 ± 1,36 U/L).

Cu toate acestea, AChElevel a fost inhibat sugestiv cu tratamentul cu 1 mg/kg (62,03 ± 4,64 U/L; p <0,001) și 2 mg/kg (43,73 ± 4,76 U /L; p < 0,001) mahanimbină când este asociată cu controlul în vârstă. În general, administrarea unei doze mari de mahanimbină (2 mg/kg, po) a produs rezultate mai bune pentru activitatea colinergică, deoarece a crescut nivelul ACh și a suprimat activitatea AChE.

For more information:1950477648nn@gmail.com