Perspectivă mecanică asupra neuroprotecției induse de Diosmină și îmbunătățirii memoriei la modelul de șobolan cu acid intracerebroventricular-chinolinic: resurecția funcțiilor mitocondriale și a antioxidanților Partea 3

2. Material și Metode

2.1. Animale experimentale. .Această cercetare a fost permisă de IAEC în baza protocolului nr. ASCB/IAEC/14/20/145. Șobolanii AlbinoWistar (orice sex, 200 g până la 250 g, cu vârsta cuprinsă între 8 și 9 luni) au fost păstrați în incinte cuboidale de polipropilenă de dimensiuni tipice sub setări artificiale de temperatură (23 ± 2 grade), secvențe de întuneric/lumină de 12:12 ore și umiditate (40 ± 10%) în interiorul adăpostului instituțional pentru animale. Rozătoarele au fost hrănite cu alimente hrănitoare standard (Ashirwad Manufacturers, Punjab) și cu apă purificată după bunul plac.

Relația dintre bărbați și femei și memoria a atras întotdeauna multă atenție. Este bine cunoscut faptul că hormonii masculini joacă un rol important în dezvoltarea fizică, menținerea sănătății și promovarea dezvoltării sexuale și a funcției sexuale. În plus, studii recente au arătat că hormonii masculini sunt strâns legați de memorie.

Studiile au arătat că bărbații au rezultate mai bune decât femeile în anumite sarcini de memorie. De exemplu, bărbații au rezultate mai bune decât femeile în memoria spațială, iar motivul este efectul hormonilor masculini asupra hipocampului. Hipocampul este zona din creier care procesează memoria spațială. Hormonii masculini pot promova funcția hipocampusului, îmbunătățind astfel capacitatea de memorie spațială a bărbaților.

Cu toate acestea, hormonii feminini au și un efect pozitiv asupra memoriei. Studiile au descoperit că hormonii feminini pot promova expresia genelor legate de memorie în creier și pot crește numărul și funcția neuronilor din hipocamp, îmbunătățind astfel memoria femeilor. În plus, hormonii feminini pot ameliora stresul, pot inhiba moartea celulelor neuronale, pot proteja neuronii creierului și pot îmbunătăți în continuare memoria femeilor.

Acest lucru arată că atât hormonii masculini, cât și hormonii feminini au un efect pozitiv asupra îmbunătățirii memoriei. Bărbații și femeile au performanțe de memorie diferite, fiecare cu avantajele și dezavantajele sale, dar asta nu înseamnă că bărbații au o memorie mai bună decât femeile sau că femeile au o memorie mai bună decât bărbații. Prin urmare, nu ar trebui să folosim genul ca măsură a memoriei. Toată lumea ar trebui să se joace pe deplin în avantajul său și să-și îmbunătățească constant memoria.

În cele din urmă, fie bărbați, fie femei, ar trebui să acordăm atenție sănătății noastre fizice și condiției mentale și să alegem calea potrivită de a ne îmbunătăți memoria. De exemplu, învățarea constantă a lucrurilor noi, dezvoltarea obiceiurilor obișnuite de viață și menținerea stabilității emoționale pot avea un impact pozitiv asupra îmbunătățirii memoriei. Să lucrăm împreună pentru a explora și exersa în mod continuu metode de îmbunătățire a memoriei și de a crea un viitor mai bun pentru noi înșine. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche este un medicament tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea Cistanche vine din diferitele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid tanic, polizaharide, glicozide flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului în multe feluri.

Faceți clic pe cunoaște 10 moduri de a îmbunătăți memoria

Toate procedurile pe animale sunt efectuate exclusiv conform instrucțiunilor CPCSEA, GOI, New Delhi. Deținătorii și manipulatorii de animale au fost orbiți cu privire la diferitele regimuri terapeutice oferite cohortelor de animale. Au fost efectuate studii investigative pe animale, reușind cel puțin o singură două săptămâni de durată de familiarizare.

Toate investigațiile folosind animale au fost efectuate între 0900- și 1600-ore ore pe zi.2.2. Medicamente și substanțe chimice. Diosmina (DSM: 520-27-4), acidul chinolinic (QA: 89-00-9) și analiții standard au fost achiziționați de la Merck (India).

Fosfat dihidrogen de sodiu (NaH2PO4), hidroxid de sodiu (NaOH), fosfat de potasiu dibazic (K2HPO4), nitrobluetetrazolium (NBT), metosulfat de fenazină (5-metilfenaziniu metilsulfat), acid etilendiaminotetraacetic (EDTA), albumină bovină (BSA), {{{A} 5}Acid [4-({2-hidroxietil)piperazin-1-il]etansulfonic (HEPES), 1,2-bis[{2-[bis(carboximetil) amino]etoxi]etan (EGTA), riboflavina, cianura de sodiu (NaCN), natriumazida (NaN3), pirofosfat tetrasodic, peroxid de hidrogen (H2O2), NADH disodic (DPNH), NADPH tetrasodic (sare tetrasodica redusa cu coenzima II), acid fosforic, Folin și fenol Ciocalteu (FCR) și reactiv acid sulfosalicilic (5-SSA) (HiMedia Laboratories, Maharashtra, India); diglicină, acid acetic glacial (CH3COOH), reactiv Ellman (3-carbox-4-nitrofenildisulfură, DTNB), azabenzen (C5H5N) și laurilsulfat de sodiu (SLS) (LobaChemie, Mumbai, India); 4,6-Dihidroxi-2-mercaptopirimidină (2-TBA), carbonat de disodiu (Na2CO3) și acetat de iodură de (2-mercaptoetil)trimetilamoniu (substanțe chimice TCI, India); sulfat de zinc (ZnSO4), sare Rochelle (L(+)-tartrat de sodiu de potasiu), diclorhidrat de 2-({{1-naftilamino)etilamină, acid azotat de sodiu (NaNO2) și p-aminobenzensulfonamidă (SiscoResearch Laboratories, India) ); s-au folosit alcool butilic (Fisher Scientific, India).2.3. Injecție intracerebroventriculară cu acid chinolinic.

Animalele au fost supuse anesteziei prin administrarea intraperitoneală (ip) de ketamina (90 mg/kg) și cocktail de xilazină (10 mg/kg) folosind apă sterilă pentru injecție. Corpul a fost așezat în poziția culcat pe o pernă de încălzire caldă, iar în suportul unui instrument de chirurgie stereotaxică a fost așezat capul. Scalpul a fost incizat în punctul sagital mediu, iar craniul a fost descoperit prin retragerea pielii.

Oricare dintre cei doi ventriculi laterali a fost ales în mod arbitrar, iar în craniu osul parietal a fost plictisit (coordonatele stereotaxice -0,8 mm anteroposterior de la bregma, ±1,5 mm mediolateral de la sutura media sagitală și ±3,6 mm dorsoventral de la suprafața osoasă parietală). ) pentru a face o gaură de bavură [21].

În prima zi, soluția de acid chinolinic (QA) a fost proaspăt constituită (240 nmol) în PBS (soluție salină tamponată Na+-K+ [PO4]2-, pH 7,4) și a fost injectată treptat folosind o microseringă Hamilton la un debit de 1 µl/minut în ventriculul cerebral stâng sau drept al șobolanilor pe o durată de 5 până la 6 minute cu volumul de injecție de 5 µl vehicul ICV [22].

După inocularea întregului medicament, microacul nu a fost dislocat timp de 4 până la 5 minute pentru a permite difuzivitatea medicamentului în lichidul cefalorahidian și a împiedica regurgitarea acestuia. Un volum echivalent (10 pl) de vehicul PBS a fost administrat ICV la shamrats care au fost operați în mod identic, cu toate acestea, QA nu a fost injectat.

După injecțiile cu medicamente, găurile au fost restaurate folosind un agent de lipire (fosfat de zinc, PYRAX®) și s-a realizat cusătura pielii. Pentru a preveni contaminarea (creșterea bacteriană), Neosporin® a fost aplicat pro re nata.

Pentru a evita sepsisul postoperator, a fost administrată Orizolin (Zydus Cadila), o doză de 30 mg/kg (ip). Fiecare șobolan a primit un mediu cald (37 ± 0,5 grade) pentru a preveni hipotermia postoperatorie. Fiecărui șobolan i s-a permis hrană semisolidă (în interiorul cuștii) și apă gratuită după intervenție chirurgicală timp de șapte zile și a fost adăpostit discret într-o cușcă distinctă (30 × 23 × 14 cm3).

2.4. Protocolul experimental. DSM a fost injectat în doze de 50și 100 mg/kg per greutate corporală (pc) la șobolani pe cale intraperitoneală (ip) folosind vehicul dimetilsulfoxid 0,5% în soluție salină normală (volum doză 5 ml/kg) [17].

Animalele au fost alocate aleatoriu în 5 grupuri într-un mod single-blind (n � 5): (i) simulare (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 și (v) QA + DNP. Șobolanii au fost supuși administrării intracerebroventriculare de QA (QA-ICV) sau unei intervenții chirurgicale simulate în prima zi.

DSM a fost administrat timp de 21 de zile consecutive zilnic, la 120 de minute după QA-ICV, începând cu ziua. Donepezil (DNP) a fost folosit ca medicament standard în acest studiu și a fost injectat (doză 3 mg/kg, ip) la șobolani injectați cu QAICV timp de 21 de zile succesive.

Animalelor din grupurile de control simulat și QA li sa administrat vehicul (dimetilsulfoxid 0,5% steril în soluție salină normală în doză-volum de 5 ml/kg) din ziua 1 până în ziua 21. întregul studiu a fost efectuat conform schemei descrise în Figura 1.2.5. Activitatea locomotorie.

În toate grupurile de șobolani, activitatea locomotorie medie a fost documentată folosind un dispozitiv actofotometru timp de 5 minute. Un animal separat a fost poziționat în actofotometru pentru 3 minute de aclimatizare. Apoi șobolanilor li s-au dat 5 minute, iar rezultatele au fost exprimate ca numărătoare la 5 minute [11].2.6. Testul Rotarod.

In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 de secunde la tija care se rotește la nouă rotații pe minut (rpm).

După încercările de achiziție, un șobolan separat a fost poziționat pe arborele cilindric, iar viteza de rotație a fost mărită la o pauză constantă de 10 secunde de la 6 rpm (viteza preliminară) la 30 rpm (viteza finală), pe o perioadă de peste 50 de secunde. .e latența medie de cădere (în secunde) de la arborele cilindric rotativ a fost precizată în rezultate.2.7.

Analiza amprentei. Principiul din spatele efectuării analizei amprentei la șobolani este evaluarea anomaliilor de mers.

Pentru amprente, picioarele de șobolan au fost scufundate în patru coloranți alimentari netoxici de diferite culori și au fost permise să ruleze pe o pasarelă înclinată (70 cm × 10 cm × 8 cm). Baza pistei a fost închisă cu o foaie de celuloză de culoare albă. .Șobolanii au fost motivați să treacă pe o secțiune slabă în sus, la capătul pistei, pentru a obține urme clare. Vopseaua a fost îndepărtată ușor de pe fiecare animal folosind apă călduță după încercări. Amprentele au fost scanate, iar „lungimea pasului” a fost măsurată folosind o riglă standard. Lungimea pasului a fost cuantificată prin calcularea distanței dintre plasările secvențiale ale labei identice de șobolan [11].

2.8. Sarcină nouă de recunoaștere a obiectelor (NORT). Protocolul standard a fost urmat așa cum este dat de Kumar și Bansal [23].

ORT este un arhetip exteroceptiv neprofitabil și neostil, folosit pentru a evalua tipul de lucru memoria rememorativă exploatată prin sondarea impulsivă a rozătoarelor. .Investigația se efectuează într-un vas cuboidal din placaj deschis pe acoperiș (80 cm × 42 cm × 62 cm), poziționat într-o zonă liniștită, iluminat de un LED de 60 W pentru a gestiona luminozitatea constantă în vas.

Elementele din lemn în formă de cilindru (alb), piramidă (roșu) și cub (negru) (înălțime de 12 cm) (în triplete identice) erau solide și suficient de greu pentru a le face imobilizate de rozătoare. NORT a fost efectuat în a 16-a zi în 3 etape (S): aclimatizare (S1), achiziție (S2) și etapa de examinare (reținere) a recunoașterii obiectului nou (S3).

În timpul S1, cu trei zile succesive înainte de testele au fost emise pentru a descoperi baza de podea liberă a vasului (5 minute) de către șobolani. După finalizarea lui S1, animalul individual a fost obișnuit cu orice set de elemente solide în etapa de învățare (S2).

Lucrurile asemănătoare gemenelor au fost poziționate în 2 unghiuri opuse alese arbitrar ale vasului (depărtare de 9 cm până la 11 cm de la meterezele laterale). Separat, o rozătoare a fost poziționată în centrul vasului, vizavi de cele două elemente solide și i s-a permis să descopere cele două articole similare timp de 5 minute. Ghidarea botului în apropierea obiectului la o distanță mai mică sau egală cu 2-3 cm sau contactul fizic cu obiectul cu botul a fost considerată o conduită investigativă.

După S2, rozătoarea a fost găzduită într-o cușcă de casă, susținută de o adâncime intertrial (ITR) de 60 de minute.

Orice element solid oferit în S2 a fost schimbat cu un element solid diferit, iar rozătoarele au fost prezentate din nou articolelor gemene, adică o replică a articolului cunoscut și a articolului diferit... întregul amalgamare și pozițiile articolelor au fost compensate la atenuează prejudecățile probabile instigate de o înclinație pentru anumite setări sau elemente. Vasul și obiectele solide au fost șterse cu meticulozitate (alcool etilic 15% și cârpă uscată) după fiecare investigație pentru a reduce semnele mirositoare. Perioada petrecută pentru descoperirea fiecărui element din S2 și S3 a fost documentată folosind un cronometru. .e durata cheltuită investigând cele două elemente care se potrivesc în S2 (I1 � Ii1 + Ii2) și durata cheltuită investigând cele două elemente diferite, adică cunoscuți și diferiți, în S3 (I2 � Ii3 + Ib) a fost înregistrată. O variație a duratei cheltuite pentru investigarea articolului diferit și a duratei de investigare a articolului cunoscut (Ib–Ii3 � DI) dezvăluie păstrarea memoriei colective.

DI (indicele de discriminare)/S3 durata (duratele) de investigare atât a articolului cunoscut, cât și a noului (DI modificat) îmbunătățește parțialitatea prin variații în investigația completă și denotă înclinația pentru diferiți itemi în contrast cu cele cunoscute {DI � (Ib–Ii3) )/(Ii3 + Ib)}. Memoria colectivă a fost evaluată prin cuantificarea abilității rozătoarelor de a evidenția familiarele/romanele din S3 și a fost declarată ca DI (modificată pentru perioada de investigație generală în S3) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). A fost urmat protocolul standard, dat de Kumar și Bansal [25]. MWM judecă memoria spațială prin încercări de înot, în care rozătoarea găsește o cale de evadare către un podium ascuns.

Un rezervor circular de culoare neagră (2 m diametru, 0,6 m înălțime) avea apă (25 ± 1 grad ) umplută la o adâncime de 0,3 m. Rezervorul acvatic a fost separat în sensul acelor de ceasornic în 4 regiuni similare (R1, R2, R3 și R4) folosind două fibre de nailon, fixate perpendicular pe perimetrul superior al rezervorului.

O estradă (10,5 cm × 10,5 cm) a fost poziționată sub apă (1 cm sub apă) în regiunea rezervorului R4. Punctul stratului a rămas intact pe toată perioada achiziției.

Fiecare șobolan a fost prezentat cu patru runde de achiziție în serie (5 minute ITR) în fiecare zi. Rozatoarea a fost eliberata usor in rezervorul acvatic din fata peretelui rezervorului, cu locatia variind cu fiecare incercare de la R1-R4, R2-R1, R3-R2 si R{{ 7}}R3 în zilele 1 până la 4, respectiv, și i sa permis 120 de secunde pentru a detecta podiumul subacvatic. Rozătoarele au continuat să se odihnească pe podium timp de 20 de secunde.

Eșecul de a detecta platforma în 120 de secunde a indicat plasarea manuală a șobolanilor pe platformă și apoi li sa permis 20 de secunde pe platformă. Timpul de latență de evacuare (ELT) este durata (e) de descoperire a stratului ascuns în rezervorul acvatic.

Învățarea spațială a fost marcată de ELT ziua unu față de ziua a patra. În proba cu sondă (a 5-a zi), rozătoarele au investigat rezervorul timp de 120 de secunde, dar au fost private de podium. .a fost înregistrată durata medie cheltuită în întregul rezervor (4 regiuni). Durata medie cheltuită în R4 (TSTQ: timp petrecut în cadranul țintă) sondarea pentru podiumul ascuns a fost considerată ca un indice al memoriei de referință. .setarea comparativă a rezervorului în raport cu articolele din laborator care acționează ca semne vizuale și poziția investigatorului a rămas netulburată [26].

2.10. Estimarea parametrilor biochimici. După finalizarea examinărilor comportamentale, creierul complet al șobolanilor a fost colectat și poziționat pe cuburi de gheață pulverizată, urmat de o baie cu soluție salină sterilizată înghețată (izotonic 308 mOsmol/l NaCl) pentru a îndepărta resturile și sângele.

Omogenizarea întregului creier a fost realizată instantaneu într-un tampon de separare prin congelare (pH 7,4) cu compoziția 215 mM D-manitol, 20 mM 2-[{4-({2-hidroxietil). acid )piperazin-1-il]etansulfonic, 1 mM 1,2-bis[2-[bis(carboximetil)amino]etoxi]etan, zaharoză 75 mM și BSA 0,1%. Omogenatul a fost centrifugat la 4 grade folosind o forță de 13000 × g timp de 5 minute. Peleta a fost respinsă, iar supernatantul a fost separat în două porțiuni și a fost recentrifugat (4 grade) la o forță de 13000 x g timp de 5 minute. Peletul mitocondrial brut a fost separat și centrifugat din nou într-un tampon de separare cu 1,2-bis[{2-[bis(carboximetil)amino]etoxi]etan la 12.500 × g timp de 11 minute (4 grade). Depozitul semisolid astfel obținut, cuprinzând mitocondrii necontaminate, a fost resuspendat într-un tampon de aseparare (pH 7,4) care conține zaharoză 75 mM, 2-[4-({2-hidroxietil)piperazin-1- 20 mM-1- acid il]etansulfonic și 215 mM D-manitol [27].

Ulterior, fracția mitocondrială a omogenatului creierului întreg a fost utilizată pentru determinarea markerilor biochimici folosind metode standard.2.11. Estimarea complexului mitocondrial.

2.11.1. NADH: Activitatea oxidoreductazei ubichinone. Gradul de activitate al complexului I (NADH dehidrogenază) a fost cuantificat (nmol NADH oxidat/minut/mg proteină) urmând tehnica lui King și Howard [28]. .generarea eoxidativă de NAD+ din NADH este însoțită de reducerea citocromului c. Amestecul de analiză a constat din citocrom c (1{10}},5 mM), 6 mM -nicotinamidă adenindinucleotidă (DPNH) dizolvată folosind tampon diglicină 2 mM şi tampon diglicină (0,2 M, pH 8,5).

O fracție mitocondrială dizolvabilă a fost încorporată în amestecul de analiză pentru a declanșa reacția. Variația densității optice (OD) la λmax � 550 nm a fost urmărită timp de 120 de secunde.

2.11.2. Succinat: Activitatea oxidoreductazei ubichinone.. rata activității succinat dehidrogenazei (complexul II) a fost cuantificată (nmol succinat oxidat/minut/mg proteină) urmând tehnica lui King [29].

Oxidarea acidului succinic este declanșată de un receptor de electroni simulat, cianoferatul de potasiu (K3Fe(CN)6). Amestecul de analiză constă din acid succinic (0,63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6 (0.{036 M) și Na+-K+ tampon [PO4]2- (0,23 M, pH 7,6). O fracție mitocondrială dizolvabilă a fost încorporată în amestecul de analiză pentru a declanșa reacția. .e variația DO la λmax � 420 nm a fost urmărită timp de 120 de secunde.2.12. Determinarea biomarkerilor de stres oxidativ2.12.1. Substanțe reactive cu acid iobarbituric (TBARS).

Pentru a evalua TBARS (nmol per mg proteină) [30], combinația de analiză (cantitate finală ∼4 ml) cuprinzând0,1{0 ml creier omogenizat, 1,51 ml 4,{{ 7}}dihidroxi-2-mercaptopirimidină (0,8%), 200 µl SLS (8,18%), 1,49 ml acid glacialacetic (21%, pH 3,51) și 0,71 ml apă deionizată au fost supuse încălzirii în baie de apă la 96 de grade pentru 60 de minute.

Un raport de 15:1 alcool butilic/azabenzen (5,1 ml) a fost suplimentat într-un amestec de analiză care a fost centrifugat la 4,000 x gputere (10 minute), iar supernatantul a fost izolat.

Cu un spectrofotometru UV1700 cu fascicul dublu (Shimadzu, Japonia), cromofor malondialdehida-4,6-dihidroxi-2-mercaptopirimidină OD a fost evaluată la o lungime de undă (λmax � 532 nm) și ε � 1,56 × 105/M/cm (coeficientul de extincție molar) a fost aplicat pentru a calcula 4 aducti de 6-dihidroxi-2-mercaptopirimidină.

2.12.2. Niveluri reduse de glutation (Lc-glutamil-L-cisteinil-glicină). Procedura lui Ellman [31] a fost implementată pentru a evalua conținutul de L-glutation (GSH). Preparatul de testat care cuprinde omogenat (1,1 ml) și 1 ml de acid 2-hidroxi{-5-sulfobenzoic 4% (5-SSA) a fost centrifugat (4 grade) timp de 11 minute la o putere de 2.500 × g .

Mai târziu, 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- tampon (51,2 mM, pH 7,77) și {{10}},21 ml 3-carboxi{{13 }}Disulfură de nitrofenil (0,12 mM, pH 7,89) au fost amestecate cu supernatantul separat mai sus (0,12 ml).

Tripeptida (µmolGSH per mg proteină) a fost cuantificată cu spectrofotometrul UV1700 cu fascicul dublu (λmax � 412 nm). aplicând � 1,36 ×104/M/cm.2.12.3.

Activitatea glutationului peroxidazei. Activitatea glutation peroxidazei (GPx) (EC 1.11.1.9) a fost evaluată prin implementarea tehnicii lui Mohandas et al. [32]. .eanalyze amestec format din 100 µl de 10% omogenat, 100 µl azidă de sodiu (1,11 mM), 100 µl EDTA (1,13 mM), 40 µl glutation-disulfur reductază (GSR, 1 UI/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamil-L-cisteinil-glicină (1,2 mM), 100 µl sare tetrasodica redusă cu coenzima II (0,22 mM ), și 0,12 M 1,49 ml Na+-K+ [PO4]{2-tampon (pH 7,4) într-o cantitate întreagă de 2000 ul. Pierderea de tetrasodiu redus cu coenzima II la λmax � 340 nm a fost documentată la o temperatură de 25 de grade. Rata GPx a fost calculată ca nmol NADPH oxidat/minut/mg proteină folosind ε� de 6,22 × 103/M/cm.

For more information:1950477648nn@gmail.com