Metforminul atenuează afectarea neurocognitivă în îmbătrânire prin activarea căii AMK/BDNF/PI3K PARTEA 1

Încetinirea tulburărilor neurocognitive legate de vârstă a fost o provocare. Am evaluat efectele terapeutice ale metforminei în îmbătrânirea indusă de d-galactoză. În plus, am studiat mecanismele moleculare potențiale care ar putea fi responsabile pentru efectele anti-îmbătrânire ale metforminei. Treizeci de șobolani masculi au fost împărțiți în mod egal în 1-grup martor, care a primit o soluție salină, 2-d-galactoză (D-gal) grup, care a primit d-galactoză (100 mg/kg/zi) prin lavaj gastric timp de opt săptămâni, şi grupul tratat cu 3-d-galactoză plus metformină (D-gal plus Met), care a primit d-galactoză plus metformină (200 mg/kg/zi) prin lavaj gastric timp de opt săptămâni. S-a făcut o evaluare neurocognitivă. S-a efectuat măsurarea biomarkerilor inflamatori, stresului oxidativ și BDNF. Au fost evaluate expresia genelor AMPK și PI3K. Țesuturile hipocampale au fost disecate pentru studii histopatologice și imunohistochimice. D-gal a dus la tulburări neurocognitive, creșterea biomarkerilor inflamatori, markeri alterați de stres oxidativ, BDNF scăzut și expresie scăzută a sinaptofizinei și Bcl2 cu exprimarea crescută a caspazei-3 și reglarea în jos a genelor AMPK și PI3K. Modificările neurodegenerative au fost prezente în hipocamp. Metformina a restabilit semnificativ modificările neurodegenerative induse de D-gal. Am ajuns la concluzia că metformina ar putea atenua deficitul neurocognitiv indus de vârstă prin ameliorarea neuroinflamației, atenuarea stresului oxidativ, reducerea apoptozei, precum și promovarea plasticității sinaptice. Aceste mecanisme ar putea fi mediate prin activarea căii AMPK/BDNF/PI3K.

Glicozidul cistanchei poate crește, de asemenea, activitatea SOD în țesuturile inimii și hepatice și poate reduce semnificativ conținutul de lipofuscină și MDA din fiecare țesut, eliminând eficient diferiți radicali reactivi de oxigen (OH-, H₂O₂ etc.) și protejând împotriva daunelor cauzate de ADN. prin radicalii OH. Glicozidele feniletanoide Cistanche au o capacitate puternică de captare a radicalilor liberi, o capacitate de reducere mai mare decât vitamina C, îmbunătățește activitatea SOD în suspensia de spermă, reduc conținutul de MDA și au un anumit efect protector asupra funcției membranei spermatozoizilor. Polizaharidele Cistanche pot spori activitatea SOD și GSH-Px în eritrocite și țesuturi pulmonare ale șoarecilor senescenți experimental cauzate de D-galactoză, precum și pot reduce conținutul de MDA și colagen în plămâni și plasmă și pot crește conținutul de elastină, au un bun efect de curățare asupra DPPH, prelungește timpul de hipoxie la șoarecii senescenți, îmbunătățește activitatea SOD în ser și întârzie degenerarea fiziologică a plămânilor la șoarecii senescenți experimental. Cu degenerarea morfologică celulară, experimentele au arătat că Cistanche are o bună capacitate antioxidantă. și are potențialul de a fi un medicament pentru prevenirea și tratarea bolilor de îmbătrânire a pielii. În același timp, echinacozidul din Cistanche are o capacitate semnificativă de a elimina radicalii liberi DPPH și poate elimina speciile reactive de oxigen, poate preveni degradarea colagenului indusă de radicalii liberi și, de asemenea, are un efect bun de reparare asupra daunelor anionice a radicalilor liberi de timină.

Faceți clic pe Cistanche în Urdu despre ANTI ÎMBĂtrânire

【Pentru mai multe informații: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Abrevieri

D-gal d-galactoză

ROS Specii reactive de oxigen

IL-1 Interleukin-1

IL-1 Interleukin-1

IL-6 Interleukin-6

IL-10 Interleukina-10

TNF- factor de necroză tumorală

BDNF Factorul neurotrofic derivat din creier

AMPK protein kinaza activată de AMP

PI3K/Akt Phosphatidylinozitol 3-kinaza/protein kinaza B

RT-PCR Reacția în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă

EPM Elevated plus labirint

Latența transferului TL

MDA Malondialdehida

SOD Superoxid dismutaza

MPTP Permeabilitatea mitocondrială por de tranziție

H&E Hematoxilină și eozină

iNOS Sintaza de oxid nitric inductibil

NF-kB Factorul nuclear-kB

LTP Potentare pe termen lung

Pierderea constantă a funcției fiziologice, a agilității mentale și a memoriei care apare odată cu îmbătrânirea este un proces cu mai multe fațete care poate fi declanșat de moartea celulelor neuronale1. Speranța de viață în multe țări este proiectată să depășească 85 de ani până în 20302. Din cauza scăderii calității vieții pentru persoanele în vârstă și a cheltuielilor economice și personale asociate, tulburările cognitive legate de îmbătrânire au apărut ca o problemă socială semnificativă. În plus, îmbătrânirea creierului este cauza principală a dezvoltării bolilor neurodegenerative care progresează frecvent ireversibil3. Există puține sau deloc tratamente eficiente disponibile în prezent pentru tulburările neurocognitive legate de îmbătrânire4.

d-galactoza (D-gal), o monozaharidă abundentă în produsele lactate, este în mod normal transformată în glucoză de către enzime. Cu toate acestea, administrarea sistemică pe termen lung de D-gal poate prezenta pericole substanțiale pentru sănătate5. Cercetările anterioare au sugerat că livrarea sistemică persistentă de D-gal la șobolani i-ar putea transforma în modele de îmbătrânire și tulburări neurodegenerative legate de vârstă6. Modelul de îmbătrânire D-gal are mai multe avantaje față de modelul natural de îmbătrânire, inclusiv capacitatea de a se concentra exclusiv asupra procesului de îmbătrânire. În modelul de îmbătrânire naturală, comorbiditățile, inclusiv diabetul și hipertensiunea arterială, sunt variabile complicate7.

Se crede că D-gal generează anomalii biochimice similare cu cele observate în creierul uman îmbătrânit, cum ar fi activitatea redusă a enzimelor antioxidante și atenuarea neuronilor colinergici. Produsele finale de glicație avansată, care sunt legate atât de îmbătrânirea normală, cât și de patofiziologia multor boli, sunt produse prin interacțiunea D-gal cu grupările amino proteine. Animalele furnizate de D-gal au cauzat neuroinflamație, leziuni mitocondriale și daune oxidative din dezvoltarea speciilor reactive de oxigen (ROS), împreună cu probleme de obișnuire cu noutăți, deficiențe în învățarea spațială și funcții cognitive8.

Inflamația ar putea fi un factor cheie în deteriorarea cognitivă în rândul vârstnicilor. Nivelurile ridicate de interleukină-6, IL{-1, factor de necroză tumorală și proteină C reactivă au fost legate de un risc crescut de morbiditate și mortalitate la vârstnici9. Tratamentul cronic cu d-galactoză la șobolani a indus activarea căilor de semnalizare apoptotică neuronală și neuroinflamație în cortexul cerebral și hipocamp1.

Îmbătrânirea are ca rezultat o scădere a factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF), care este o proteină crucială implicată în schimbările plastice asociate cu învățarea și memoria, precum și un mediator vital pentru proliferarea și integritatea neuronilor10.

Descoperirea unor noi compuși care întârzie îmbătrânirea și susțin performanța cognitivă a devenit una dintre cele mai mari provocări. Metformina pătrunde rapid în bariera hemato-encefalică și se acumulează în mai multe zone ale creierului, inclusiv în glanda pituitară și hipocamp11. S-a demonstrat că administrarea de metformină pe termen lung reduce apariția complicațiilor patologice legate de vârstă și prelungește longevitatea la om12. În plus, s-a demonstrat că metforminul îmbunătățește tulburările cognitive și tulburările de comportament, cum ar fi anxietatea, atât la persoanele diabetice, cât și la persoanele nediabetice13,14 și la pacienții cu boli neurodegenerative15. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza efectelor metforminei în îmbunătățirea deteriorării neurocognitive legate de vârstă sunt complicate și totuși nu sunt în întregime înțelese.

Efectele neuroprotectoare ale metforminei pot fi atribuite în primul rând activării căii de semnalizare a proteinei kinazei activate de AMP (AMPK)11. Activarea AMPK reglează expresia BDNF, care are un rol critic în transmiterea sinaptică și consolidarea memoriei10. În plus față de această proprietate bine stabilită a activării AMPK, rezultatele anterioare au demonstrat că metformina poate îmbunătăți memoria prin restabilirea stresului oxidativ, scăderea neuroinflamației și inhibarea apoptozei, ceea ce își poate extinde indicațiile clinice în zona tulburărilor neurodegenerative14. Metforminul este un activator puternic al căii fosfatidilinozitol 3-kinazei/protein kinazei B (PI3K/Akt), care este o cale de semnalizare critică importantă în inhibarea apoptozei și promovarea supraviețuirii celulare16.

Luând în considerare beneficiile metforminei, care includ siguranța, accesibilitatea și capacitatea de utilizare; am studiat efectele neuroprotectoare ale administrării metforminei împotriva deteriorării neurocognitive cauzate de îmbătrânirea indusă de d-galactoză la șobolani. În plus, au fost investigate mecanismele moleculare care stau la baza acestor efecte de protecție.

Materiale și metode

Animale.În experiment au fost utilizați șobolani masculi albinoși Tirty Wister cu o greutate de 200–250 de grame după obținerea aprobărilor necesare de la Comitetul de etică a cercetării din cadrul Facultății de Medicină, Universitatea Menoufa, Egipt (înregistrare nr. 10/2022 PHYS 9). Procedurile experimentale au urmat ghidurile ARRIVE. Șobolanii au fost găzduiți în cuști din plasă de sârmă (80 x 40 x 30 cm). Tuturor animalelor li sa oferit acces deplin la hrană și apă în timpul perioadei de studiu, după ce le-au condiționat timp de 2 săptămâni în condiții de mediu constante și un ciclu de lumină/întuneric de 12:12-h.

Design experimental.Animalele au fost împărțite aleatoriu în trei grupuri (10/grup):

1. Grupul de control: Soluție salină primită prin gavaj oral.

2. Grupa d-galactoză (D-gal): d-galactoză primită (Sigma-Aldrich St. Louis, SUA) dizolvată într-o soluție salină într-o doză de 100 mg/kg greutate corporală prin lavaj gastric timp de opt săptămâni consecutive17

3. Grupul tratat cu d-galactoză plus metformin (D-gal plus Met): a primit d-galactoză (cu aceeași doză în grupul D-gal) plus metformină (Sigma-Aldrich St. Louis, SUA) dizolvată într-o soluție salină în doză de 200 mg/kg/zi prin lavaj gastric timp de opt săptămâni consecutive16

După încheierea celor opt săptămâni, a fost efectuată o evaluare neurocomportamentală a tuturor șobolanilor. După aceea, șobolanii au fost anesteziați și sacrificați prin alungirea colului uterin și dislocarea. Creierul a fost extras și spălat cu soluție salină tampon fosfat (pH 7,4). Emisfera stângă a fost cântărită și împărțită în două jumătăți; una dintre ele a fost folosită pentru analize biochimice, iar cealaltă jumătate a fost folosită pentru studii RT-PCR. Emisfera dreaptă a fost fixată într-o soluție salină de formol 10% pentru evaluarea histopatologică și imunohistochimică a țesuturilor hipocampului.

Teste neurocomportamentale.Recunoașterea obiectelor inedite. Noul test de recunoaștere a obiectelor a fost folosit pentru a evalua capacitatea șobolanilor de a recunoaște un obiect nou într-un cadru familiar. Fiecare șobolan a avut trei zile de testare, care au inclus trei faze: obișnuire, antrenament și testare. Șobolanii au fost plasați într-un aparat în câmp deschis (50 cm × 50 cm × 40 cm) în timpul fazei de obișnuire și li s-au acordat zece minute pentru adaptare fără niciun obiect. Fiecare șobolan a fost ținut într-o cameră cu două obiecte identice timp de cinci minute în timpul fazei de antrenament. După douăzeci și patru de ore, fiecare șobolan a fost plasat în cameră timp de cinci minute în timpul fazei de testare, care a implicat înlocuirea unuia dintre obiectele vechi cu unul nou. Cronometrul a fost folosit pentru a cronometra durata explorării obiectelor. Indicele de discriminare [=(timpul de explorare a obiectelor noi – timpul de explorare a obiectului familial)/timpul total de explorare×100 la sută ] este utilizat pentru a evalua performanța cognitivă a șobolanilor. Alcoolul a fost folosit pentru a curăța câmpul deschis și obiectele dintre șobolani18.

Labirintul de apă Morris. Labirintul de apă Morris a fost folosit pentru a examina impactul metforminei asupra învățării și memoriei spațiale. O piscină era realizată din oțel inoxidabil, avea un diametru de 210 cm și o înălțime de 50 cm incluzând o platformă de evacuare scufundată la 1 cm sub suprafața apei. Apa a fost menținută la 24±1 grade. Sarcina de achiziție a fost testată pe parcursul a cinci zile de testare cu patru încercări în fiecare zi. Timpul necesar pentru a ajunge la platforma secretă în timpul fiecărei încercări a fost înregistrat ca latență de evadare. Maximum 60 de secunde au fost date șobolanilor pentru a localiza platforma ascunsă. A fost atribuită o limită de timp maximă de 60 s, iar șobolanul a fost ghidat manual către platforma ascunsă. Un singur studiu cu sondă a fost efectuat la 24 de ore după ultimul studiu din a cincea zi. Platforma a fost îndepărtată și șobolanul a fost plasat în bazin din cadranul opus cadranului de antrenament. Apoi, șobolanul a fost lăsat să înoate liber timp de 60 de secunde. Timpul petrecut în cadranul țintă a fost înregistrat19.

Testul labirint plus ridicat (EPM). EPM este o tehnică consacrată pentru evaluarea comportamentului asemănător anxietății la șobolani. Era din lemn și era format din brațe deschise și închise (50 cm lungime×10 cm lățime). Cele două brațe închise erau închise de pereți înalți de 40 cm. Brațele erau atașate de o platformă pătrată centrală (10×10 cm). Aparatul era la 50 cm deasupra podelei. Fiecare șobolan a fost plasat în centrul aparatului cu fața la un braț închis și lăsat să se miște liber timp de cinci minute. A fost înregistrat timpul petrecut în brațele deschise și închise. De asemenea, intrările cu brațele deschise au fost înregistrate în 20. Măsurăm și Latența de transfer (TL) care este folosită pentru a evalua memoria și învățarea. În prima zi (sesiunea de achiziție), fiecare șobolan a fost expus la EPM timp de 90 de secunde. Timpul necesar șobolanului pentru a ajunge la brațul închis a fost înregistrat ca TL. Șobolanii care nu au reușit să intre în brațe închise în 90 de secunde au fost excluși din studiu. În a doua zi (sesiunea de retenție), fiecare șobolan a fost pus în brațul deschis și TL a fost înregistrat pentru maximum 90 s21.

Analiza biochimică.Țesutul cerebral a fost perfuzat cu soluție de PBS, apoi omogenizat într-un tampon rece de 5 ml per gram de țesut. Centrifugarea țesutului cerebral s-a făcut la 4000 rpm timp de 15 minute, apoi supernatantul a fost îndepărtat și depozitat la -80 de grade până la măsurătorile Malondialdehidei (MDA) și Superoxid Dismutază (SOD) prin utilizarea colorimetrică convențională (QuantiChrom™, BioAssay Systems, SUA), factorul seric de necroză tumorală (TNF- ), interleukina 10 (IL-10) și factorul neurotropic derivat din creier (BDNF) prin utilizarea trusei ELISA (Quantikine, compania Abcam, Cambridge, Marea Britanie), conform instrucțiunilor producătorului. instrucțiuni.

Analiza cantitativă a expresiei genelor AMPK și PI3K utilizând tehnica de reacție în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă (RT-PCR).Țesuturile cerebrale au fost pregătite pentru izolarea totală a ARN-ului utilizând kit-ul universal Qiagen RN Easy plus din SUA. Apoi, calitatea și puritatea ARN au fost asigurate. ARN-ul a fost stocat la - 80 grade până la utilizare. Apoi, primul pas a fost sinteza cADN-ului folosind Kitul de transcripție inversă QuantiTect, Qiagen din SUA, folosind termociclorul Applied Biosystems 2720 (Singapore) pentru un singur ciclu. Primerii GAPDH au fost utilizați în reacțiile RT-PCR ca control al încărcării ARN. Al doilea pas a fost amplificarea cADN-ului: cADN-ul a fost utilizat în PCR cantitativ în timp real pe bază de verde SYBR pentru cuantificarea relativă (RQ) a expresiei genelor AMPK și PI3K de SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, SUA, folosind următorii primeri proiectați (Midland, Texas ): Primerul direct pentru AMPK a fost (TGCGGTTACGAAGGAAGAATCC). Și primerul invers a fost (TGTGACTTCCAGGTCGGAGTT). Primerul direct pentru PI3K a fost (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA), iar primerul invers a fost (GAAACTTTTTCCCACCACGA). În cele din urmă, a fost efectuată analiza datelor cu software-ul Applied Biosystems 7500 versiunea 2.0.1. RQ-ul expresiei genelor AMPK și PI3K a fost realizat folosind o metodă comparativă ∆∆Ct, în care cantitatea de ARNm a genelor țintă (AMPK și PI3K) este normalizată la o genă de referință endogenă (GAPDH) și relativ la un control.

Evaluarea histopatologică a țesutului cerebral.Examen histologic. Țesutul cerebral a fost fixat într-o soluție de formol 10%, încorporat în parafină și s-au obținut secțiuni coronale în serie de 5 μm grosime. Secțiuni ale hipocampului creierului au fost apoi colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) pentru examinare cu un microscop cu lumină.

Colorarea imunohistochimică a hipocampului. Colorația imunohistochimică a caspazei-3 (număr CAT: ab32351, compania Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, SUA) și sinaptofizina (număr CAT: ab32127, compania Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, SUA) au fost efectuate utilizând iepure Anticorpi monoclonali. Pentru Bcl-2 (număr CAT: ab59348, compania Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, SUA), a avut loc prin utilizarea anticorpilor policlonali de iepure. Au fost primite într-o singură fiolă care conține 1 ml de anticorp. Anti-caspaza-3, anti-sinaptofizina și anti-Bcl-2 au fost utilizate în cantități diluate 1:50, 1:400 și, respectiv, 1:100. Secțiunile au fost tăiate la 5 um și colorate cu un imunocolorant automat LINK 48 (Dako, Agilent Technologies Inc, Santa Clara, SUA). Pentru recuperarea căldurii, tamponul citrat a fost folosit de imunocolorant. Lamele au fost colorate automat cu anticorpi primari diluați. Controlul pozitiv al reacției a fost efectuat folosind secțiuni specifice încorporate în parafină ale amigdalei umane normale, pancreasului uman și adenomului folicular pentru caspază-3, sinaptofizina și, respectiv, Bcl-2. S-au făcut controale negative prin înlocuirea anticorpilor primari cu ser non-imun.

Evaluarea histopatologiei și a markerilor imunohistochimici (caspază-3, sinaptofizina și Bcl{-2) a fost efectuată în diferite zone ale hipocampului, inclusiv CA1, CA2 și CA3.

Analize statistice.Rezultatele sunt exprimate ca medie ± Deviația standard (SD). Analiza variațiilor (ANOVA) a fost utilizată pentru analiza statistică a diferitelor grupuri, folosind software-ul Origin® și probabilitatea de șansă (valori p). valorile P<0.05 were considered significant.

Aprobarea etică și acordul de participare.Această lucrare a fost aprobată de și de către orientările Comitetului de etică al Facultății de Medicină, Universitatea Menoufa, Egipt.

Rezultate

Teste neurocomportamentale.În ceea ce privește testul obiect nou, procentul de indice de discriminare a fost semnificativ mai mic în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (-37,16±3,31% față de 30,16±2,92%, respectiv, P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

În ceea ce privește testul labirint Morris, valoarea medie a duratei latenței de evadare a fost semnificativ mai mare în prima, a doua, a treia, a patra și a cincea zi în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (58,16±1,94, 4{ {19}}.62±1,33, 32,75±1,10, 24,37±1,58 și 15,29±0,98 s față de 40,16±2,92, 25,16±1,15, 17,04±1,08, ±1,81,08,±1,0,08,±1,0,98 s 86 s, respectiv, P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

În testul labirint plus, valoarea medie a duratei petrecute de șobolani în brațele deschise a fost semnificativ mai mică în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (60±6,54 s vs. 90,83±3,48 s, respectiv). , P<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

Teste biochimice.Valoarea medie a nivelului de MDA din creier a fost semnificativ mai mare, în timp ce valoarea medie a nivelului de SOD din creier a fost semnificativ mai mică în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (70±3,23 nmol/mg proteină și 13,05±1.{{7). }} U/mg proteină vs 33,76±2,13 nmol/mg proteină și respectiv 29,11±4,34 U/mg proteină, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

Valoarea medie a nivelului de TNF-ul creierului a fost semnificativ mai mare, în timp ce valoarea medie a nivelului de IL-10 din creier a fost semnificativ mai mică în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (67,50 ± 10,03 pg/mg proteină și 72,91 ±8,45 pg/mg proteină față de 16,61 ±1,21 pg/mg proteină și respectiv 157,23 ±12,46 pg/mg proteină, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

Valoarea medie a nivelului de BDNF din creier a fost semnificativ mai mică în grupul D-gal în comparație cu grupul de control (125,72±4,17 pg/mg proteină vs. 225,20±5,52 pg/mg proteină, respectiv, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

RT-PCR cantitativă (qRT-PCR). Expresia genelor AMPK și PI3k (0.52±0.11 și, respectiv, 0.37±0.03, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) în comparație cu grupul de control (Fig. 6).

Histopatologie.Colorarea H&E a țesutului hipocampal din grupul de control a evidențiat modificări patologice neremarcabile. Grupul D-gal a arătat multă degenerare neuronală și corpuri apoptotice cu edem masiv și glioză. Cu toate acestea, secțiunile grupului D-gal plus Met au prezentat puține degenerări neuronale și puțini corpi apoptotici cu edem ușor și glioză focală ușoară (Fig. 7).

Imunohistochimie. Rezultatele imunohistochimice au arătat că valoarea scorului H a expresiei sinaptofizinei în țesutul hipocamp a fost semnificativ mai mică (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

Valoarea scorului H a expresiei caspazei-3 în țesutul hipocamp a fost semnificativ mai mare (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

Valoarea scorului H a expresiei Bcl-2 în țesutul hipocamp a fost semnificativ mai mică (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

Discuţie

Creșterea speranței medii de viață crește riscul de îmbolnăvire la vârstnici, în special în arena cognitivă, care ar putea fi, cel puțin parțial, din cauza pierderii neuronale din creier. Este bine acceptat faptul că injectarea pe termen lung cu d-galactoză contribuie la progresul îmbătrânirii și la leziuni neuronale ușoare și defecte de memorie. Având în vedere că îmbătrânirea indusă de D-gali, este însoțită de neurodegenerare, ar putea fi un model ideal pentru studierea mecanismelor moleculare implicate cu neurodegenerarea asociată vârstei și pentru testarea noilor abordări terapeutice22.

Studiul nostru a arătat că administrarea cronică de D-gal a afectat comportamentele exploratorii induse de noutate și memoria de lucru la șobolani. Acest lucru a fost evident în rezultatele noului obiect, labirintul de apă Morris și testele de labirint la nivel ridicat. Aceste rezultate au fost în concordanță cu alte studii raportate23. Pe de altă parte; tratamentul cu metformină a îmbunătățit memoria de lucru și preferința pentru noutate în comparație cu grupul D-gal. Susținând rezultatele noastre, un studiu anterior a raportat că metforminul a îmbunătățit memoria pe termen scurt la șoarecii diabetici induși de streptozotocină24. Este bine documentat faptul că îmbătrânirea este asociată nu numai cu o scădere a funcțiilor cognitive, ci și cu schimbări emoționale, inclusiv un comportament asemănător anxietății, care are ca rezultat deficiențe funcționale25. În studiul de față, rezultatele testului EPM au arătat un comportament de anxietate crescut în grupul D-gal în comparație cu grupul de control. În timp ce tratamentul cu metformină a atenuat un comportament asemănător anxietății.

Prezentul studiu a arătat că modificările neurocomportamentale cauzate de administrarea orală de D-gal au fost însoțite de tulburări ale markerilor de stres oxidativ din creier. Valoarea medie a nivelului de MDA în omogenatul de țesut cerebral a fost semnificativ mai mare, în timp ce activitatea enzimei antioxidante SOD a fost semnificativ mai mică în grupul D-gal în comparație cu grupul de control. Rezultate similare au fost raportate anterior23,26. D-gal interacționează cu diverse amine libere din arhitectura proteinei prin glicație non-enzimatică, rezultând în generarea de produse avansate de glicație. Acest lucru are ca rezultat generarea de ROS care crește îmbătrânirea creierului prin deteriorarea oxidativă a ADN-ului, lipidelor și proteinelor. Pierderea memoriei și afectarea învățării induse de administrarea cronică de D-gal ar putea fi atribuite generării de radicali liberi, ducând la afectarea neurogenezei și, în cele din urmă, la neurodegenerare27. În plus, neuronii creierului sunt mai susceptibili la stresul oxidativ datorită prezenței conținutului ridicat de lipide și a consumului mai mare de oxigen26.

Dimpotrivă, administrarea de metformină a restabilit semnificativ echilibrul redox. Dovezile au demonstrat că metforminul ar putea inhiba porul de tranziție al permeabilității mitocondriale (mPTP) și ar putea reduce producția de ROS și peroxidarea lipidelor28. Prin urmare, acest lucru indică faptul că efectul anti-îmbătrânire al metforminei ar putea fi mediat de apărarea sa antioxidantă.

Pe lângă stresul oxidativ, inflamația este, de asemenea, un mecanism important de inducere a îmbătrânirii în tratamentul cu D-gal. D-gal promovează generarea de ROS care activează căile inflamatorii3. Neuroinflamația cronică și secreția de citokine proinflamatorii sunt semne distinctive ale îmbătrânirii29. Există un acord că citokinele inflamatorii sunt implicate în stresul oxidativ. TNF-, IL-6 și IL{-1 sunt esențiale în dezvoltarea și progresia stresului oxidativ. Aceste citokine sunt asociate cu ROS și activează factorul nuclear-kB (NF-kB) pentru a se transloca în nucleu și pentru a regla expresia genelor proinflamatorii precum iNOS și COX2, care sunt implicate în răspunsurile inflamatorii și imune și, în consecință, conduc la fibroză, apoptoză și răspunsuri în fază acută care provoacă leziuni ale organelor30. Datele menționate mai sus au fost în concordanță cu rezultatele noastre, deoarece nivelul de TNF-alfa a fost semnificativ mai mare, iar IL-10 a fost semnificativ mai scăzut în grupul D-gal comparativ cu grupul de control.

Pe de altă parte, tratamentul cu metformină a dus la o reducere semnificativă a markerilor inflamatori în comparație cu grupul D-gal. Efectele antiinflamatorii ale metforminei ar putea fi atribuite activării semnalizării AMPK, care suprimă reacțiile inflamatorii prin inhibarea NF-κB29. De asemenea, a scăzut producția de citokine proinflamatorii și activarea microglială în creier, care, la rândul lor, scad stresul oxidativ30.

Pentru a înțelege în continuare mecanismele moleculare care stau la baza acțiunilor metforminei, am examinat expresiile proteice ale AMPK și PI3k. Studiul nostru a dezvăluit că expresia AMPK a fost semnificativ redusă în grupul D-gal în comparație cu grupul de control, în timp ce nivelul său a fost semnificativ crescut în grupul tratat cu metformină în comparație cu grupul D-gal. Studiile anterioare au raportat că activarea AMPK și capacitatea de răspuns la AMPK scad odată cu vârsta, ceea ce poate explica reglarea metabolică alterată, ducând la autofagie redusă și o creștere a stresului oxidativ31. S-a descoperit că metforminul activează AMPK prin creșterea fosforilării AMPK la Tr-17232. AMPK este ținta principală a metforminei pentru funcția sa de protecție împotriva tulburărilor cognitive. Ghadernezhad și colab. a raportat că activarea AMPK indusă de metformină a condus la activarea căii BDNF/P70S6K în neuronii hipocampali pentru a îmbunătăți formarea memoriei în sarcina de evitare pasivă într-un model global de șobolan de ischemie/reperfuzie cerebrală. Activarea BDNF are un rol vital în reglarea funcțiilor neurocognitive precum învățarea, memoria, transmiterea sinaptică și plasticitatea 33. Mai multe studii au demonstrat că AMPK ar putea acționa ca un modulator al potențialării pe termen lung (LTP) și este necesar pentru formarea memoriei34. . Prin urmare, îmbunătățirea memoriei indusă de metformină în studiul nostru ar putea fi mediată prin activarea semnalizării AMPK.

【Pentru mai multe informații: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】