MiR-214 ameliorează leziunea renală acută indusă de sepsis prin autofagie reglată de PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Abstract. Studiile anterioare au sugerat că stresul oxidativ și autofagia au ca rezultat acutleziuni renale (AKI) în timpul sepsisului și microARN (miR)-214 joacă un rol vital în protecțiarinichisupuse stresului oxidativ. Prezentul studiu și-a propus să testeze dacă renoprotecția miR-214 este legată de autofagia în sepsis. Rolul autofagiei a fost investigat într-un model de șoarece de ligatură și puncție cecală (CLP). Reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă (RT-qPCR) a fost utilizată pentru a analiza expresia miR-214. Structura și funcțiarinichirecoltați de la șoareci au fost evaluați.Rinichinivelurile de autofagie au fost detectate prin imunohistochimic, imunofluorescent și western blot. S-a descoperit că miR-214 ar putea atenua AKI la șoarecii septici prin inhibarea nivelului derinichiautofagie. În plus, miR-214 a inhibat autofagia prin reducerea la tăcere a expresiei PTEN înrinichițesuturi ale șoarecilor septici. Aceste descoperiri au indicat că miR-214 a ameliorat AKI indusă de CLP prin reducerea stresului oxidativ și inhibarea autofagiei prin reglarea căii PTEN/AKT/mTOR.
Cuvinte cheie:microARN-214, sepsis, leziune renală acută, autofagie, renală
Introducere Acutleziuni renale(AKI) este una dintre cele mai frecvente complicații ale sepsisului și apare la 40-50% dintre pacienții septici, cu o rată a mortalității de până la 60% (1). Cu toate acestea, patogeneza AKI indusă de sepsis rămâne neclară. S-a raportat că autofagia joacă un rol cheie în AKI indusă de sepsis, iar inhibarea autofagiei are ca rezultat dezvoltarea AKI în timpul sepsisului (2,3). Studiile anterioare (4,5) au confirmat că sepsisul declanșează autofagia în mai multe organe, inclusiv înrinichi(6) și procesele autofagice sunt implicate în îndepărtarea mitocondriilor deteriorate și a stresului oxidativ (7). Cu toate acestea, autofagia excesivă poate provoca moarte celulară nedorită și dăunătoare (8). Prin urmare, un nivel moderat de autofagie este cheia pentru reducerea AKI indusă de sepsis. Studiile anterioare au raportat că miR-214 ameliorează AKI indusă de ischemie-reperfuzie prin inhibarea apoptozei (9), iar miR-214 suprimă stresul oxidativ în nefropatia diabetică prin calea de semnalizare a speciilor reactive de oxigen (ROS)/AKT/mTOR (10). Prezentul studiu a constatat că miR-214 poate atenua disfuncția miocardică indusă de sepsis la șoareci prin inhibarea autofagiei (11). Cu toate acestea, rămâne de elucidat dacă miR-214 poate ameliora AKI indusă de sepsis. În studiul de față, sa emis ipoteza că miR-214 atenuează AKI indusă de CLP prin reducerea stresului oxidativ și inhibarea autofagiei prin reglarea căii PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR
Materiale și metode
animale.Un total de 100 de șoareci masculi Kunming (greutate, 20,40 ± 2,92 g; vârsta, 6-8 săptămâni) furnizați de Centrul pentru animale de laborator medical al Universității Medicale Hebei (Shijiazhuang, China) au fost utilizați în acest studiu. Toți șoarecii au fost aclimatizați la un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore la 24 °C cu umiditate de 50 la sută și au primit acces liber la hrană și apă la Mai mult sau egal cu 1 săptămână înainte de experimente. Toate procedurile experimentale au fost efectuate în strictă conformitate cu ghidurile Institutului Național de Sănătate (publicația NIH nr. 85-23, revizuită în 1996) și cu aprobarea de către Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor din Spitalul Central Cangzhou (aprobare nr. 2017-020-). 01). Toate intervențiile chirurgicale au fost efectuate sub anestezie și s-au depus toate eforturile pentru a minimiza suferința.
Ligatura și puncția cecală (CLP).CLP a fost efectuat pe șoareci pentru a crea un model de sepsis murin, așa cum s-a descris anterior (12). După anestezie prin inhalare de izofluran (indusă la 3 la sută și menținută la 0,5 la sută), a fost tăiată o incizie de 1 cm pe linia mediană. Cecumul expus (1 cm distanță de la capăt) a fost legat cu două puncții folosind un ac de calibrul 23. Cecumul a extrudat ușor o cantitate mică de fecale și a fost plasat înapoi în poziția sa anatomică. Peretele abdominal a fost suturat în straturi cu o împletitură de mătase de 3-0. În urma procedurii, s-a injectat subcutanat 1 ml de soluție salină 0,9 procente. Șoarecilor li s-a oferit acces gratuit doar la apă. Șoarecii model simulat au fost operați în același mod ca modelul CLP fără CLP.
Design experimental. Șoarecii (n=6 pentru intervenția chirurgicală simulată și CLP) au fost repartizați aleatoriu în șapte grupuri: grupul Sham, grupul CLP, adenovirusul (Ad)-proteina verde fluorescentă (GFP) plus grupul CLP, Ad-miR-214 plus grupul CLP , grup anti-miR-214 plus CLP, inhibitor PTEN plus grup CLP și Ad-miR-214 plus inhibitor PTEN plus grup CLP. Șoarecii din grupul Sham au fost expuși la aceeași procedură, dar fără legarea și puncția cecumului. Șoarecii din celelalte grupuri au primit ligatură și perforație cecală. Toți șoarecii au fost anesteziați rapid prin inhalare de izofluran pentru a colecta sânge, urină șirinichiprobe la 24 de ore de la ultimul tratament.
Ad-miR-214, anti-miR-214 sau Ad-GFP mediat de adenovirustransfer de gene in vivo și injecție cu inhibitor PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214 sau Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) a fost livrat în cavitatea abdominală a șoarecilor cu 4 zile înainte de CLP. Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați prin inhalare de izofluran. Un cateter care conține 200 µl de adenovirus (2x1011 pfu, care exprimă miR-214, anti-miR-214 sau Ad-GFP) a fost administrat șoarecilor normali prin injecție intraperitoneală. Inhibitorul PTEN (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) a fost administrat șoarecilor CLP care au primit anti-miR-214 prin injecție intraperitoneală la o singură doză de 10 µg/kg cu 30 de minute înainte de administrarea adenovirusului .
Evaluarea funcției renale. Au fost recoltate probe de sânge din inima de șoareci, urmate de centrifugare (la temperatura camerei timp de 15 minute la 3,000 xg) pentru colectarea serului. Nivelurile serice ale azotului ureic din sânge (BUN) și creatininei serice (Cr) au fost determinate utilizând un analizor automat Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA a fost folosit pentru a analiza nivelurile deleziuni renalemolecula-1 (KIM-1; cat. nr. RKM100; R&D Systems,Inc.) și lipocalină asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL; cat. nr. DY3508; R&D Systems, Inc.) în probele de urină.
Test pentru inflamația serică a citokinei.TNF-(nr. cat. H052) și IL-6 (nr. cat. H007) au fost examinate folosind truse ELISA comerciale (Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng) conform instrucțiunilor producătorului.Măsurarea markerilor de stres oxidativ. Trusa de analiză corespunzătoare (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) a fost utilizată pentru a măsura nivelurile de malondialdehidă (MDA) și a testa activitatea superoxid dismutază (SOD) în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
Scorul histologiei și leziunilor tubulare. Toți șoarecii au fost supușirinichiperfuzie sub anestezie la 24 de ore după CLP. Therinichispecimenele au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 72 de ore la 4˚C. Probele de țesut au fost apoi deshidratate într-o serie gradată de soluții de etanol, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 4 µm. Secțiunile (4 um) au fost tăiate folosind un microtom și secțiunile de țesut au fost colorate cu hematoxilină (5 min) și eozină (1 min) la temperatura camerei pentru examinarea histologică. Lamele au fost evaluate și clasificate folosind un microscop (BX51, Olympus Corporation).Renaltissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 la sută (13).
Microscopia electronică cu transmisie (TEM).Proaspătrinichiau fost spălate în soluție salină tamponată cu fosfat și tăiate în cuburi de 1 mm și fixate succesiv în glutaraldehidă 2,5% timp de 24 de ore la 4°C. Secțiunile au fost scufundate în tetroxid de osmiu 1% timp de 2 ore la 4°C, deshidratate în etanol gradat și încorporate în epoxirășină. În cele din urmă, secțiunile ultrasubțiri (60 nm) au fost dublate colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb la 20°C timp de 60 de minute. Observația a fost efectuată pe un microscop electronic cu transmisie (Tecnai; Hitachi, Ltd.) la 80 kV utilizând filmul de microscopie electronică 4489 (bază groasă ESTAR; Kodak).
Imunohistochimie (IHC).Proaspătrinichițesuturile au fost fixate în paraformaldehidă 4% (timp de 72 de ore la 4°C) și încorporate în parafină. Specimenele au fost tăiate în secțiuni groase de 4 µm și deparafinate în xilen. După ce secțiunile de țesut au fost spălate cu PBS, acestea au fost fierte în tampon citrat 10 mM (pH 6.0) timp de 4 minute pentru recuperarea antigenului și apoi blocate cu ser de capră 10% în PBS la temperatura camerei timp de 1 h. Anticorpul primar (anti-LC3B; 1:400; cat. nr. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) a fost adăugat în conformitate cu instrucțiunile și incubat la 4°C timp de 12 ore. Anticorpul secundar (capră antiiepure HRP; 1:2,000; cat. nr. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) a fost adăugat și incubat la temperatura camerei timp de 10 minute. S-a adăugat DAB (100 µl) și s-a contracolorat timp de 5 minute cu colorarea observată la microscop cu lumină (Model CX31-P; Olympus Corporation). Intensitatea colorării pozitive, care a apărut maro, a fost determinată folosind software-ul de analiză a imaginii Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Densitatea optică integrală (IOD) a fost calculată pentru a reprezenta intensitatea. Valorile IOD au crescut pe măsură ce exprimarea proteinei a crescut.
Transcripție inversă-cantitativă(RT-q) PCR. ARN total a fost extras dințesut renalîn urma inducerii modelului folosind reactiv TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Conform instrucțiunilor kitului de transcripție inversă TaqMan (nr. cat. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ARN-ul a fost transcris invers în ADNc. Au fost utilizate următoarele condiții de termociclare (miR-214): Denaturare inițială la 95˚C timp de 5 min; urmate de 40 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 30 sec, recoacere la 60°C timp de 30 sec și alungire la 72°C timp de 30 sec. RT-qPCR a fost efectuată utilizând un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) și un kit standard SYBR Green PCR (Toyobo Life Science). U6 a fost folosit ca control intern pentru miR-214. Secvențele de primer au fost după cum urmează: miR-214, înainte, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' și invers, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, înainte, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' și înapoi, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Aceste experimente au fost replicate de șase ori. Rezultatele au fost analizate folosind metoda 2-ΔΔCq (14). Nivelurile de expresie ARNm ale LC3, p62, PTEN, AKT și mTOR au fost evaluate prin RT-qPCR. Cu -actina ca referință internă a acestor gene, 2-ΔΔCq a fost utilizat pentru a măsura expresia relativă a genelor țintă. Secvențele de primer prezentate în Tabelul I au fost sintetizate de Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blot. Rinichițesutul a fost amestecat cu lizat RIPA (Institutul Beyotime de Biotehnologie) pentru a face omogenatul și liza a fost oprită când nu a fost observat niciun țesut vizibil. Probele au fost centrifugate la 13,000 xg timp de 10 minute la -4˚C și supernatantul a fost recuperat pentru analiza Western blot. Pe scurt, concentrațiile de proteine au fost determinate folosind kitul de analiză a proteinei micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Probele de proteine (80 ug per probă) au fost supuse separării prin reducerea electroforezei cu 12% dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă în gel și apoi transferate pe membrane de difluorură de poliviniliden la 4 °C peste noapte. Proteinele separate au fost transferate pe membranele PVDF. După blocarea în lapte degresat 5% la temperatura camerei timp de 2 ore, membranele au fost incubate peste noapte (la 4°C) cu anticorpi primari. Au fost utilizați următorii anticorpi primari (toți Cell Signaling Technology, Inc.): lanț ușor 3B (1:1,000; cat. nr. 4412), p62 (1:1,000; cat. . nr. 4412), Anti‑PTEN (1:1,000; cat. nr. 9188), anti‑fosforilat (p)‑AKT (Ser473) (1:1,000; pisică . nr. 4060), anti‑AKT (1:1,000; cat. nr. 9272), anti‑p‑mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. nr. . 5536), anti-mTOR (1:1,000; cat. nr. 2972) și -actină (1:2,{000; cat. nr. 4970). După spălare, membranele au fost incubate (la temperatura camerei timp de 2 ore) cu anticorpii secundari anti-iepure conjugați cu HRP (1:3,000; cat. nr. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Benzile de proteine au fost detectate cu Immobilon Western (MilliporeSigma) și analizate folosind software-ul Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). Expresia proteinei a fost normalizată la -actină.
Analize statistice. Analiza statistică a fost efectuată utilizând GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Toate datele au fost prezentate ca medii ± abatere standard sau mediane (intervaluri intercuartile) pentru variabilele continue, în funcție de distribuțiile acestora. Caracteristicile și rezultatele inițiale au fost comparate utilizând ANOVA unidirecțională urmată de testul posthoc al lui Tukey sau testul Kruskal-Wallis urmat de testul Dunn, după caz. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultate
Punct de timp 24 ore după CLP. Studiile anterioare au raportat (6,15,16) că analiza biochimică (adică, LC3 și p62) arată că fluxul autofagiei este suprimat odată cu progresia sepsisului după 6-8 ore de CLP. În studiul de față, numărul de autolizozomi dinrinichinumărul de șoareci tratați cu CLP a crescut în 24 de ore după operație. În plus, analiza markerilor deleziuni renalea aratat cafunctie renalaa fost afectat cel mai grav la 24 de ore după CLP. Prin urmare, momentul de timp 24 de ore după CLP a fost ales pentru următoarele experimente.
Efect de reglementare asupra miR-214 în țesuturile renale. Analiza RT-qPCR a fost utilizată pentru a detecta expresia miR-214 la șoarecii tratați cu CLP. S-a constatat că expresia miR-214 a fost ușor suprareglată înrinichițesuturi după intervenția chirurgicală CLP 24 de ore, în comparație cu grupul simulat (1,47 ori, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">rinichițesut, în comparație cu grupul simulat (ambele P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ
Efectul miR-214 asupra disfuncției renale la șoarecii septici.Toți șoarecii au fost sacrificați pentru a colecta sânge, urină șirinichiprobe la 24 de ore după operația CLP. BUN și Cr sunt indicatori importanți ai severitățiirenaldepreciere (17). În plus, NGAL și KIM-1 au fost identificați ca biomarkeri specifici aileziuni renaleiar exprimarea lor crescută este asociată cu precocerenalleziune tubulară în AKI (17). După cum se arată în Fig. 2A-D, nivelurile de BUN, Cr, KIM-1 și NGAL au fost semnificativ crescute după intervenția chirurgicală CLP în comparație cu grupul simulat. Cu toate acestea, Ad-miR-214 a scăzut semnificativ nivelurile BUN, Cr, KIM-1 și NGAL în comparație cu grupul CLP (toate P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">functia rinichilorparametrii. Cu toate acestea, după pretratamentul cu inhibitor PTEN, efectele de protecție ale Ad-miR-214 au fost îmbunătățite. Rezultatele arată că miR-214 atenuează disfuncția renală la șoarecii septici.
Efectul miR-214 asupra inflamației renale și a stresului oxidativ.După cum se arată în Fig. 3A și B, CLP a crescut semnificativ nivelurile de TNF- și IL-6, în timp ce Ad-miR-214 a scăzut semnificativ nivelurile acestor markeri. Comparativ cu
Efectul miR-214 asupra autofagiei renale la șoarecii septici.Prezentul studiu a examinat modificările LC3 înrinichițesuturi prin colorare IHC. După cum se arată în Fig. 6, intensitatea LC3 a colorării pozitive a crescut semnificativ în grupul CLP în comparație cu grupul simulat (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 activează calea AKT/mTOR pentru a inhibaautofagie prin tăcere PTEN în țesuturile renale.Efectul CLP asupra autofagiei înrinichițesuturile au fost investigate prin evaluarea nivelurilor de LC3-II/I și p62. Calea de semnalizare PTEN/AKT/mTOR joacă un rol important în autofagie (18). Pentru a investiga efectul miR-214 asupra căii PTEN-AKT/mTOR, nivelurile de proteine ale LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR și PTEN au fost analizate prin Western blotting și RT- analiza qPCR. După cum se arată în Fig. 7A-C, modificarea acestor proteine are loc rapid, cu o creștere a ratei LC3-II/LC3-I și o reducere a nivelurilor de p62 (ambele P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">rinichi tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Aceste rezultate au arătat că autofagia a fost indusă de CLP, iar supraexprimarea miR-214 ar putea-o inhiba parțial.
După cum se arată în Fig. 7A și D-F, nivelul de expresie al PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">rinichi tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Aceste constatări sugerează că CLP inducerinichiautofagia tisulară prin inhibarea căii AKT/mTOR. Ad-miR-214 a activat calea AKT/mTOR prin tăcere PTEN înrinichișervețele. Cu toate acestea, în comparație cu grupul CLP, anti-miR-214 nu a inhibat semnificativ expresia mTOR. Prin urmare, RT-qPCR a fost utilizat în continuare pentru a determina expresia ARNm a genelor legate de calea de semnalizare PTEN/AKT/mTOR. Conform rezultatelor RT-qPCR (Fig. 8), în comparație cu grupul Sham, nivelurile de expresie a ARNm ale p62, LC3 și PTEN au fost semnificativ crescute, în timp ce expresia ARNm a AKT și mTOR a fost scăzută în grupul CLP. În comparație cu grupul CLP, Ad-miR-214, PTEN
grupurile inhibitoare și Ad-miR-214 plus inhibitori PTEN au prezentat o scădere a expresiei ARNm a LC3 și PTEN, dar a crescut expresia ARNm a p62, AKT și mTOR (toate P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Astfel, efectul p62 asupra autofagiei poate apărea la nivel transcripțional mai degrabă decât la nivel post-transcripțional. Rezultatele actuale au demonstrat că miR-214 a reglat în jos expresia PTEN și a activat calea de semnalizare AKT/mTOR.
Discuţie
Studiul de față a constatat că autofagia excesivă a fost dăunătoarefunctie renalala soareci septici. Studiile anterioare au arătat că miR-214 este asociat cu creșterea proliferării, metastazelor, invaziei și funcționează ca o oncogenă pentru celule și țesuturi (19-22). Studiile raportează că miR-214 servește un rol protector împotriva AKI prin atenuarea apoptozei, stresul oxidativ și factorii inflamatori de reglare în jos (21,23). Prezentul studiu a examinat în continuare mecanismele care stau la baza efectului protector al miR-214 asupra AKI indusă de sepsis, concentrându-se pe potențiala implicare a miR-214 în modularea autofagiei. Rezultatele au arătat că stresul oxidativ a apărut înrinichiîn urma administrării intervenţiei chirurgicale CLP. Între timp, activarea autofagiei are loc înrinichi.LC3 II/I crescut și reducerea p62 înrinichia fost observată în urma tratamentului cu chirurgie CLP. După cum era de așteptat, supraexpresia miR-214 sa atenuat semnificativrinichileziuni patologice şirinichidisfuncție cauzată de sepsis. Cu toate acestea, inhibarea miR-214 a prezentat o tendință opusă la renoprotecție. În plus, efectul de protecție al Ad-miR-214 a fost îmbunătățit de inhibitorul PTEN.
Într-o septicărinichi, inflamația excesivă este însoțită de creșteri masive ale producției de ROS și un număr mare de ROS declanșează modificări ale structurii mitocondriale și afectează funcția mitocondrială, ceea ce face ca organismul să intre într-un cerc vicios care agraveazărinichidaune (24,25). Prin urmare, stresul oxidativ poate fi unul dintre principalele mecanisme patologice ale AKI indusă de sepsis. Studiul de față a furnizat dovezi suplimentare care demonstrează stresul oxidativ excesiv, care a fost indicat de creșterea producției de MDA și reducerea activității SOD înrinichițesuturi după intervenția chirurgicală CLP. În plus, s-a constatat că supraexprimarea miR-214 ar putea protejarinichiîmpotriva leziunii oxidative induse de CLP, care este implicată în inhibarea autofagică. Acest lucru este în concordanță cu studiile anterioare conform cărora miR-214 protejează diferite celule și țesuturi împotriva stresului oxidativ (26,27).
Autofagia servește ca o „sabie cu două tăișuri” în dezvoltarea sepsisului: autofagia bazală poate exercita efecte protectoare prin eliminarea proteinelor oxidative toxice, dar autofagia excesivă poate duce la moarte celulară autofagică în condiții de stres sever, cum ar fi erupția ROS (28,29) . S-a demonstrat că autofagia este activată inițial în sepsis, urmată de o fază ulterioară de disfuncție datorată morții celulelor autofagice (30), care agravează leziunea oxidativă indusă de sepsis. În studiul de față, inhibitorul PTEN sau supraexprimarea miR-214 au prezentat renoprotecție antioxidantă la șoarecii tratați cu CLP. Cu toate acestea, inhibarea miR-214 a prezentat o tendință opusă de renoprotecție antioxidantă. Deci autofagia excesivă sau inadecvată poate provocaafectarea rinichilor; ambele sunt dezadaptative și în cele din urmă provoacă moartea celulelor. Prin urmare, menținerea unor niveluri moderate de autofagie este cheia pentru atenuarea leziunii oxidative în stare septică.
CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI
Dovezile acumulate au indicat că miR-214 inhibă autofagia în diferite celule și țesuturi (31-33). În studiul de față, s-a constatat că supraexpresia miR-214 inhibă autofagia indusă de CLP înțesuturi renale,așa cum este indicat de modificările markerilor proteici, cum ar fi LC3-II/I și p62. În plus, rezultatele au demonstrat că supraexprimarea miR-214 a atenuat leziunea oxidativă indusă de CLP prin inhibarea autofagiei excesive. Prezentul studiu a investigat, de asemenea, mecanismele moleculare prin care miR-214 moduleazărinichiautofagie în AKI indusă de sepsis. PTEN/AKT/mTOR este o cale de semnalizare importantă care regleazărinichiautofagia (34, 35) și care servește un rol cheie în AKI indusă de sepsis, iar PTEN este un inhibitor negativ al căii de semnalizare PI3K/AKT/mTOR. Studiile anterioare au raportat că miR-214 poate regla autofagia prin calea de semnalizare PI3K/AKT/mTOR în diferite modele (36-38). Ma și colab. (39) au descoperit că miR-214 poate regla în jos autofagia în rinichii diabetici. Prin urmare, s-a emis ipoteza că efectele miR-214 asupra AKI indusă de CLP ar putea fi implicate în reglarea căii PTEN/AKT/mTOR. În special, rezultatele studiului prezent au arătat că intervenția chirurgicală CLP a crescut semnificativ nivelurile de PTEN, dar a scăzut nivelurile de p-AKT și p-mTOR, indicând faptul că intervenția chirurgicală CLP a inactivat calea AKT/mTOR. În plus, supraexprimarea miR-214 a activat calea AKT/mTOR prin tăcere PTEN în autofagia indusă de CLP înrinichișervețele. Cu toate acestea, anti-miR-214 nu a inhibat semnificativ expresia mTOR în analizele Western blot. Astfel, RT-qPCR a fost utilizat în continuare pentru a determina expresia ARNm a genelor legate de calea de semnalizare PTEN/AKT/mTOR. Prezentul studiu a identificat că miR-214 a reglat în jos expresia PTEN și a activat calea de semnalizare AKT/mTOR pentru a inhiba autofagia. Cu toate acestea, ar trebui efectuate studii suplimentare exhaustive pentru a obține detalii suplimentare legate de mecanismulrinichiautofagie în stare septică.
În concluzie, rezultatele acestui studiu au sugerat că miR-214 a jucat un rol protector împotriva sepsisului indus.leziuni renaleprin reducerea stresului oxidativ și inhibarea autofagiei prin reglarea căii PTEN/AKT/mTOR. Descoperirile prezente au sugerat că miR-214 poate fi o potențială țintă terapeutică pentru AKI indusă de sepsis. Cu toate acestea, studiul de față a folosit șoareci cu vârsta de 6-8 săptămâni, așa că sunt necesare cercetări suplimentare asupra mecanismului miR-214 la șoarecii adulți.
