Imagistica multicoloră a proteinelor care leagă calciul din pietrele la rinichi umani pentru elucidarea efectelor proteinelor asupra creșterii cristalelor

edmund.chen@wecistanche.com

Rinichiboala de calcul este o tulburare comună, care afectează 1,7–14,8 la sută din populație cel puțin o dată în viață1,2. În până la 50 la sută din cazuri, această boală reapare în decurs de 5 ani de la primul episod. În ciuda importanței acestei probleme de sănătate, terapia preventivă pentru formarea pietrelor nu este disponibilă. Înțelegerea patogenezeirinichiformarea pietrei este esențială pentru a reduce apariția și reaparițiarinichiboala de pietre3. Aproximativ 80 la sută dinrinichipietrele sunt pietre de oxalat de calciu (CaOx)4,5. Pietrele de CaOx constau din ~90 la sută din faza minerală, adică CaOx care este clasificat în continuare în oxalat de calciu monohidrat [Ca(C2O4)·H2O](COM) și oxalat de calciu dihidrat [Ca(C2O4)·2H2O](COD) și o fracțiune relativ mică de materie organică, care a fost considerată Departamentul de Nefro-Urologie, Școala Absolventă de Științe Medicale, Universitatea Nagoya City, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑8601, Japonia . 2Institutul pentru Studii Avansate de Co-Creare, Universitatea Osaka, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonia. 3Școala Licențiată de Inginerie, Universitatea Osaka, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonia. 4Școala Absolventă de Științe ale Vieții și al Mediului, Universitatea Prefecturală Kyoto, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japonia. 5Departamentul de Științe Pământului, Universitatea Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japonia. 6Muzeul Național al Naturii și Științei, 4‑1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Japonia. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217‑14, Hayashi‑cho, Takamatsu, Kagawa 761‑0395, Japonia. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3-1-11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577-0849, Japonia. 9Institutul de Inginerie Laser, Universitatea Osaka, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japonia. *E-mail: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp

Cuvinte cheie:rinichi; Piatra la rinichi; boală de rinichi; renal; fiziologia rinichilor

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ

ca matrice proteica6. Patogeniarinichiformarea pietrei include procese în mai multe etape care implică interacțiuni complexe între componentele minerale și matricea proteică7,8. Au fost identificate peste 100 de specii de proteine ​​înrinichipietre9–11. Printre acestea, se știe că mai multe proteine, în special proteinele care leagă calciul, joacă roluri esențiale în procesele de formare a pietrelor de CaOx12-16. Efectele specifice ale acestor proteine ​​au fost investigate intens în multe etape ale formării pietrei, inclusiv nuclearea cristalelor, creșterea cristalelor, agregarea cristalelor și aderența cristalelor, cu numeroase studii de cristalizare in vitro17–19. Studiile in vitro sunt utile pentru a evalua efectele proteinelor specifice asupra etapelor specifice de formare a calculilor. Cu toate acestea, în mediile reale de formare a pietrelor, un număr de proteine ​​funcționează simultan, iar compoziția urinei în concentrațiile de proteine, ion de calciu și oxalat fluctuează. Această îngrijorare ne-a motivat să investigăm omul realrinichipietre pentru a afla efectele reale ale proteinelor asupra creșterii cristalelor. În majoritatea studiilor anterioare, identificarea proteinelor înrinichipietrele au fost efectuate cu spectroscopie de masă după zdrobire și extracție9–11. Astfel, se pierd informații despre distribuția spațială a proteinelor din piatră. În investigații foarte limitate, identificarea proteinelor înrinichipietrele au fost efectuate cu secțiuni tăiate de pietre la rinichi în care cristalele de CaOx sunt complet îndepărtate prin decalcifcare20,21. Această abordare este utilă pentru a găsi distribuția unei proteine ​​înrinichipietre care pot ajuta la înțelegerea efectelor proteinelor specifice asupra formării pietrelor. Cu toate acestea, o cantitate imensă de informații despre formarea pietrei, înregistrate înrinichicristale de piatră, se pierde în această metodă. Importanța informațiilor minerale ale pietrelor la rinichi care pot fi dobândite prin identificarea fazelor cristaline și clasificările texturii cristaline efectuate folosind secțiuni de felie și secțiuni subțiri lustruite derinichipietrele cu microscopie optică a fost demonstrată de peste 70 de ani de studii anterioare22,23.

Absența analizei de evaluare a distribuțiilor proteinelor cu cristale de CaOx curaterinichipietrele a reprezentat un obstacol considerabil pentru înțelegerea formării pietrei. Evaluarea coordonată a distribuțiilor proteinelor și fazelor/morfologiilor cristalului poate oferi informații semnificative despre istoria formării pietrei. Colorarea cu imunofluorescență multiplă (colorare multi-IF) a fost utilizată pentru a arăta distribuțiile a două sau mai multe proteine ​​în multe tipuri de țesuturi moi ale probelor biologice24. Aplicarea tehnicii la țesuturile osoase, care sunt compuse din cristale poroase de fosfat de calciu, a oferit, de asemenea, perspective semnificative asupra reglării dinamice a homeostaziei minerale osoase25. Cu toate acestea, acest lucru nu a fost folosit pentru a investigarinichipietre compuse din cristale dense și dure, deși s-a folosit o singură colorare cu imunofluorescență pentru a arăta distribuția unei proteine ​​​​specifice în decalcifiere.rinichipietre care nu rețin informații minerale20,21. Acest studiu a investigat condițiile care permit colorarea multi-IF arinichiprobe de piatră pentru a păstra informațiile minerale originale. Am investigat distribuția a trei proteine ​​diferite, osteopontina (OPN),renalfragmentul de protrombină 1 (RPTF-1) și calgranulină A (Cal-A), în secțiuni subțiri ale calculilor de CaOx. Aceste proteine ​​sunt comune în majoritatea calculilor de CaOx și sunt cunoscute ca proteine ​​care leagă calciul care pot afecta formarea pietrei de CaOx26–28. Din câte cunoștințele noastre, acesta este primul studiu în care proteinele matriceale multiple sunt co-vizualizate într-unrinichipiatră. În continuare, interpretăm diferitele efecte in vivo ale fiecărei proteine ​​asupra creșterii cristalelor de CaOx pe baza distribuțiilor lor, proprietăților fizico-chimice și modificărilor complexe ale mediului fizic ale fiecărei proteine ​​în timpul formării pietrei de CaOx.

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI RINCHII/DIALIZA RENALĂ

Rezultate

Pe baza observației microscopice cuplate cu analiza FT-IR, domeniilerinichiProbele de piatră au fost clasificate în trei tipuri de texturi care sunt în concordanță cu cea raportată în Schubert și Brien23: textură neregulată compusă din cristale COD euhedrale (Tipul 1, denumit agregat COD euhedral; Fig. 1c), textură mozaic compusă din COM orientat neregulat. cristale (Tipul 2, denumit COM mozaic; Fig. 1f) și cristale COM laminate concentric (Tipul 3, denumit COM concentric; Fig. 1i). Majoritatea probelor de piatră CaOx observate au constat din aceste trei texturi (Tabelul 1). Protocolul de colorare Multi-IF utilizat pentru probele biologice a fost aplicat la analiza secțiunilor subțiri derinichiprobe de piatră preparate printr-o metodă geologică tipică. Pentru aplicare, starea de gravare a secțiunii subțiri înainte de colorare a fost ajustată și s-a constatat că vizualizarea a avut succes numai atunci când secțiunea subțire lustruită a fost ușor gravată (cu o soluție de citrat cu pH 6.0 timp de 1 minut). ) înainte de procesul tipic de colorare. Colorarea multi-IF a permis co-vizualizarea a trei proteine ​​în culori diferite (OPN: verde, RPTF-1: albastru și, Cal-A: roșu) în cele trei texturi diferite de piatră.

Am descoperit că fiecare proteină a arătat un model de distribuție caracteristic în funcție de locația sa în COM și COD. Agregatele COD euedrice au fost găsite în 7 probe din 15 probe (Tabelul 1). Agregatele COD euedrice au fost prezente predominant la periferia CaOxrinichipietre (Fig. 1a–c). Se știe că aceste cristale COD au o formă de bipiramidă tetragonală compusă din {101} fețe29. Multe dintre bipiramidele COD au, de asemenea, fața {110} pe vârful ambelor piramide (Fig. 2b și Fig. S1 suplimentară). O imagine de colorare multi-IF a cristalelor COD este prezentată în Fig. 2a, iar OPN apare periodic pe fața {110} a COD, așa cum este arătat de săgețile albe din Fig. 2c. Această față este aceeași față a vârfului bipiramidei care nu apare în creșterea tipică a cristalelor COD in vitro29. RPTF-1 a apărut ca straturi paralele de-a lungul {101} feței, cu intervale la scară µm, așa cum este arătat de săgeata galbenă din Fig. 2d. Această față de cristal este caracteristică creșterii tipice a COD29. Cal-A a fost prezent în afara cristalelor COD, nefiind o adsorbție preferențială pe fețe specifice (Fig. 2e). Aceleași modele de distribuție au fost observate și în alte mostre de piatră (Fig. S2 suplimentară). Textura mozaic COM este cea mai răspândită textură în pietrele de CaOx (Fig. 1d–f). Această textură a fost observată în 12 probe din 15 (Tabelul 1). Colorarea multi-IF a mozaicului COM este prezentată în Fig. 3a,b. OPN și RPTF-1 au fost prezente în toate cristalele COM (Fig. 3c, d). În schimb, Cal-A a fost prezent exclusiv de-a lungul granițelor de cereale (adică, pe suprafețele granulelor COM) (Fig. 3e). Am analizat în continuare un profil de intensitate a liniilor proteinelor, așa cum se arată în Fig. 3a, pentru a evalua fiecare model de distribuție a proteinei în detaliu (linia galbenă în Fig. 4a). OPN și RPTF-1 au prezentat intensități mai mari în zona cristalului, în timp ce Cal-A a arătat o intensitate mai mică în zona

zona cristalului (Fig. 4b). Intensitatea mare a Cal-A a fost observată exclusiv de-a lungul granițelor cristalelor. Aceste distribuții de proteine ​​au fost observate în multe probe, deși dimensiunile și formele boabelor COM au fost diferite (Fig. S3 suplimentară). COM concentric este, de asemenea, o textură tipică în pietrele de CaOx (Fig. 1g–i). Am găsit această textură în 10 mostre din 15 (Tabelul 1). OPN, RPTF-1 și Cal-A au fost distribuite în straturi concentrice (Fig. 5a). OPN și RPTF-1 au fost prezente ca straturi constante și regulate în toate cristalele COM, formând un interval la scară µm (Fig. 5b, c). În schimb, distribuția Cal-A a fost compusă din straturi neregulate și cu intervale relativ late, situate în suprafața exterioară a pietrei (Fig. 5d). Observația SEM a arătat un strat gol aproape de fiecare strat Cal-A (Fig. 6a, b). Ambele suprafețe care au creat spațiul gol au fost ocupate cu depozite minuscule care erau clar distincte de cristalele COM majore care compun COM concentric (Fig. 6c, d). Profilurile de intensitate ale liniilor acestor proteine ​​în COM concentric au arătat vârfuri în fiecare profil de proteină (Fig. 4c, d). Profilurile OPN și RPTF-1 au fost similare (adică, 5,58±2,70 µm/strat de OPN și 5,99±2,56 µm/strat de RPTF-1) (Tabelul suplimentar S1). Cu toate acestea, straturile Cal-A au avut intervale distinct de mari (adică, 23,17±18,57 µm/strat) decât OPN și RPTF-1. Modele și intervale de distribuție similare au fost observate în majoritatea celorlalte 9 eșantioane, deși stratul Cal-A nu a fost văzut în câteva mostre (Fig. S4 suplimentară și Tabelul S1).

În acest studiu, proporțiile celor trei texturi din pietrele de CaOx și distribuțiile celor trei proteine ​​în cele trei texturi nu au avut o relație clară cu vârsta și sexul formatorului de pietre, deși cantitatea de pietre investigate nu a fost suficientă pentru analiza corelației. . Se știe că OPN, RPTF-1 și Cal-A sunt prezente în pietrele de CaOx pe baza detectării din extractele de pulberi de piatră cu electroliză9–11. Distribuțiile la micro-scală ale OPN în calculii de decalcifiere CaOx cu tehnica imunocitochimică au arătat distribuții OPN în lamele concentrice din pietrele de CaOx21,30. Prezenta metodă a vizualizat în mod viu locațiile a trei proteine ​​diferite în „straturi organice” considerate anterior (Fig. 7a, b). Modelul de distribuție al OPN pe care îl prezentăm în studiul de față în COM concentric este în concordanță cu observațiile anterioare. În plus, am descoperit că modelul de distribuție al RPTF-1 în COM concentric este aproape același cu cel al OPN, în timp ce distribuția RPTF-1 în cristalele COD este diferită de cea a OPN. În schimb, modelul de distribuție al Cal-A este complet diferit de celelalte două proteine. Aceste distribuții la scară diferite ale OPN, RPTF-1 și Cal-A înregistrează istoria formării pietrelor de CaOx.

Discuţie

Factorul principal de control al încorporării proteinelor în cristale.Atât OPN, cât și RPTF{{0}} au fost prezente în cristale COD euhedrale, granule COM mozaic și COM concentrice (Figurile 2a, 3a și 5a). Această descoperire confirmă faptul că aceste proteine ​​sunt încorporate atât în ​​cristalele COD, cât și în cristalele COM. Cal-A a fost prezent în exteriorul cristalelor COD euedrice și în jurul granulelor COM mozaic (Figurile 2e și 3e). În cazul COM concentric, un spațiu liber găsit în mod obișnuit în jurul straturilor Cal-A sugerează că straturile Cal-A nu sunt incluse în cristale, ci distribuite pe suprafața cristalelor (Figurile 5d și 6a-d). Aceste distribuții indică faptul că OPN și RPTF-1 tind să fie încorporate în cristalele de CaOx, în timp ce Cal-A este cu greu încorporat. Adsorbția și încorporarea proteinelor în cristalele de CaOx sunt teoretic influențate de forța de legare a lanțurilor lor laterale de aminoacizi și de alte proprietăți specifice ale proteinelor respective, cum ar fi sarcina electrostatică negativă31,32. Sarcina netă indică faptul că OPN și RPTF-1 sunt încărcate mai negativ decât Cal-A, cu puncte izoelectrice de OPN, RPTF-1 și Cal-A de 3,5, 2,5–3.{{28} } și 6,5–7,0, respectiv 33–35. Se știe că OPN, RPTF-1 și Cal-A au domenii de legare a calciului36–38. Aceste domenii pot funcționa în plus ca site-uri locale de legare la suprafețele de cristal în creștere. Domeniile de legare a calciului ale OPN, RPTF-1 și Cal-A pot lega 10, 7 și, respectiv, 2 ioni de calciu36–38. Astfel, afinitățile în vrac și locale ale acestor proteine ​​față de Ca încărcat pozitiv de pe suprafața CaOx determină eficiența diferită de încorporare a acestor proteine ​​în CaOx, creșterea cristalului are loc prin încorporarea unităților de creștere în trepte și locuri de îndoire care apar pe suprafețele cristalului39,40. . Compatibilitățile arbore-dimensionale dintre proteine ​​și suprafețele de cristal în creștere ar determina

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

gradul de încorporare a proteinelor în suprafața cristalului. Proteinele cu o capacitate puternică de legare la locurile de îndoire și etapele de creștere tind să fie încorporate în cristalul în creștere mai eficient41–43. Distribuțiile raportate în prezent și afinitățile de calciu ale celor trei proteine ​​sugerează că afinitatea puternică a OPN și RPTF -1 facilitează legarea și încorporarea în cristalele COD și COM. În schimb, Cal-A, care are o afinitate mai mică, aderă doar la suprafața cristalului, dar nu este încorporat în cristal. Un studiu anterior care a arătat rate mai mari de încorporare a peptidelor în COM de către mai multe peptide fosforilate susține această explicație43. Aceste discuții ne-ar permite să prezicem distribuțiile multor alte proteine ​​pe baza proprietăților lor de legare a calciului.

Absorbția selectivă in vivo și efectele inhibitoare ale OPN și RPTF-1 asupra creșterii cristalelor de CaOx.S-a considerat că cristalele COD euedrice care sunt prezente predominant la periferia pietrei de CaOx cresc cu o textură laminată caracteristică în care așa-numitul „strat de materie organică” și „stratul mineral” alternează reciproc în timpul creșterii cristalelor44,45. Deși motivele exacte care stau la baza schimbării stratului rămân neclare, potențialele explicații includ schimbările mediului în gazda umană,rinichifiziologie și modificări biochimice ale urinei și mecanisme de feedback cinetic care formează structuri de zonare oscilatoare găsite în minerale8. Rezultatele prezente arată că OPN și RPTF-1 construiesc textura laminată corespunzătoare {110} și respectiv {101} fețelor COD ca proteine ​​intracristaline, în timp ce Cal-A nu este inclus în textura laminată (Fig. 2c). –e). Această dovadă in vivo a adsorbției/incorporării selective de suprafață a proteinelor pe/înrinichicristalele de piatră indică faptul că distribuțiile proteinelor nu sunt identice cu „stratul de materie organică” tradițional observat prin microscopie optică (Fig. 7a). Dovezile in vitro privind adsorbția selectivă a OPN pe cristalul COD au fost raportate de Chien și colab. (2009 și 2018)46,47. Conform acestor rapoarte, OPN se leagă de fața {110} cristalografică tipică a COD și se încorporează în faza minerală, fiind în concordanță cu rezultatele noastre (Fig. 7b). Adsorbția/încorporarea selectivă de suprafață a rezultat probabil din capacitatea de legare a calciului a fiecărei proteine ​​și/sau compatibilități moleculare diferite între grupările funcționale de pe moleculele de proteine ​​și aranjarea ionilor de rețea pe fiecare suprafață de cristal.

Majoritatea proteinelor inhibă creșterea cristalelor de CaOx în timpul formării pietrei48,49. Inhibarea creșterii cristalelor de către peptide este considerată ca prin pasul de fixare și/sau blocarea îndoirii41-43. În studiile anterioare in vitro, se știe că OPN și RPTF-1 sunt inhibitori ai creșterii cristalelor de CaOx48,49. Cu toate acestea, amploarea inhibiției înrinichiformarea pietrei rămâne neclară.

Observația prezentă arată că majoritatea cristalelor de COD de calcul renal au un obicei tipic de cristal cu fețe (Fig. 2b). Suprafețele cristaline care au rate de creștere relativ lente sunt în general bine dezvoltate40. Această finanțare indică faptul că rata de creștere a {101} fețelor COD este lentă în comparație cu alte suprafețe (de exemplu, {110}). Adsorbția preferențială a RPTF-1 care ar putea încetini creșterea cristalelor prin încorporarea în COD a fost găsită ca o structură laminată împreună cu fețele {101} (Fig. 2d). Pe de altă parte, am găsit fețe {110} ca structuri laminate OPN în interiorul cristalului COD (Fig. 2c). Fețele {110} au apărut deoarece structura laminată OPN sunt mai dezvoltate decât fețele {110} ale cristalelor COD fără OPN obținute în studiu in vitro46. Fața {110} a COD cu adsorbție preferențială a OPN nu este fața de cristal care apare pe COD a obiceiului tipic de cristal47. Prin urmare, absorbția OPN pe {110} ar decelera extrem de rata de creștere relativă a suprafeței, iar decelerația a fost suficient de lentă pentru a apărea fețele {110}. Apariția fețelor {110}, cu alte cuvinte, schimbă obiceiul general al cristalelor în multe mostre de pietre la rinichi. Cristalele COM apar fie ca textură mozaic, fie ca textură concentrică (Figurile 3a și 5a). Atât OPN, cât și RPTF-1 sunt prezente omogen în granulele COM în textura mozaic (Fig. 3c, d). Prin urmare, efectele acestor proteine ​​asupra ratei de creștere a acestui tip de COM nu sunt clare. În COM concentric, cristale sub formă de șipci aliniate radial de la centru spre exterior50. Fețele de cristal ale cristalelor sub formă de șipci nu sunt clare, dar suprafața exterioară a COM sferică care este expusă la urină ar trebui să aibă aceleași fețe cristalografice. Rezultatele prezente arată în mod clar că OPN și RPTF-1 au profiluri de linii de distribuție similare în care se distribuie periodic în COM concentric ca straturi de intervale de aproximativ 4 până la 6 µm (Figurile 4c, d, 5b, c și Tabelul suplimentar S1). Aceasta indică faptul că OPN și RPTF-1 au o diferență neglijabilă în ceea ce privește adsorbția și încorporarea pe fețele cristaline specifice ale COM expuse la urină. Lucrările in vitro anterioare au arătat că OPN are efecte inhibitoare asupra creșterii COM a fețelor {100}, {121} și {010} 51. Când este luat în considerare acest efect inhibitor, rezultatul prezent indică faptul că creșterea COM concentrică a fost inhibată de OPN. și posibil de către RPTF-1 ca RPTF-1 are o capacitate similară de legare a calciului și, prin urmare, are o eficiență de încorporare similară cu COM.

Figura 7. Schema distribuției proteinelor în trei texturi majore în CaOx. (a) Distribuția matricei proteice este luată în considerare în studiile anterioare (culoare albă: fază minerală culoare neagră: materie organică). (b) Distribuția specifică a proteinei găsită în studiul de față (verde: osteopontină (OPN), albastru: fragmentul de protrombină renală 1 (RPTF-1) și roșu: calgranulină A (Cal-A). COD idiomorfă de tip 1, tip 2 mozaic COM și tipul 3 laminat concentric COM.

Efectele inhibitoare in vivo ale Cal-A asupra creșterii cristalelor de CaOx.Adsorbția Cal-A pe fețele de cristal specifice atât ale cristalelor COM și COD nu a fost observată în rezultatul prezent (Figurile 2a și 3a). Cal-A are o capacitate mai mică de legare a calciului decât OPN și RPTF -1 și a fost prezent în exteriorul cristalelor COD euedrice și în jurul granulelor COM mozaic fără structură laminată (Figurile 2a,e și 3a,e). Cu toate acestea, Cal-A este, de asemenea, cunoscut că inhibă creșterea cristalelor de CaOx în studiul in vitro28. Prin urmare, Cal-A ar fi putut funcționa ca o moleculă de surfactant care afectează morfologia și rata de creștere a cristalelor fără încorporare în cristal39,40,52. În condiții obișnuite de urină (adică, fără o concentrație mare neregulată de Cal-A), Cal-A poate avea un efect inhibitor mai mic decât OPN și RPTF-1 asupra creșterii cristalelor de COM și COD, deoarece OPN și RPTF{{17} } inhiba dezvoltarea treptelor pe fețele cristalului prin fixare și/sau blocare prin încorporare în cristale. Prin urmare, capacitatea de legare a calciului a proteinelor din pietrele la rinichi ar ajuta la evaluarea extinderii efectelor lor inhibitoare asupra creșterii CaOx. , 5d și Tabelul suplimentar S1). Cal-A a fost identificat în urina formatorilor de pietre28. Astfel, fluctuațiile concentrației sale în urină ar trebui să apară în mod natural. Cu toate acestea, datorită afinității sale mai mici pentru ionii de calciu, mici fluctuații ale concentrației de Cal-A ar putea să nu fie înregistrate în textura COM. Cal-A este excretat în urină neperiodic ca proteine ​​anti-infamatorii ca răspuns la infamare53,54. Prin urmare, straturile non-periodice de Cal-A pot înregistra ocazional concentrații mari de Cal-A în urină din cauza modificărilor neregulate ale mediului, cum ar fi infecții, răni și sângerări. Efectul său inhibitor asupra creșterii COM ar depinde puternic de concentrația sa în jurul cristalelor în creștere, deoarece mai multe peptide au o astfel de dependență de creșterea cristalelor de calcit42. Cal-A poate încetini slab creșterea COM ocupând parțial suprafața de creștere atunci când concentrația sa în jurul cristalului este scăzută, deoarece proteina nu este predispusă să fie încorporată în CaOx. În COM concentric, straturile de gol înconjurate de depozite mici găsite prin observarea SEM prezintă locuri aproape identice cu straturile Cal-A găsite prin imagistica multi-IF (Fig. 6a-d). Prin urmare, atunci când stratul de Cal-A devine gros datorită concentrației sale neregulat de mare prin unele modificări biologice, Cal-A poate funcționa ca un inhibitor puternic al creșterii CaOx, ocupând pe scară largă suprafața de creștere. Inflamația, care este un declanșator al secreției de Cal-A, poate afecta, de asemenea, o etapă diferită a formării calculilor, deoarece un tip de globule albe (de exemplu, macrofage) care au efecte de promovare și inhibitoare asupra formării pietrelor la rinichi a fost găsit în experimente care utilizează un șoarece model de pietre la rinichi16.

Aplicarea posibilă a imagistică multi-IF la formarea globală a pietrelor la rinichi.Lucrarea prezentă a extins aplicarea imagistică multi-IF a proteinelor la probe biominerale mai dure, adică pietre la rinichi. Nuclearea cristalelor, creșterea cristalelor, agregarea cristalelor și aderența cristalelor au fost considerate pași importanți în formarea pietrelor la rinichi. OPN, RPTF-1 și Cal-A sunt raportate ca inhibitori ai nucleării, creșterii și agregării CaOx prin studii in vitro48,49. Aplicația prezentă extinsă a imaginilor multi-IF oferă dovezi in vivo ale efectului inhibitor al creșterii CaOx de către proteinele care au fost implicate de studiile in vitro anterioare. Investigațiile asupra efectelor proteinelor în fiecare pas au fost efectuate prin studii in vivo la șoareci, precum și prin număr de studii in vitro14,15,26. De exemplu, un rol critic renoprotector al OPN ca inhibitor al formării cristalelor și un inhibitor al aderenței cristalelor a fost raportat pe baza experimentelor in vivo la șoareci26, în timp ce, promovarea aderenței cristalelor la celulele epiteliale tubulare prin OPN și îmbunătățirea pietrei de CaOx. formarea au fost raportate pe baza unor experimente in vivo mai recente folosind șoareci knockout OPN14,15. O morfologie de cristal complet diferită găsită în pietrele la rinichi ale unui șoarece Knockout OPN susțin, de asemenea, efectele OPN în mai multe etape de formare a pietrelor la rinichi. Prezenta metodă de vizualizare ar fi utilă în evaluarea efectelor proteinelor în aceste studii in vitro la șoareci și chiar utilă în evaluarea diferitelor etape ale formării pietrelor la rinichi umani. Această analiză inedită ne-ar permite să le interpretăm efectele in vivo ale diferitelor proteine ​​asupra formării calculilor de CaOx care pot deschide o cale pentru examinarea patologică și medicina personalizată pentru gestionarea bolii litiază la rinichi uman.

Metode

Declarație de etică. Proiectul de cercetare prezentat în această lucrare a fost aprobat de consiliul de evaluare instituțional al școlii postuniversitare de medicină, universitatea Nagoya City. Toate metodele au fost efectuate în conformitate cu îndrumările și reglementările relevante. Consimțământul informat scris de la toți subiecții a fost obținut conform procedurilor aprobate de consiliul comitetului de etică.

Colectarea pietrei și pregătirea secțiunilor de piatră. Pietrele la rinichi au fost colectate de la pacienți și au fost analizate la universitatea orașului Nagoya din Japonia. Cincisprezece mostre de calculi renali de CaOx au fost selectate din miile noastre de colecții de pietre la rinichi umani pe baza informațiilor din spectroscopie în infraroșu în vrac (IR) și au fost pregătite secțiuni subțiri. Compoziția mineralogică în vrac a pietrei a fost estimată cu analiza IR. O metodologie de secționare subțire petrologică, concepută inițial pentru investigații geologice, a fost aplicată acestei investigații de calcul renal55. Probele de pietre la rinichi au fost înglobate în întregime în rășină epoxidică și tăiate. Secțiunea transversală a fost măcinată cu abrazivi (SiC și Al2O3), iar apoi fața lustruită a fost lipită de o lamă de sticlă folosind rășină epoxidică. A fost efectuată oa doua tăietură pentru a face o probă de 1-mm grosime paralelă cu lama de sticlă. Eșantionul a fost apoi lustruit până la o grosime de 20–30 µm și s-a terminat cu lustruire cu șlam de diamant.

Microscopia polarizată și spectrofotometria în infraroșu cu transformă Fourier.Caracteristicile optice ale fiecărui cristal care compun pietrele la rinichi au fost observate prin microscopie polarizată cu secțiuni de fragment de piatră groase de 20–30 µm. Indicele de suprafață al fiecărui plan COD a fost determinat prin compararea observației cu forma tipică a cristalului COD calculată de VESTA56. Pe baza caracteristicilor optice, cristalele au fost clasificate, apoi analizate cu un spectrofotometru în infraroșu cu transformată Fourier (FT/IR6100, JASCO). Intervalul de număr de undă de măsurare a fost de 7800–350 cm-1. Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatura ambiantă. Dimensiunea punctului de măsurare a fost stabilită la 20×20 µm2. Fazele cristaline au fost identificate pe baza spectrului IR obținut cu baza de date RRUFF.

Colorare imunofluorescentă multicoloră a matricei proteice.Secțiunile de piatră utilizate pentru analiza fazelor minerale au fost folosite și pentru analiza distribuțiilor proteinelor cu colorare Multi-IF. Secțiunile subțiri au fost tratate cu o soluție de citrat (pH 6.0) timp de 1 minut pentru o gravare minimă. Secțiunea a fost spălată cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), apoi blocată timp de 60 min în albumină serică bovină 1% în soluție salină tamponată cu fosfat cu Tween 20 (PBST). După blocare, secțiunea a fost incubată cu anticorpi primari peste noapte la temperatura ambiantă. Anticorpii primari utilizați au fost anti-calgranulin A monoclonali de șoarece (diluție 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), anti-osteopontin policlonal de iepure (diluție 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), și fragmentul 1 de protrombină monoclonală anti-umană de oaie (diluție 1:500, Cedarlane Ontario, Canada, CL20111AP). Secțiunea a fost apoi spălată de 3 ori cu PBS timp de 10 minute înainte de incubare cu anticorpi secundari conjugați fluorescent timp de 1 oră, protejată de lumină. Anticorpii secundari conjugați fluorescent utilizați au fost anti-IgG de iepure (H plus L) cu adsorbție încrucișată conjugată cu Alexa Fluor 488, anti-IgG de șoarece (H plus L) cu adsorbție încrucișată conjugată cu Alexa Fluor 546 și IgG anti-oaie (H). plus L) Cross Adsorbed conjugat cu Alexa Fluor 647. După o spălare extinsă de 3 ori cu PBS timp de 10 minute, fluorescența a fost detectată utilizând o microscopie confocală de auto-fluorescență (Nikon A1R). Lungimile de undă de excitare și de emisie colectate au inclus excitația de 487 nm (emisia colectată între 500 și 550 nm), excitația de 561 nm (emisia colectată între 570 și 620 nm) și 639 nm (emisia colectată între 663 și 738 nm) pentru OPN, RPTF 46}} și, respectiv, Cal-A. Auto-fluorescența (AF) a fost observată dintr-o parte a probelor, dar intensitatea semnalului a fost mult mai mică decât semnalele proteice discutate în acest studiu. De asemenea, a fost evaluată legarea anticorpilor care nu sunt specifici proteinelor țintă. Absența semnalelor IF de la anticorpul nespecific a fost confirmată. Au fost efectuate teste de control negativ pentru a evalua absența semnalelor fals pozitive (Fig. S5 suplimentară). Pentru colorarea anticorpilor, au fost utilizate controale de izotip pentru a detecta orice legare nespecifică. În mod specific, anticorpii primari utilizați pentru controale au fost controlul izotipului mAb IgG XP de iepure (DA1E) (semnalizare celulară de diluție 1:100), control al izotipului mAb IgG1 de șoarece (G3A1) (semnalare celulară diluție 1:100) și izotipul IgG mAb de oaie (1) :100 diluție Novus) folosind aceiași anticorpi secundari marcați fluorescent ca mai sus. Profilurile liniei au fost construite cu ImageJ, arătând cel mai înalt și cel mai scăzut punct de contrast ca 100% și, respectiv, 0% pentru fiecare proteină.