Potențialul nefrotoxic al metaboliților presupusi 3,5-dicloranilinei (3,5-DCA) și biotransformarea 3,5-DCA în celulele renale izolate de la șobolani Fischer 344

Pentru a afla mai multe, vă rugăm să contactați:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract:Studiul actual a fost conceput pentru a explora potențialul nefrotoxic in vitro a patru metaboliți 3,5-dicloranilină(3,5-DCA)(3,5-dicloracetanilid,3,5- DCAA;3,5-diclorfenilhidroxilamină,3,5-DCPHA;2-amino{-4,6-diclorfenol,2-A{-4 ,6-DCP;3,5-dicloronitrobenzen,3,5-DCNB) și pentru a determina metabolismul renal al 3,5-DCA in vitro. În testele de citotoxicitate,celule renale izolate(IKC) de la șobolani masculi Fischer 344 (~4 milioane/mL, 3mL) au fost expuși la un metabolit (0-1,5 mM; până la 90 min) sau vehicul. Dintre acești metaboliți, 35-DCPHA a fost cel mai puternic nefrotoxic, cu 35-DCNB intermediar în potențial nefrotoxic.2-A-4,6-DCP și 3,{ {12}}DCAA nu au fost citotoxice. În experimente separate, 35-citotoxicitatea DCNB a fost redusă prin pretratarea IKC cu antioxidanți și citocrom P450, flavin monooxigenază și inhibitori de peroxidază, în timp ce 3,5-citotoxicitatea DCPHA a fost atenuată de două nucleofile.antioxidanti(glutation și N-acetil-L-cisteină). Incubarea IKC cu 3,5-DCA({0.{5-1.{0 mm,90 min) a produs doar 3,5-DCAA și 3,{{12 }}DCNB ca metaboliți detectabili. Aceste date sugerează că 3,5-DCNB și 3,5-DCPHA sunt potențiali metaboliți nefrotoxici și pot contribui la nefrotoxicitatea indusă de 3,5-DCA in vivo. În plus, rinichiul poate bioactiva 3,5-DCNB la metaboliți toxici și 3,5-DCPHA pare să genereze metaboliți reactivi pentru a contribui la 3,5-nefrotoxicitatea DCA. In vitro, N-oxidarea 3,5-DCA pare să fie mecanismul principal de bioactivare a 3,5-DCA la metaboliții nefrotoxici.

Cuvinte cheie:nefrotoxicitate; in vitro; șobolan;3,5-dicloranilină;35-diclorfenilhidroxilamină;3,5-dicloracetanilidă;2-amino-4,6-diclorfenol;3,{{ 9}}dicloronitrobenzen

faceți clic pentru a afla mai multe informații.

1. Introducere

Cloroanilinele sunt intermediari chimici utilizați în mod obișnuit în procesul de fabricație pentru mulți coloranți, substanțe chimice agricole, medicamente și produse chimice industriale. Expunerea la cloroaniline are loc în medii profesionale, prin eliberarea sau formarea acestora în timpul metabolismului mamiferelor a numeroși compuși [1-3] sau prin degradarea mediului înconjurător a pesticidelor[1,4-6]. Detectarea cloroanilinelor în urina sau sângele uman a fost folosită ca biomarker pentru expunerea la pesticidele pe bază de cloroanilină [7-10]. Toxicitatea asociată cu expunerea la cloroaniline include hematotoxicitate (de exemplu, anemie sau methemoglobinemie)[11-13], splenotoxicitate [11,14], hepatotoxicitate [14-17], tulburări endocrine [18] și nefrotoxicitate [16,19] ,20]. Cloroanilinele sunt considerate, de asemenea, poluanți prioritari în studiile de evaluare a riscurilor de mediu din cauza potențialelor efecte adverse asupra sănătății și a eliberării în urma degradării pesticidelor în mediul în zonele agricole [21,22].

Dintre cele trei aniline monoclorurate și șase declorurate, 3,5-dicloranilina (3,5-DCA) este cea mai puternică nefrotoxică in vivo șiin vitro[16,19,23]. Expunerea in vivo la 3,5-DCA la Sprague-Dawley sau Fischer, 344 de șobolani a dus la o concentrație crescută de azot ureic din sânge (BUN), scăderea transportului ionilor organici în celulele tubulare proximale, scăderea greutății rinichilor, proteinurie și hematurie [23,24]. Cele mai severe modificări morfologice apar în celulele tubulare proximale renale, dar celulele tubulare distale și canalele colectoare sunt, de asemenea, afectate de expunerea la 3,5-DCA [23]. Studii suplimentare folosindcelule renale izolate(IKC) de la șobolani masculi Fischer 344 au demonstrat că concentrațiile de 1,0 mm sau mai mari la 35-DCA expunerea timp de 90 de minute duc la creșterea eliberării de lactat dehidrogenază (LDH), o măsură a citotoxicității [25]. ].

Toxicitatea compușilor de anilină in vivo se datorează în principal formării metaboliților toxici. Pe baza studiilor cu anilină și unii dintre derivații săi clorurati, căile de biotransformare pentru acești compuși de anilină au fost clar stabilite și includ N-oxidarea, N-acetilarea și oxidarea inelului fenil [13,26-28]. Deși metabolismul in vivo al 35-DCA nu a fost studiat în detaliu, aceste căi de biotransformare ar putea produce o serie de metaboliți potențial toxici (Figura 1), așa cum se întâmplă cu alte cloroaniline în care au fost efectuate studii de biotransformare [26, 29,30]. Studii recente ale lui Racine et al. [25] au demonstrat că 35-DCA este metabolizat în metaboliți toxici printr-un număr de sisteme enzimatice renale. Cu toate acestea, nu este clar de ce metaboliți sunt produșirinichi.

Un potențial 3,5-metabolit DCA,4-amino-2,6-diclorfenol (4-A-2,6-DCP) , a fost evaluat pentru potențialul nefrotoxic și este un nefrotoxic puternic in vivo și in vitro la șobolani masculi Fischer 344 [31-33]. Un studiu comparativ in vitro al potențialului nefrotoxic, adesea mono-, di- și tricloronitrobenzeni din secțiunile corticale renale, a constatat că 3,5-dicloronitrobenzen (35-DCNB) este cel mai puțin puternic nefrotoxic dintre dicloronitrobenzeni [34] . Până în prezent, nu există studii care să fi explorat potențialul nefrotoxic al altor presupusi metaboliți 3,5-DCA.

Studiul actual a fost conceput pentru a determina potențialul nefrotoxic al a trei metaboliți presupusi 3,5-DCA suplimentari care provin din N-acetilare, (3,5-dicloracetanilid;

3.5-DCAA), N-oxidarea (3,5-diclorfenilhidroxilamină; 35-DCPHA) sau oxidarea inelului fenil ({2-amino{-4,{{ 8}}diclorfenol;2-A-4,6-DCP)(Figura 1) în urma biotransformării extrarenale a 35-DCA. Au fost explorate potențialul nefrotoxic al 3,5-DCNB în modelul IKC și mecanismele sale potențiale de bioactivare. În plus, a fost determinat potențialul radicalilor liberi/metaboliților reactivi de a contribui la citotoxicitatea 3,5-DCPHA. În cele din urmă, a fost efectuat un studiu de biotransformare pentru a stabili în ce măsură 3,5-DCA este biotransformat în IKC de la șobolani masculi Fischer 344 și pentru a determina ce metaboliți se formează.

2. Rezultate

2.1. Relații de citotoxicitate de timp și concentrație pentru 3,5-metaboliți DCA

Pentru a determina potențialul nefrotoxic al fiecărui metabolit presupus de 3,5-DCA, au fost efectuate studii de concentrație și de timp în IKC. Expunerea la 3,5-DCAA nu a crescut semnificativ eliberarea de LDH, un marker de citotoxicitate, în niciun moment (60 sau 90 min) sau concentrația (0-1. 5 mM) testat (Figura 2A). În plus, expunerea la 2-A-4,6-DCP nu a dus la creșteri semnificative ale eliberării de LDH la nicio concentrație testată (până la 1,5 mM) după o expunere de 60 sau 90 de minute ( Figura 2B). Incubarea IKC cu 3,5-DCNB sau 3,5-DCPHA a dus la creșteri dependente de timp și de concentrație ale eliberării de LDH pentru ambii compuși, deși 3,5-DCPHA a indus cele mai mari creșteri ale Eliberarea LDH. Eliberarea semnificativă de LDH a fost observată la 3,5-concentrații DCNB 1,0 sau 1,5 mM sau mai mare după 90 de minute, dar la numai 1,5 mM după 60 de minute (Figura 2C). În schimb,35-DCPHA a indus o creștere semnificativă în eliberarea LDH la 0,25 mM sau mai mare după 60 și 90 de minute, creșterile eliberării LDH observate la 90 de minute fiind semnificativ crescute în comparație cu creșterile respective de 60 de minute ale eliberării LDH (Figura 2D). Prin urmare, dintre metaboliții testați, 3,5-DCPHA a fost cel mai nefrotoxic.

2.2. Biotransformarea renală și 3,5-citotoxicitatea DCNB

Deoarece anilinele și nitrobenzenii pot fi metabolizați unul la altul, au fost concepute studii suplimentare pentru a explora rolulbiotransformarea renalăși radicali liberi în citotoxicitate după expunerea la 1.0 mM 3,5-DCNB timp de 60 min. Pentru a determina rolul potențial al radicalilor liberi în citotoxicitatea 3,5-DCNB, IKC a fost pretratată cu un antioxidant. Pretratarea cu toți antioxidanții (-tocoferol, glutation, ascorbat și N-acetil-L-cisteină; Figura 3) a atenuat în mod semnificativ citotoxicitatea indusă de 3,5-DCNB.

Pentru a explora rolul biotransformării renale în toxicitatea 3,5-DCNB în IKC, s-a utilizat pretratamentul cu inhibitori ai citocromilor P450 (CYPs), monooxigenazele care conțin flavină (FMO) și peroxidazele. Utilizarea inhibitorilor CYP (Figura 4) a arătat că doi inhibitori generali ai CYP (piperonilbutoxid [PiBx]; metiraponă) au atenuat semnificativ citotoxicitatea 3,5-DCNB. Pretratamentul cu inhibitori de FMO (n-octilamină; metimazol) și inhibitorul de peroxidază mercaptosuccinat, a atenuat semnificativ citotoxicitatea 3,5-DCBN (Figura 5). Indometacina, care inhibă activitatea peroxidazei ciclooxigenazei, a avut tendința de a reduce eliberarea LDH indusă de 3,5-DCNB, dar nu a atins o diferență semnificativă (Figura 5).

2.3. Antioxidanți și 3,5-DCPHA Citotoxicitate

Pentru a începe să exploreze rolul radicalilor liberi în 3,5-citotoxicitatea indusă de DCPHA, IKC au fost pretratate cuantioxidanti(glutation, ascorbat sau N-acetil-L-cisteină) înainte de expunerea la 3,5-DCPHA (0,5 mM). Rezultatele arată că, spre deosebire de 3,5-DCNB, 3,{{10}}citotoxicitatea indusă de DCPHA a fost parțial atenuată cu N-acetil-L-cisteină și complet protejată de glutation (Figura 6) ).Ascorbatul (1.0 sau 2.0mM) nu a fost eficient în reducerea citotoxicității 3,{5-DCPHA.

2.4.3,5-Metabolismul DCA de către IKC

Studiile comparative anterioare de citotoxicitate au fost concepute pentru a explora potențialul nefrotoxic al metaboliților presupusi 3,5-DCA produși extern. De asemenea, am examinat modul în care IKC a metabolizat 3,5-DCA pentru a vedea ce metaboliți au fost produși direct de celulele renale. În aceste experimente, IKC au fost incubate fie cu o concentrație netoxică de 3,5-DCA (0,5 mM) fie cu o concentrație citotoxică (1,0 mM) timp de 90 de minute și mostre de mediu și celulele analizate prin HPLC pentru 3,5-DCA și metaboliții săi. Timpii de retenție pentru 3,5-DCA și metaboliții săi, limitele de detectare și coeficienții de extracție sunt prezentate în Tabelul 1 pentru standardele autentice ale 3,5-DCA și fiecare metabolit (4-A{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA și 3 ,5-DCNB).

La ambele concentrații, compusul principal din medii și celule la sfârșitul perioadei de incubare a fost compusul părinte 3,5-DCA. Mai puțin de 5% din 3,5-DCA a fost metabolizat la 3,5-DCAA și 3,5-DCNB (Tabelul 2). Nu au existat dovezi pentru formarea metaboliților amino-clorofenolului neconjugați 2-A-46-DCP sau 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA. nu a fost detectat, ceea ce nu a fost surprinzător, având în vedere natura foarte reactivă a acestui metabolit, dar descoperirea că 3,5-DCNB a fost prezent în medii și celule susține concluzia că 3,5-DCPHA s-a format și apoi oxidat în continuare la 3,5-DCNB.

A existat posibilitatea ca amino-clorofenolii să se formeze, dar să fie metabolizați în conjugați sulfat sau glucuronid. Pentru a determina dacă s-au format conjugați, 3,5-DCA (1,0 mM) a fost incubat cu IKC timp de 45 sau 90 de minute. Cu toate acestea, tratamentul mediilor sau al lizatelor celulare cu arilsulfatază sau -glucuronidază nu a evidențiat niciun 2-A-4,{6-DCP sau 4-A-2,{ {12}}DCP (datele nu sunt afișate). Aceste rezultate sugerează că acești doi metaboliți nu s-au format la niveluri detectabile sau au fost oxidați în continuare la metaboliți reactivi (Figura 1). Cu toate acestea, deoarece a avut loc recuperarea completă a 35-echivalenților DCA, este puțin probabil ca o mare parte, dacă există vreunul, din acești metaboliți să fi fost formați de cătrecelule de rinichi.

2.5. Efectul acidului dietilditiocarbamic (DEDTCA) asupra metabolismului 3,5-DCA

Studiile anterioare au demonstrat că pretratarea IKC cu inhibitori ai CYP2C a redus semnificativ citotoxicitatea 3,5-DCA [25]. Unul dintre cei mai eficienți inhibitori ai toxicității 35-DCA a fost inhibitorul CYP2C DEDTCA. Pentru a examina modul în care DEDTCA a afectat metabolismul 3,5-DCA, IKC au fost pretratate cu DEDTCA (0,1 mM) urmat de {{1{0}}DCA (1,0 mM) pentru un 90 min de incubație. Determinarea nivelurilor de 35-DCA și 3,5-DCA metaboliți a arătat că nivelul total de 3,5-DCA în medii și celule a fost doar ușor crescut, în timp ce formarea de 3,{{ 20}}DCAA și 3,5-DCNB au fost reduse (Tabelul 3). Nu a fost detectat niciun 2-A-4.{6-DCP 4-A{-2,6-DCP sau 3,5-DCPHA, care este de acord cu studiile anterioare (Tabelul 2).

3. Discuție

Un aspect important al acestui studiu a fost determinarea potențialului nefrotoxic al presupusilor metaboliți 3,5-DCA produși extern pe celulele țintă renale. Se preconizează că acești metaboliți se vor forma pe baza metabolismului anilinei și cloroanilinelor (Figura 1)[13.26,28,29]. Am calculat anterior că o doză nefrotoxică de 3,5-DCA la un șobolan Fischer 344 ar produce un nivel sanguin maxim de ~1,25 mM [25]. Astfel, concentrațiile metaboliților sub această concentrație ar putea fi relevante din punct de vedere fiziologic. Rezultatele studiului actual arată că metabolitul rezultat din N-acetilarea 3,5-DCA, 3,5-DCAA poseda un potențial nefrotoxic mult redus în comparație cu 3,5-DCA. Acest rezultat nu este surprinzător și este în acord cu studiile anterioare cu monocloroaniline și metaboliții acestora, care arată că N-acetilarea are ca rezultat metaboliți de cloroacetanilid cu potențial nefrotoxic redus în comparație cu compusul de bază [35,36]. Astfel, N-acetilarea pare a fi o cale de detoxifiere pentru nefrotoxicitatea indusă de cloroanilină, inclusiv 3,5-DCA. În plus, IKC este capabil să metabolizeze 3,5-DCA la 3,{{30} }DCAA (Tabelul 2). Dar, având în vedere potențialul nefrotoxic slab al 3,5-DCAA, este puțin probabil ca acest metabolit să contribuie la nefrotoxicitatea indusă de 3,5-DCA in vitro.

Spre deosebire de 3,5-DCAA, cel puțin un metabolit rezultat din oxidarea inelului fenil al 3,5-DCA induce nefrotoxicitate. Oxidarea 3,5-DCA în poziția 4-produce 4-A{-2,6-DCP (Figura 1), care este un puternic nefrotoxic in vivo și in vitro [31-33]. In vivo, 4-A-2,6-DCP({0,38 mmol/kg,ip) induce nefrotoxicitate marcată la șobolani masculi Fischer 344 caracterizați prin proteinurie, glucozurie, concentrația de azot ureic din sânge (BUN) șirinichigreutatea și necroza tubulară proximală în segmentul S3 [3132].In vitro,4-A-2,{6-DCP a redus absorbția de p-amino hipurat (PAH) și tetraetilamoniu (TEA) la şobolanfelii corticale renalela concentrații de 5 μM și 50 uM, respectiv 【31】și eliberarea crescută de LDH la 50 μM sau mai mare după 2 ore de expunere 【33】. În IKC, sunt necesare concentrații de 250 μM sau mai mari și o expunere de 90 de minute pentru ca 4-A-2,6-DCP să crească eliberarea de LDH. Concentrațiile mai mari necesare pentru a induce citotoxicitatea în acest model se datorează cel mai probabil prezenței albuminei în mediul de incubație pentru IKC, dar nu și în soluția Krebs-Ringer utilizată în studiile de incubare a segmentelor corticale renale. În acest studiu,2-A-4,6-DCP, care rezultă din oxidarea la 2-poziția 35-DCA, nu a crescut eliberarea de LDH la concentrații până la 1,5 mM și o expunere de până la 90, ceea ce indică faptul că 4-A-2,6-DCP a fost mai puternic ca nefrotoxic decât 2-A-4, 6-DCP. Această constatare este în acord cu comparațiile potențialelor nefrotoxice ale altor 4-amino-și 2-aminofenoli[37,38]. Astfel, 4-A-2.{6-DCP pare mai probabil decât 2-A-4,{6-DCP să contribuie la 3,{{38 }}Nefrotoxicitate indusă de DCA in vivo.

În studiile de metabolism IKC3,5-DCA, nici 2-A-4,6-DCA și nici 4-A-2,6- DCA au fost detectați ca metaboliți liberi sau ca glucuronidă sau conjugați sulfat (Tabelul 2). Deși este posibil să se producă cantități mici din acești aminodiclorfenoli, a fost recuperată completă a 3,5-DCA adăugat la incubarea IKC. detectat ca compus de bază plus alți metaboliți (Tabelul 2). Aceste rezultate sugerează cărinichinu formează suficienți metaboliți de amino diclorofenol pentru a contribui la nefrotoxicitatea 3,5-DCA in vitro.

N-oxidarea s-a dovedit a fi o cale importantă de biotransformare a metabolismului anilinei și cloroanilinei, care poate contribui la hepatotoxicitate și, eventual, la alte toxicități, induse de acești compuși [11,39-41]. N-oxidarea unei aniline produce metabolitul fenilhidroxilamină care este oxidat în continuare la metabolitul nitrozobenzen [39] (Figura 1). Metaboliții de fenilhidroxilamină și nitrozobenzen pot redox ciclul pentru a genera radicali liberi și a oxida fierul feros din hemoglobină și alte proteine ​​care conțin fier feric la fier feric. Acest ciclu transformă hemoglobina în methemoglobină în eritrocite, dar poate afecta și activitatea biologică a altor proteine ​​și enzime care necesită o moleculă de fier feros pentru activitatea biologică. Metaboliții nitrozobenzenului sunt, de asemenea, reactivi și se pot lega covalent la nucleofilii de pe macromoleculele din interiorul unei celule [42,43]. Gruparea nitrozo poate fi oxidată în continuare pentru a forma metaboliți nitrobenzen (Figura 1). Studiile anterioare au demonstrat că 3,5-DCA poate induce methemoglobinemie in vivo și că 3,5-DCPHA (Figura 1) este în primul rând responsabil pentru această toxicitate [40,44,45]. Aceste descoperiri sugerează că 3,5-DCPHA este produs extern, cel mai probabil în ficat, și se deplasează în sânge pentru a induce methemoglobinemie, așa cum se întâmplă cu anilina [44,45]. Aceste descoperiri sugerează, de asemenea, că rinichiul este expus la 3,5-DCPHA produs în locații extrarenale.

Formarea 3,5-DCNB de către IKC (Tabelul 2), demonstrează că rinichiul poate forma 3,5-DCPHA din 3,5-DCA. Astfel, rinichiul poate fi expus la 3,5-DCPHA atât din formarea intra-și extra-renală.3,5-DCPHA s-a dovedit a fi cel mai toxic metabolit testat și este probabil ca 3,{ {13}}DCPHA contribuie major la 3,5-nefrotoxicitatea DCA, direct la celulele renale și/sau indirect prin hematotoxicitate. De asemenea, este posibil ca mai multe sisteme enzimatice să fie capabile să formeze 35-DCPHA din 3,5-DCA, iar aceste sisteme enzimatice pot forma, de asemenea, alți 3,5-DCA metaboliți nefrotoxici [46, 47]. S-a demonstrat că N-oxidarea compușilor de anilină este catalizată de CYP, flavin monooxigenaze (FMO),

peroxidaze și prostaglandin sintetaza [48-51]. Studiile anterioare din laboratorul nostru au arătat că 3,5-nefrotoxicitatea DCA în IKC poate fi atenuată de inhibitorii acestor diferite familii de enzime în grade diferite [25], sugerând că inhibarea unei familii de enzime va permite 35- DCA va continua să fie bioactivat de către alte sisteme enzimatice metabolizante. Pentru a determina dacă inhibitorii utilizați de Racine și colab. [25] modificau N-oxidarea 3,5-DCA, a fost examinată capacitatea dietilditiocarbamatului (DEDTCA), un inhibitor al CYP2C și, într-o măsură mai mică, CYP2E1, de a reduce formarea DCNB. DEDTCA a fost selectat pentru studiu deoarece a redus semnificativ citotoxicitatea 3,5-DCA în IKC [25]. Constatarea că DEDTCA a redus formarea de 3,5-DCNB în IKC susține concluzia că DEDTCA a atenuat 3,5-nefrotoxicitatea DCA, cel puțin parțial, prin inhibarea N-oxidării lui 3,{{21} }DCA. Deoarece izoniazida inhibitorului CYP2E1 nu a avut niciun efect asupra citotoxicității 3,5-DCA, se pare că enzimele CYP2C sunt bioactivarea 3,5-DCA la metaboliții toxici prin formarea 3,5-DCPHA.

Citotoxicitatea poate fi produsă in vitro în IKC de către 3,5-DCPHA prin două mecanisme potențiale; ciclu redox pentru a produce radicali liberi (de exemplu, radical anion superoxid) și stres oxidativ sau producție de metabolit(i) de alchilare. Racine și colab. [25] a descoperit că citotoxicitatea indusă de 3,5-DCA în IKC nu se datorează stresului oxidativ. Nivelurile reduse și total de glutation au fost ambele reduse cu 3,5-expunerea la DCA sugerând formarea unui metabolit reactiv. În studiul actual, 35-citotoxicitatea DCPHA a fost redusă de antioxidanții nucleofili (glutation și N-acetil-L-cisteină), dar nu de ascorbatul antioxidant nenucleofil (Figura 6). Aceste rezultate susțin unul sau mai mulți metaboliți reactivi, alchilanți, ai 3,5-DCPHA ca specii citotoxice.

Nitrobenzenii clorurați sunt nefrotoxici in vivo și in vitro [34,52,53]. Rickert și Held [3] au descoperit că microzomii hepatici de la șobolani masculi Fischer 344 metabolizau 3-cloronitrobenzenul prin reducerea grupului nitro pentru a forma 3-cloroanilină, indicând că metabolismul între 3,5-DCA și 3,5-DCNB este reversibil. Astfel, reducerea 3,5-DCNB va produce 3,5-dicloronitrobenzen și 3,5-DCPHA la fel cum oxidarea 3,5-DCA produce acești doi metaboliți. Cu toate acestea, contribuția potențială a nefrotoxicității 3,5-DCNB la 3,5-DCA a fost neclară. Dacă 35-DCNB era un metabolit nefrotoxic, nu era, de asemenea, clar dacă biotransformarea era necesară pentru a produce speciile chimice toxice. Rezultatele actuale susțin 3,5-DCNB ca metabolit toxic3,5-DCA, care poate contribui la nefrotoxicitatea 3,5-DCA în urma biotransformării.

Studiul actual demonstrează că 3,5-DCNB este un nefrotoxic mai puternic decât 3,5-DCA în IKC [25]. În plus, capacitatea antioxidanților și inhibitorilor biotransformării oxidative de a atenua citotoxicitatea 3,5-DCNB reflectă efectele acestor pretratări în reducerea citotoxicității 3,{5-DCA în IKC [25]. Aceste rezultate sugerează că orice 3,5-DCNB format în timpul biotransformării 3,5-DCA are potențialul de a contribui la nefrotoxicitatea 3,5-DCA prin metabolismul 3,5- DCNB fiind convertit înapoi în 3,5-dicloronitrobenzen și 3,5-DCPHA. Cu toate acestea, activitatea slabă a inhibitorilor CYP asupra citotoxicității 3,5-DCNB sugerează că alte sisteme enzimatice (de exemplu, nitroreductaza non-CYP) pot fi responsabile sau pot contribui la reducerea grupului nitro în acest sistem model. . În plus, capacitatea antioxidanților de a atenua semnificativ 3.5-Citotoxicitatea DCNB susține rolul radicalilor liberi derivați din grupa nitro și/sau al speciilor reactive de oxigen/azot în mecanismul nefrotoxic al acestui compus. Având în vedere atenuarea marcată a nefrotoxicității 3,5-DCNB de către unii dintre inhibitorii metabolismului oxidativ (de exemplu, n-octilamină și mercaptosuccinat), este puțin probabil ca 35-DCNB să fie direct toxic pentru celulele renale, dar să producă citotoxicitatea sa prin metaboliți. În plus, studiile in vitro privind metabolismul 3,5-DCA sugerează că celulele renale ar putea să nu producă suficient 3,5-DCNB pentru a fi responsabile de citotoxicitatea 3,5-DCA in vitro. Este posibil ca metabolismul extrarenal al 3,5-DCA să producă suficient 3,5-DCNB pentru a contribui la nefrotoxicitatea indusă de 3,5-DCA in vivo, dar contribuția globală a 3,{{ 46}}DCNB la 3,5-Nefrotoxicitatea DCA va necesita studii suplimentare.

În rezumat, rezultatele acestor studii sugerează că metaboliții amino-odiclorofenol generați extern și metaboliții care decurg din N-oxidare au potențialul de a contribui la nefrotoxicitatea 3.5-DCA in vivo, în timp ce N-acetilarea {{5} }DCA este un mecanism de detoxifiere. In vitro, N-oxidarea 3,5-DCA este mecanismul principal de bioactivare a 3,5-DCA la metaboliții citotoxici, iar toxicitatea este cel mai probabil mediată de 3,5-dicloronitrobenzen și /sau 3,5-DCPHA. În plus, 3,5-nefrotoxicitatea indusă de DCNB se datorează formării metaboliților, iar nefrotoxicitatea 3,5-DCNB este, de asemenea, cel mai probabil mediată cu 3,5-dicloronitrobenzen și/sau 35-DCPHA.

4. Materiale și Metode

4.1.Animale

S-au obținut șobolani masculi Fischer 344 (200-250 g) de la Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, SUA). Animalele au adăpostit doi șobolani per cușcă, cu hrană și apă disponibile ad libitum, cu temperatura (21-23 grade), umiditatea (40-55 procente) și lumina (12 ore pornit/12 ore oprit). Înainte de utilizare, tuturor animalelor li s-a permis cel puțin o săptămână să se aclimatizeze în instituțiile pentru animale acreditate de Asociația Americană pentru Acreditarea Îngrijirii Animalelor de Laborator (AAALAC). Toate utilizarea animalelor a fost aprobată de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Marshall (Protocoalele 447 (5 august 2010) și 531 (1 februarie 2013)), iar experimentele de utilizare a animalelor au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator , adoptat de Institutul Național de Sănătate.

4.2. Produse chimice

Toate substanțele chimice au fost achiziționate la cea mai înaltă puritate disponibilă fie de la Fischer Scientific (Pittsburgh, PA, SUA) fie de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SUA), cu excepția 3,5-diclorfenilhidroxilaminei(3,{{3} }DCPHA), 35-dicloracetanilidă (3.5-DCAA) și 2-amino{-4,6-diclorfenol(2-A{{11 }},6-DCP), care au fost sintetizate în laboratorul nostru. 3,5-DCPHA a fost sintetizat prin reducerea 3,5-DCNB utilizând hidrazină-paladiu pe carbon prin metoda descrisă anterior a lui Rondestvedt și Johnson [54] și purificat așa cum este descris de Valentovic și colab. [55]. Sinteza și purificarea 3,5-DCAA au fost realizate folosind metoda lui Newell și colab. [56]prin reacția în cantități egale de 3,5-dicloranilină și anhidridă acetică în prezență de acetat de sodiu. Pentru a prepara 2-A-4,6-DCP, 2,4-diclorfenol a fost nitrat folosind metoda lui McMillan și colab.[29,57], urmată de reducerea nitro. grupare la o grupare amino cu hidrosulfit de sodiu în hidroxid de sodiu apos 10% conform Newell și colab. [56].

4.3. Prepararea și tratamentul celulelor renale izolate

Celulele renale izolate(IKC) au fost obținute de la șobolani masculi Fischer 344 netrați. Sobolani masculi Fischer 344 au fost selectați ca model pentru a obține celule renale izolate, deoarece majoritatea datelor noastre anterioare de toxicitate cu 3,5-DCA au fost obținute în acest model. Șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital (75 mg/kg, ip) și IKC a fost preparat prin metoda lui Jones și colab.[58] folosind perfuzia de colagenază așa cum este descris de Racine și colab. [25]. Celulele renale izolate prin această tehnică sunt îmbogățite în celule corticale renale pe baza caracterizării biochimice și sunt utilizate frecvent în evaluările de toxicologie renală [59-63]. Viabilitatea celulară inițială a fost determinată a fi de ~ 85-90 procente prin eliberarea de lactat dehidrogenază (LDH) și excluderea albastrului tripan (2 procente w/o). Înainte de incubare, IKC au fost numărate și resuspendate în tampon Krebs-Henseleit (pH 7,37; 25 mM Hepes; 2% w/o albumină serică bovină) la o concentrație de ~ 4,2 milioane de celule/mL. IKC(3 ml) au fost preincubate în baloane Erlenmeyer de policarbonat de 25 ml timp de 5 minute la 37 de grade sub o atmosferă de 95% oxigen/5% dioxid de carbon. După pre-incubare, celulele au fost expuse la diferite concentrații de 3,5-DCNB (0.{5-1,5 mM), 3.5-DCAA ({{32} }.5-1,5 mM),3.5-diclorfenilhidroxilamină (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A{-4,6-DCP （0.{5-1,5 mM）, sau vehicul （30 μL DMSO） pentru până la 90 min.La încheierea perioadei de incubare alocate, au fost prelevate probe (0,5 ml) pentru testul de eliberare a LDH, așa cum s-a descris anterior [20,25].

Pentru a determina rolul luibiotransformarea renalăîn 3,5-citotoxicitatea DCNB și radicalii liberi în35-nefrotoxicitatea DCPHA, IKC au fost pretratate fie cu un antioxidant, fie cu un inhibitor al sistemelor de enzime de biotransformare (Tabelul 4) sau vehicul (30uL DMSO) înainte de expunerea la 1,0mM35-DCNB (60 min) sau 0,5 mM3,5-DCPHA (60 min). Toate concentrațiile și timpii de pretratare aiantioxidantișiinhibitori ai enzimelor renales-au bazat pe studii publicate anterior [20,25].

4.4.IKC Metabolismul 3,5-DCA

4.4.1.Incubările IKC și Izolarea metaboliților

IKC (~4,2 milioane de celule/mL;3 mL) au fost incubate cu 3,5-DCA({0,5 sau 1,0mM) în tampon Krebs-Henseleit (KH) ( pH 7,4) timp de 90 minute într-o baie de apă agitată sub o atmosferă de 95% oxigen/5% dioxid de carbon, așa cum este descris mai sus. Concentrația de 0,5 mM de 3,5-DCA este o concentrație necitotoxică la 90 min, în timp ce concentrația de 1,{0 mM induce citotoxicitate, așa cum este demonstrat de eliberare crescută de LDH. La sfârșitul perioadei de incubare, au fost colectate probe de 1,0 mL, iar mediile și celulele au fost separate prin centrifugare. Celulele granulate au fost spălate cu tampon KH (fără albumină serică bovină) și clătirea a fost adăugată în mediu. Celulele au fost lizate prin sonicare și proteina a fost precipitată prin adăugare de metanol (1,0 ml) la toate probele. Probele au fost centrifugate (3000 g; 10 min 4 grade ） și supernatantul a fost filtrat printr-un filtru de seringă de 0,45 μ și depozitat la grade -20 până a fost analizat prin HPLC așa cum este descris mai jos.

4.4.2. Determinarea conjugaților sulfat și glucuronid

Pentru a determina dacă s-au format conjugați sulfat sau glucuronid, în unele experimente, mediile și fracțiile supernatante celulare obținute așa cum este descris mai sus au fost tratate cu ß-glucuronidază (6500 unități/mL, concentrație finală) sau arilsulfatază (200 unități/mL, concentrație finală) plus saccaharolactonă (20 mM, concentrație finală) timp de 18 ore (37 grade) în tampon acetat 0,1 M (pH5,0) pentru a hidroliza orice conjugați de glucuronidă sau sulfat, respectiv, care s-au format 26] . Hidroliza a fost oprită prin adăugarea de metanol rece (2,4 ml). Fracțiile au fost apoi filtrate și depozitate până când au fost analizate așa cum este descris mai sus.

4.4.3. Inhibarea metabolismului CYP2C de către DEDCTA

Într-un experiment separat, celulele au fost pretratate cu acid dietilditiocarbamat (DEDTCA, 0,1 mM, pretratare de 30 min), un inhibitor de CYP2C, înainte de 3,5-DCA adăugare pentru a determina ce metaboliți au fost scăzuți cu DEDTCA pretratament. După perioada de incubare de 90 de minute, celulele și mediile au fost tratate și stocate așa cum este descris mai sus pentru determinarea concentrațiilor de 3,5-DCA și concentrațiile de 3,5-metaboliți DCA formați.

4.4.4. Determinarea prin HPLC a metaboliților

Probele (75 μL) de mediu și IKC lizat au fost analizate pe un sistem HPLC Waters Alliance e2695 (Waters Co., Milford, MA, SUA), utilizând un detector UV/Vis variabil Waters 2489 la 254 nM. Cromatogramele au fost colectate și integrate folosind software-ul Empower 3 (Waters Co., Milford, MA, SUA). O coloană Waters X Select HSS T3 C18 (3,5 μm; 4,6×150 mm²) echipată cu un Waters XSelect HSS T3 Cartușul VanGuard (3,5 um;3,9×5 mm2) a fost utilizat pentru separarea compușilor. Faza mobilă a constat din metanol 50:5{0; apă cu un debit de 0,75 mL/min. Curbe standard. , limitele de detecție și coeficienții de extracție au fost determinate pentru 3,5-DCA și metaboliți presupuși. Coeficienții de extracție au fost determinați prin compararea integrării unei probe de 1,0 mM3,5-DCA sau a unui eșantion de metabolit care a fost supus eșantionului procesare (adică, adăugarea de metanol și centrifugare) la cea a unei probe neprocesate de 1,0 mM 35-DCA sau metabolit.

4.5. Statistici

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM cu un N de {{0}} experimente separate pe animale, cu excepția N=3 în experimentul de metabolism netoxic 0,5 mM 3,5-DCA. Datele dintre tratamente au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de un test Tukey. Semnificația a fost determinată la p<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Contribuții ale autorului: CRR: revizuirea literaturii, realizarea lucrării, analiza datelor și interpretarea, au contribuit la scrierea lucrării; MAV: proiectare experimentală și interpretare a datelor, DKA:asistat în realizarea lucrărilor și pregătirea lucrării; GOR: revizuirea literaturii, design experimental, interpretarea datelor, a scris și editat lucrarea. Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea: Această cercetare a fost susținută parțial de Institutul Național de Științe Medicale Generale al Institutului Național de Sănătate sub numărul de atribuire P20GM103434 către GOR. Conținutul este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale Institutului Național de Sănătate. .

Declarația Comisiei de revizuire instituțională: Toate utilizarea animalelor a fost aprobată de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Marshall (Protocoalele 447 (5 august 2010) și 531 (1 februarie 2013)), iar experimentele de utilizare a animalelor au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor. Animale de laborator, adoptat de Institutul Național de Sănătate.

Declarație de disponibilitate a datelor: Datele prezentate în acest studiu sunt disponibile la cerere de la autorul corespunzător.

Conflicte de interes: Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Referințe

1. Aizawa, H. Hărți metabolice ale pesticidelor; Academic Press, Inc.: Londra, Marea Britanie, 1989; Volumul 2.

2. Ehlhardt, WJ Metabolismul și dispoziția agentului anticancerigen sulf la șoarece, șobolan, maimuță și om. Drug Metab. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]

3. Rickert, DD; Held, SD Metabolizarea cloronitrobenzenilor de către hepatocite izolate de șobolan. Drug Metab. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]

4. Lee, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kim, JS; Jo, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Kim, JE; Kwon, GS Biodegradarea microbiană și toxicitatea vinclozolinei și a metabolitului său toxic 3,5-dicloranilinei. J. Microbiol. Biotehnologia. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Santos, TCR; Rocha, JC; Alonso, RM; Martinez, E.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Degradarea rapidă a propanilului în culturile de orez. Mediul. Sci. Tehnol. 1998, 32, 3479–3484. [CrossRef]

6. Marlett, VL; Martyniuk, CJ Răspunsuri biologice la erbicidele cu feniluree la pești și amfibieni; noi direcţii de caracterizare a mecanismelor de toxicitate. Comp. Biochim. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2017, 194, 9–21. [CrossRef]

7. Lindh, CH; Littorin, M.; Amilon, A.; Jonsson, BA Analiza 3,5-dicloranilinei ca biomarker al vinclozolinei și iprodionei în urina umană folosind cromatografie lichidă/spectrometrie de masă triplu quadrupol. Rapid Commun. Spectromul de masă. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Kutting, B.; Goen, T.; Schwegler, U.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarylamines in the general population—Un studiu transversal bazat pe populație care include 1004 subiecți bavarez. Int. J. Hyg. Mediul. Sănătate 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Turci, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Determinarea dicloroanilinelor în urina umană prin cromatografie gazoasă/spectrometrie de masă: Protocol de validare și stabilire a valorilor de referință într-un grup de populație care locuiește în centrul Italiei. Rapid Commun. Spectromul de masă. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Turci, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Expunerea profesională și de mediu la pesticide anilide și dicarboximide. G. Ital. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (Supl. 3), 276–277.

11. Chhabra, RS; Thompson, M.; Elwell, MR; Gerken, DK Toxicitatea p-cloranilinei la șobolani și șoareci. Food Chim. Toxicol. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]

12. Guilhermino, L.; Soares, AM; Carvalho, AP; Lopes, MC Efecte acute ale 3,4-dicloranilinei asupra sângelui șobolanilor masculi Wistar. Chemosphere 1998, 37, 619–632. [CrossRef]

13. Pizon, AF; Schwartz, AR; Shum, LM; Rittenberger, JC; Jos, DR; Giannoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Analize de laborator de toxicologie și expunerea umană la p-cloranilină. Clin. Toxicol. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Koenig, CM; Beevers, C.; Pant, K.; Young, RR Evaluarea potențialului mutagen al para-cloranilinei și anilinei în ficat, splină și măduva osoasă a șobolanilor Big Blue® cu analiza micronucleilor din sângele periferic. Mediul. Mol. Mutagen. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovic, MA; Minge, JG; Anestis, DK; Bere, KW; Madan, E.; Hubbard, JL; Rankin, GO Toxicitatea acută renală și hepatică a 2-haloanilinelor la șobolani Fischer 344. Toxicologie 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovic, MA; Minge, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Comparația toxicității in vitro a izomerilor structurali de dicloroaniline. Toxicol. In vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovic, MA; Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO 3, 5-Toxicitatea dicloroanilinei la șobolani Fischer 344 pretratați cu inhibitori și inductori ai citocromului P450. Toxicol. Lett. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]

18. Bhuiyan, MNH; Kang, H.; Kim, JH; Kim, S.; Kho, Y.; Choi, K. Perturbarea endocrinei de către mai mulți derivați de anilină și mecanisme conexe într-o linie de celule H295R suprarenale umane și pești zebra masculi adulți. Ecotoxicol. Mediul. Saf. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]

19. Hong, SK; Anestis, DK; Henderson, TT; Rankin, GO Nefrotoxicitate in vitro indusă de haloanilină: efectele 4-haloanilinelor și 3,5-dihaloanilinelor. Toxicol. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Racine, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Ferguson, T.; Preston, D.; Rankin, GO 3,4,5-Nefrotoxicitatea tricloroanilinei in vitro: Rolul potențial al radicalilor liberi și al biotransformarii renale. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Concise International Chemical Assessment Document 48—4-Cloranilina; Organizația Mondială a Sănătății: Geneva, Elveția, 2003.

22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tajima, T.; Kato, J. Construirea și aplicarea unui bioreporter Escherichia coli pentru detectarea anilinei și cloroanilinei. J. Ind. Microbiol. Biotehnologia. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO Nefrotoxicitate acută indusă de dicloroaniline izomerice la șobolani Fischer 344. Toxicologie 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Rankin, GO; Yang, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Brown, PI 3,5-nefrotoxicitate indusă de dicloroanilină la șobolanul Sprague-Dawley. Toxicol. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Racine, CR; Ferguson, T.; Preston, D.; Ward, D.; Ball, J.; Anestis, D.; Valentovic, M.; Rankin, GO Rolul biotransformării și al stresului oxidativ în 3,5-dicloranilina (3,5-DCA) a indus nefrotoxicitate în celulele corticale renale izolate de la șobolani masculi Fischer 344. Toxicologie 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Hong, SK; Rankin, GO Biotransformarea 2-cloroanilinei la șobolanul Fischer 344: identificarea metaboliților urinari. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]

27. Rankin, GO; Racine, C.; Sweeney, A.; Kraynie, A.; Anestis, DK; Barnett, JB Nefrotoxicitate in vitro indusă de propanil. Mediul. Toxicol. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]