Beneficiile neuroprotectoare ale exercițiului și ale MitoQ asupra funcției de memorie, dinamicii mitocondriale, stresului oxidativ și neuroinflamației la șobolanii îmbătrâniți induși de D-galactoză Partea 2

2.6. Prepararea țesuturilor

După finalizarea a 8 săptămâni de teste TE și comportament de memorie, toți șobolanii au fost eutanasiați prin inhalare de CO2 și țesuturile creierului au fost recoltate de la 7 animale din fiecare grup de tratament.

Testul de comportament al memoriei este un instrument eficient pentru evaluarea memoriei. Odată cu creșterea presiunii sociale și de muncă, memoria oamenilor devine din ce în ce mai importantă. Prin urmare, efectuarea unui test de comportament al memoriei ne poate ajuta să înțelegem nivelul nostru de memorie și să luăm măsuri eficiente pentru a ne îmbunătăți și menține memoria conform rezultatelor testului.

Mai exact, testele de comportament ale memoriei pot evalua capacitatea oamenilor de a primi, procesa, stoca și prelua informații. Prin testarea diferitelor tipuri de informații, cum ar fi limba, numerele, imaginile etc., memoria oamenilor poate fi testată pe deplin. Rezultatele testului vor oferi diferite scoruri pentru a ne ajuta să ne înțelegem punctele slabe și punctele forte și cum să ne întărim memoria.

În practică, multe teste de comportament de memorie oferă, de asemenea, sfaturi și sugestii profesionale. De exemplu, un somn bun, o dietă echilibrată, exerciții fizice adecvate și exerciții regulate pentru creier sunt toate benefice pentru îmbunătățirea memoriei oamenilor. Prin aceste metode, ne putem îmbunătăți timpul de reținere a memoriei, capacitatea de reproducere a memoriei și alte aspecte, pentru a ne adapta mai bine nevoilor vieții de zi cu zi sau muncii.

Pe scurt, un test de comportament al memoriei este foarte util pentru înțelegerea, evaluarea și îmbunătățirea memoriei cuiva. De asemenea, ar trebui să adoptăm metode adecvate pentru a ne întări memoria în funcție de situația noastră actuală, pentru a pune o bază solidă pentru o viață mai împlinită și mai bogată. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche este un material medicinal tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Efectul Cistanche provine din diferitele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid tanic, polizaharide, glicozide flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului în diferite moduri.

Faceți clic pe Cunoașteți memoria pe termen scurt cum să vă îmbunătățiți

După separarea cortexului cerebral și a hipocampului, țesutul cerebral a fost congelat rapid în azot lichid și depozitat la -80 ◦ C până la analiză. Restul de 5 animale au fost utilizate pentru analiza imunohistochimiei (IHC).

După deschiderea cavității toracice, soluția salină tamponată cu fosfat (PBS) 50 mM a fost trecută prin ventriculul stâng timp de 10 minute și apoi animalul a fost perfuzat cu 4% paraformaldehidă (PFA) în 100 mM PBS.

După fixarea perfuziei, creierul a fost recoltat, plasat în PFA 4% și fixat timp de 4 ore la 4 ◦ C. Țesutul cerebral fixat a fost scufundat în soluție de zaharoză 30% timp de 2 zile și apoi tăiat în felii groase de 40 µm folosind un criostat ( Leica Microsystems, Nussloch, Germania).

2.7. Izolarea mitocondriilor

Pentru a izola mitocondriile, am folosit un kit de extracție a mitocondriilor (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pentru fiecare 100 mg de țesut hipocampal, s-a adăugat 1 ml de tampon de omogenizare.

După omogenizare, țesutul a fost centrifugat la 900 x g timp de 10 minute la 4 °C, iar supernatantul a fost colectat și centrifugat din nou la 15, 000 x g timp de 30 de minute la 4 °C.

Luând fracția citosolică centrifugată, citosolul a fost separat, iar peletul rămas a fost amestecat bine în 1 mLof tampon de suspensie, înainte de centrifugare la 15,000×g timp de 10 minute la 4 °C.

Supernatantul a fost îndepărtat și încă 1 mL de tampon de suspensie a fost adăugat înainte de a amesteca bine și de a centrifuga din nou la 15,000xg timp de 10 min la 4 °C.

Supernatantul a fost îndepărtat și peletul rămas a fost dizolvat în 1 ml de tampon complet de liză mitocondrială timp de 30 de minute la 4 °C. Extractul mitocondrial a fost apoi centrifugat la 15,000xg timp de 5 minute la 4◦C, iar supernatantul (fracția mitocondrială) a fost colectat.

2.8. Vest Blotting
Proteina totală obținută prin izolarea mitocondrială a fost cuantificată folosind metoda Bradford. O cantitate egală de proteine ​​mitocondriale (30 pg pe bandă) a fost încărcată în electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) (8% sau 12%).

După electroforeză, proteinele au fost transferate într-o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Millipore, Boston, MA, SUA).

Blocarea a fost efectuată timp de 1 oră la temperatura camerei folosind 1 x soluție salină tamponată cu Tris care conține Tween-20 (TBS-T) cu 5% BSA și apoi membrana a fost reacționată cu anticorpi primari peste noapte la 4 °C.

Au fost utilizați următorii anticorpi primari: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalază și -actină (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SUA, diluție:1 :1000); şi TNF- (Abcam, Cambridge, Marea Britanie, diluţie: 1:1000).

Membranele au fost apoi spălate cu un tampon de spălare (PBS cu 0,1% Tween 20), după care au fost incubate cu peroxidază de hrean (HRP) conjugați cu anticorpi secundari de capră anti-iepure pentru p22 phox, gp91 phox și TNF. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA, diluție: 1:5000).

Anticorpii secundari de capră anti-șoarece conjugați cu HRP au fost utilizați pentru Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalază și -actină (Santa Cruz Biotechnology, diluție: 1:5000).

Nivelurile de expresie a proteinelor au fost detectate folosind sistemul de detectare ECL Western blot (Santa Cruz Biotechnology). Densitățile benzilor de proteine ​​dezvoltate au fost analizate utilizând sistemul de imagistică pe gel ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA).

2.9. Imunohistochimie (IHC)
Pentru analiza IHC, a fost utilizată metoda de plutire liberă pentru țesutul selectat din fiecare grup de tratament. După spălarea țesutului de 3x timp de 10 min fiecare în 0,01 M PBS, țesutul a fost incubat la 80 ◦C timp de 60 de minute într-un pahar care conține citrat de sodiu 0,01 M, urmat de blocare în 10% ser normal de măgar (Millipore Sigma, Burlington, MA, SUA).

Proba de țesut a fost apoi reacționată cu anticorpi primari anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, diluție: 1:500) și proteină acidă fibrilară anti-Glial (GFAP) (Abcam, diluție: 1:500) timp de 12 h la 4 ◦C. În ziua următoare, țesutul a fost spălat de 3x timp de 5 minute fiecare în PBS 0,01 M și apoi a reacționat cu anticorp secundar de capră anti-șoarece conjugat cu HRP (Santa Cruz Biotechnology, diluție: 1:5000) la temperatura camerei timp de 2 ore.

În cele din urmă, țesutul a fost incubat la temperatura camerei folosind o soluție de kit Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SUA), iar rezultatele au fost vizualizate folosind kit-ul de substrat DABPeroxidase (Vector Laboratories).

Fiecare felie de țesut a fost montată pe o lamă utilizând un mediu de montare (Vector Laboratories) și inspectată cu un microscop cu lumină (Leica Microsystems).

2.10. Analize statistice

Datele au fost analizate utilizând SPSS pentru Windows Versiunea 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. Semnificația statistică a fost determinată utilizând ANOVA unidirecțional. Testele post-hoc Bonferroni au fost utilizate pentru comparații multiple. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la p < 0.05.

3. Rezultate

3.1. Efectele exercițiului pe banda de alergare și MitoQ asupra expresiei proteinelor legate de dinamica mitocondrială în hipocampul șobolanilor îmbătrâniți indus de D-Gal

Am verificat că TE și MitoQ au afectat factorii legați de fuziunea mitocondrială (Mfn1, Mfn2, Opa1) și factorii legați de fisiune (Drp1, Fis1) în hipocampul șobolanilor în vârstă (Figura 1).

Nivelurile de expresie ale factorilor legați de fuziunea mitocondrială au diferit semnificativ între grupurile de tratament (Mfn1, F4, 34=134.75{0, p <0.001; Mfn2, F4,34=80). 816, p < 0,001;Opa1, F4,34=51,456, p=0,001).

Nivelurile de expresie ale factorilor legați de fisiunea mitocondrială au diferit, de asemenea, semnificativ între grupurile de tratament (Drp1, F4,34=53.448, p <0.{001; Fis1,F4,34=116 .313, p < 0,001). Rezultatele testului post-hoc sunt prezentate în Figura 1.

În comparație cu grupul Y-CON, expresia factorilor legați de fuziunea mitocondrială a scăzut în grupul D-CON și a arătat tendințe de creștere în grupurile D-TE, D-MI și D-COMBI.

Pe de altă parte, expresia factorului Drp1 legat de fisiunea mitocondrială a crescut în grupul D-CON comparativ cu grupul Y-CON. În timp ce semnalele de fisiune mitocondrială au fost scăzute prin tratamentul combinat cu TE, tratamentul cu MitoQ singur nu a indus o schimbare semnificativă.

Celălalt factor legat de fisiunea mitocondrială, Fis1, a demonstrat aceleași tendințe de scădere ca și Drp1, dar a fost, de asemenea, scăzut doar prin tratamentul cu MitoQ.

Figura 1. Efectul exercițiului pe banda de alergare și al mitochinonei (MitoQ) asupra expresiei proteinelor legate de dinamica mitocondrială în hipocampul șobolanilor în vârstă indus de D-galactoză (D-gal). (A) Western blot reprezentativ de fuziune mitocondrială și proteine ​​legate de fisiune. (B–F) Analiza densitometrică a benzilor Western blot normalizate la -Actin. Datele prezentate în Western blot sunt medii de la șapte creiere de șobolan.

-Actina a fost testată ca un control intern. Testul post hoc Bonferroni a fost utilizat după ANOVA. Valorile sunt medii ± SEM.

a Indică o diferență statistică față de grupul de control tânăr (Y-CON). b Indică o diferență statistică față de grupul D-galactoză (D-CON). c Indică o diferență statistică față de grupul D-galactoză plus exerciții pe bandă de alergare (D-TE).

d Indică diferența statistică față de grupul D-galactoză plus MitoQ (D-MI) (p < 0.05). D-COMBI; D-galactoză plus grupa TE și MitoQ.

3.2. Efectele exercițiului pe banda de alergare și MitoQ asupra exprimării subunităților NADPH oxidază în cortexul cerebral și hipocampul șobolanilor îmbătrâniți indus de D-Gal

Am observat diferențe semnificative între grupurile de tratament în ceea ce privește imunoreactivitatea p22 phox în cortexul cerebral și hipocampul șobolanilor în vârstă (Figura 2) (CA3,F4,24=18.786, p <0.{{11). }}01; cortex, F4,24=12.662, p < 0,001).

În cortex, grupul D-CON a arătat o imunoreactivitate crescută a p22 phox în comparație cu grupul Y-CON, care a scăzut semnificativ în grupurile D-TE, D-MI și D-COMBI.

În CA3, imunoreactivitatea crescută a p22 phox a fost scăzută în grupurile D-TE și D-COMBI comparativ cu D-CON. Nivelurile de exprimare a proteinei ale subunităților NOX p22 phox, gp91 phox și p47phox au diferit semnificativ între grupuri (p22 phox, F4,{{10}}.513, p <0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0,001; F4,34=69.249, p < 0,001).

Rezultatele testului post hoctest au arătat o creștere semnificativă a nivelurilor subunității NOX în D-CON comparativ cu Y-CON. Cu toate acestea, nivelurile subunității NOX au fost mai mici în toate grupurile de intervenție comparativ cu grupul D-CON.

În special, expresia p22 phox și gq91 phox a fost semnificativ scăzută în D-TE comparativ cu grupul D-MI. Aceste descoperiri implică faptul că exercițiile fizice și MitoQ previn în mod individual stresul oxidativ indus de îmbătrânire în creier, dar combinația lor nu are ca rezultat efecte suplimentare.

Figura 2. Efectele exercițiului pe banda de alergare și MitoQ asupra expresiei subunităților NADPH oxidazei în cortexul cerebral și hipocampul șobolanilor în vârstă indusă de D-gal. (A1) Fotomicrografii care arată imunoreactivitatea NAPDH p22 phox în cortexul cerebral și hipocampul șobolanilor în vârstă induși de D-gal din fiecare grup. Dreptunghiurile negre din A1 indică porțiunea imaginilor așa cum se arată în f–i și p–t. (A2, A3) Cuantificarea densității optice a colorării NADPH p22 phox în cortexul cerebral și hipocampus.

Test post-hoc Bonferroni după ANOVA. Valorile sunt prezentate ca medii ± SEM.(n=5 animale). (a–e și k–o) Bară de scară=100 µm, (f–j și p–t) Bară de scară=50 µm. (B) Imagini reprezentative Western blot pentru subunitățile NADPH oxidazei din hipocamp.

(C-E) Cuantificarea subunităților NADPH oxidazei din hipocamp. Datele prezentate în Western blot au fost medii de la șapte creiere de șobolan. -Actina a fost testată ca un control intern. Testul post hoc Bonferroni a fost utilizat după ANOVA. Valorile sunt medii ± SEM.

a Indică o diferență statistică față de grupul Y-CON. b Indică o diferență statistică față de grupul D-CON. c Indică o diferență statistică față de grupul D-TE. (p < 0.05).

3.3. Efectul exercițiului pe banda de alergare și al MitoQ asupra exprimării GFAP în cortexul cerebral și în girusul dentat hipocampal al șobolanilor îmbătrâniți indus de D-Gal

Am observat diferențe semnificative între grupurile de tratament în ceea ce privește imunoreactivitatea GFAP în cortexul cerebral și girusul dintat hipocampal (DG) al șobolanilor în vârstă (Figura 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p <0.001) ; DG, F4,24=30.364).

Rezultatele testului post-hoc au arătat că tratamentul cu D-gal a crescut semnificativ imunoreactivitatea GFAP atât în ​​cortex, cât și în DG.

Comparativ cu grupul D-CON, nivelurile GFAP din cortex au fost scăzute în toate grupurile de intervenție, iar nivelurile GFAP din DG au fost scăzute în grupurile D-TE și D-COMBI, în timp ce grupul D-MI a arătat diferențe numai în imunoreactivitatea GFAP. în regiunea cortexului.

Astfel, deși tratamentul cu TE sau MitoQ a redus neuroinflamația indusă de D-gal în cortex, numai intervenția TE a produs efecte pozitive în DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com