Efectul neuroprotector al extractului Bu-Shen-Huo-Xue împotriva apoptozei induse de glucoză ridicată în celulele PC12

Pentru mai multe informatii:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Studio de cercetare de integrare a medicinei tradiționale și occidentale, primul spital, Universitatea din Beijing, Beijing, China.

2Laboratorul cheie de stat de medicamente naturale și biomimetice, Școala de Științe Farmaceutice, Universitatea Peking, Beijing, China.

Repere

Neurotoxicitatea indusă de glucoză ridicată (HG) este implicată în patologiadiabeticencefalopatie (DE). În studiul nostru, extractul Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), o formulă pe bază de plante, prezintăneuroprotectoractivitatea pe celulele PC12 induse de HG și posibilele mecanisme pot fi asociate cu suprimarea generării de specii reactive de oxigen (ROS), precum și cu căile de semnalizare a caspazei mediate de mitocondrii și JNK/p38 MAPK. Acest studiu oferă un agent promițător pentru tratamentul DE în aplicații clinice.

Click pentru beneficiile extractului de cistanche și Cistanche pentru rinichi

Cistancheeste o planta tonica binecunoscuta care poate hrani si protejarinichi. În teoria medicinei tradiționale chineze,Cistancheeste cea mai buna planta pentrurinichi.Cistancheeste bogat în echinacozide, acteozide și flavonoide. Aceste ingrediente eficiente înCistanchepoate reducerinichiapoptoza celulară şi creşterearinichiproliferarea celulară. Prin urmare,Cistancheeste osupliment natural pentru rinichi.

Abstract

Obiectiv: Să investigheze efectul neuroprotector al extractului de Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), o formulă pe bază de plante, împotriva neurotoxicității induse de glucoză ridicată (HG) în celulele PC12. Metode: Analiza viabilității celulare, testul lactat dehidrogenazei (LDH), detectarea speciilor reactive de oxigen (ROS), Hoechst 33258, colorarea dublă acridină portocalie (AO)/bromură de etidiu (EB) și testul potențialului membranei mitocondriale (MMP). În plus, Bax, Bcl-2, caspaza-3, caspaza scindată{-3, PARP, PARP scindată, citocromul c și protein kinazele activate de mitogen (MAPK) au fost detectate prin Western blot. Rezultate: Extractul de BSHX a crescut viabilitatea celulară și a scăzut scurgerea LDH într-o manieră dependentă de concentrație în celulele PC12 induse de HG. Mai mult, extractul de BSHX a scăzut nivelul de ROS intracelular, a crescut potențialul membranei mitocondriale, a reglat expresiile Bax și Bcl-2 și a inhibat eliberarea citocromului c din mitocondrii. În plus, extractul de BSHX a atenuat activarea caspazei-3 și a PARP și a inhibat fosforilările kinazei N-terminale c-Jun (JNK) și MAPK-urilor p38. Concluzie: extractul de BSHX a prezentat un efect neuroprotector semnificativ asupra apoptozei induse de HG în celulele PC12. Acest efect poate fi asociat cu suprimarea generării ROS, precum și cu căile de semnalizare a caspazei mediate de mitocondrii și JNK/p38 MAPK.

Cuvinte cheie:encefalopatie diabetică, medicina tradițională chineză, extract Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotector, glucoză ridicată

Abreviere: AO: portocaliu de acridină; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Encefalopatie diabetică; DM: Diabet zaharat; DMSO: dimetil sulfoxid; EB: Bromură de etidio; ERK: Protein Kinaze reglate extracelular; HG: Glucoză ridicată; JNK: kinaza N-terminală c-Jun; LDH: Lactat dehidrogenază; MAPK-uri: Protein Kinaze activate de mitogen; MWP: Prescripție Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-bromură de difeniltetrazoliu; PBS: tampon fosfat salin; PBST: Soluție salină tamponată cu fosfat, 0,1 la sută Tween 20; ROS: Specii reactive de oxigen; T2DM: Diabet zaharat de tip 2; MTC: Medicină tradițională chineză

fundal

În ultimii ani, encefalopatia diabetică (DE), o complicație a diabetului zaharat (DM) care apare în sistemul nervos central (SNC), a primit o atenție pe scară largă. DE poate fi asociat cu mai mulți factori de risc, cum ar fi vârsta, durata și controlul glicemic al diabetului [1, 2]. Manifestările clinice ale DE sunt modificări morfologice și fiziologice ale creierului și disfuncția cognitivă rezultată. Hiperglicemia, stresul oxidativ și inflamația cronică pot fi cauzele patogene importante ale DE [3]. Deși un număr tot mai mare de experimente au arătat că hiperglicemia susținută pe termen lung poate accelera îmbătrânirea creierului, patogeneza precisă a DE este neexplorată.

Apoptoza este o moarte celulară programată controlată de gene pentru a menține stabilitatea micromediului. Proteinele implicate în apoptoză includ familia Bcl-2, caspazele, p53 etc. Familia Bcl-2 este împărțită în două categorii, una care promovează moartea celulelor, cum ar fi Bax, iar cealaltă rezistă apoptozei, cum ar fi Bcl-2. Ele pot regla apoptoza prin calea de semnalizare a caspazei, care este o reacție de amplificare în cascadă a substratului de hidroliză finită ireversibilă a caspazei [4-6]. În plus, studiile au arătat că apoptoza indusă de glucoză ridicată (HG) este asociată cu disfuncția mitocondrială, deteriorarea ADN-ului și producția excesivă de specii reactive de oxigen (ROS) [7]. Un studiu pe șoareci diabetici a arătat că protein kinaza (AMPK) activată de adenozină 5’-monofosfat (AMP), un receptor de energie și stres intracelular, ar putea inhiba apoptoza mediată de ROS. Mai mult, dovezile tot mai mari au demonstrat că inhibarea proteinelor kinazelor activate de mitogen (MAPK) ar putea fi benefică pentru inhibarea apoptozei neuronale. Un alt raport a arătat că kinaza N-terminală c-Jun (JNK), protein kinazele reglate extracelular (ERK), căile de semnalizare p38 MAPK pot regla potențial apoptoza neuronală [8,9].

Bazat pe teoria medicinei tradiționale chineze,rinichideficiența de esență și staza sanguină sunt considerate patogeneze de bază a DE. Prin urmare, strategia de hrănirerinichiiar activarea sângelui este utilizată în mod obișnuit în aplicațiile clinice pentru DE. Studiile anterioare ar putea confirma că rețeta modificată Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), o rețetă care vizează hrănirearinichi, poate îmbunătăți afectarea cognitivă și poate proteja neuronii prin reducerea toxicității A [10, 11]. Rețeta Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), în care se adaugă lipitori pe baza MWP, este formulată special pentruhrănirinichiși activează sângele. Studiile recente au arătat că prescripția BSHX poate îmbunătăți sindromul de deteriorare a memoriei la pacienții cu DZ, sugerând proprietăți neuroprotectoare puternice [12]. Cu toate acestea, mecanismul farmacologic detaliat pentru BSHX rămâne neclar. În acest studiu, ne propunem să observăm efectul protector al extractului de BSHX asupra celulelor PC12 induse de HG și să explorăm mecanismele moleculare potențiale.

Metode

Materiale și reactivi

Toate ierburile au fost achiziționate de la Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, China) și autentificate de dr. PF Tu, farmacognosist, conform Farmacopeei Chineze (The Pharmacopeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT) a fost de la Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, SUA). Un kit de analiză a lactat dehidrogenazei (LDH) a fost achiziționat de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng. (Nanjing, Jiangsu, China). Trusa de colorare dublă Acridin Orange (AO)/bromură de etidio (EB) și Hoechst 33258 au fost obținute de la Solar Co., Ltd. (Beijing, China). Un kit de testare a potențialului membranei mitocondriale cu JC-1, 2, 7-diclorofluorescein diacetat (DCFH-DA) a fost achiziționat de la Institutul de Biotehnologie Beyotime (Shanghai, China). Anticorpi primari pentru caspază-3, caspază scindată-3, PARP, PARP scindată, citocrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK și -tubulina au fost obținute de la Cell signaling Technology (Boston, MA, SUA).

Prepararea extractului de BSHX

BSHX constă din șapte componente medicinale (Tabelul 1). Pentru prepararea extractului de BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) și Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) au fost amestecate în proporție de 8:8:4:1:2:1:8 și scufundate într-un volum total de 10 ori (v/w) apă distilată timp de 30 min. , apoi fiert timp de 1 oră și fiert din nou timp de 1 oră într-un volum total de apă distilată de 5 ori (v/w). Supernatanții au fost combinați și uscati prin liofilizare. Extractul uscat final a fost de 25 la sută (g/g) din greutatea ierburilor crude și un exemplar de voucher a fost depus în Centrul de Cercetare Modernă pentru Medicină Tradițională Chineză, Centrul de Științe a Sănătății al Universității Peking, Beijing, China.

Cultură de celule

Liniile celulare de feocromocitom de șobolan (celule PC12) au fost obținute de la Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, China) și au fost crescute în Medium Eagle Modified Dulbecco (DMEM) (Macgene, Beijing, China) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Biowest, Franța). ) și 1% penicilină-streptomicină (100×, Macgene, Beijing, China) într-un incubator umidificat care conține 95% aer și 5% CO2 la 37 de grade.

Tratamentul probei

În testul preliminar, celulele PC12 au fost tratate cu extract de BSHX (20, 50, 100 mg/L) singur timp de 48 de ore pentru a evalua citotoxicitatea. Pentru analiza efectului neuroprotector al extractului de BSHX împotriva neurotoxicității induse de glucoză (HG), celulele PC12 au fost co-tratate cu extract de BSHX (20, 50, 100 mg/L) și HG (75 mM) timp de 48 de ore, urmate de testul MTT pentru viabilitatea celulară. Toate celelalte teste au fost efectuate în aceeași condiție cu intervalul de concentrație a extractului BSHX de la 20 la 100 mg/L.

Test de viabilitate celulară

Celulele PC12 au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri la o densitate de 3,5 × 103 celule per godeu. După incubare cu extract de BSHX (cu sau fără HG) timp de 48 de ore, supernatantul a fost îndepărtat și s-a adăugat soluție MTT (0,5 mg/mL). După incubare la 37 de grade timp de 4 ore, soluția MTT a fost îndepărtată și celulele au fost dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO) pentru agitare 5 min. Densitatea optică (OD) a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de microplăci. Viabilitatea celulară (procent )=[OD (tratament) – OD (martor)]/ [OD (martor netratat) – OD (martor)] × 100 la sută .

Testul LDH

Celulele PC12 au fost cultivate și stimulate la tratament cu extract cu HG și BSHX așa cum s-a descris anterior. Apoi, LDH-ul eliberat din celule a fost detectat folosind un kit LDH comercial conform instrucțiunilor producătorului. Absorbanța a fost măsurată la 450 nm. LDH (U/L)=[OD (tratament) – OD (martor)] / [OD (standard) – OD (martor)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Colorare Hoechst 33258 și colorare AO/EB

Pentru colorarea Hoechst 33258, celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 30 de minute. Apoi celulele au fost spălate cu soluție salină tampon fosfat (PBS) de 3 ori și incubate cu soluție de lucru Hoechst 33258 (1 ug/mL) la întuneric timp de 30 de minute la temperatura camerei. Imaginile au fost capturate folosind un microscop cu fluorescență (IX73, Olympus, Japonia) cu o lungime de undă de excitație de 352 nm/lungime de undă de emisie de 461 nm. Pentru colorarea AO/EB, îndepărtați mediul din 96-plăcile de godeuri și adăugați amestecul AO/EB (100 ug/mL AO și 100 ug/mL EB amestecat) timp de 5 minute la întuneric la temperatura camerei. Apoi celulele au fost spălate cu PBS de 3 ori. Celulele au fost vizualizate folosind un microscop cu fluorescență cu lungimea de undă de excitare 490 nm/lungime de undă de emisie 530 nm pentru colorarea AO și lungime de undă de excitare 520 nm/lungime de undă de emisie 590 nm pentru colorarea EB.

Detectarea ROS intracelular

Pentru detectarea intracelulară a ROS, celulele PC12 au fost însămânțate în plăci de 6-godeuri la o densitate de 5×105 și supuse tratamentului cu extract HG și BSHX timp de 24 de ore. După incubare 24 de ore, celulele PC12 au fost spălate cu mediu de vultur modificat Dulbecco fără ser de 3 ori și adăugate în 10μΜ 2', 7'-diclorofluorescein diacetat (DCF-DA), care este oxidat la 2', 7'-diclorofluoresceină fluorescentă. (DCF) prin hidroperoxizi, la 37 de grade timp de 30 de minute în întuneric. Apoi, celulele au fost spălate cu PBS rece de 3 ori și resuspendate în PBS. Nivelul intracelular de ROS a fost detectat prin măsurarea intensității medii a fluorescenței prin citometrie în flux (BD FACSCaliburTM, SUA). Lungimile de undă de excitație/emisie au fost la 488/525 nm. Au fost numărate minimum 10,000 evenimente per probă. Valorile au fost exprimate ca absorbanță medie normalizată la procentul valorii de control.

Analiza potențialului membranei mitocondriale

Depolarizarea mitocondrială a fost evaluată utilizând un kit comercial JC-1. După ce au fost tratate cu extract de HG și BSHX, celulele au fost incubate cu soluție de lucru JC-1 (1 ×) la 37 de grade timp de 15 minute în întuneric. Apoi, îndepărtați supernatantul și spălați celulele de 2 ori cu soluție tampon JC-1 (1 ×). Celulele au fost vizualizate folosind un microscop cu fluorescență cu lungime de undă de excitație 460 nm/lungime de undă de emisie 530 nm pentru monomerul JC-1 (detectat în celule cu mitocondrii depolarizate) și lungime de undă de excitare 520 nm/lungime de undă de emisie 590 nm pentru JC{{13} }} polimer (prezent în mitocondriile polarizate). Celulele cu fluorescență verde (monomerică) au fost considerate a avea mitocondrii depolarizate; celulele cu fluorescență roșie (polimerică) au fost considerate a avea mitocondrii normale.

Analiza Western blot

Celulele PC12 au fost colectate și lizate în tampon RIPA rece cu un inhibitor de protează cocktail 1 x. Supernatantul a fost colectat prin centrifugare de mare viteză la 12,000 rpm timp de 10 min la 4 grade. Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate prin testul Bradford. Citosolul și fracțiile îmbogățite cu mitocondrii au fost izolate cu Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, SUA) pentru analiza citocromului c. Pentru alte proteine, lizatele totale de celule au fost separate prin SDS-PAGE (10 procente -15 procente) și transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (PVDF). Membranele de fluorură de poliviniliden au fost apoi blocate cu lapte degresat 5% și incubate cu anticorpii primari indicați la 4 grade timp de noapte. Membranele au fost spălate cu PBST (soluție salină tamponată cu fosfat, 0,1 procente Tween 20) de trei ori și incubate cu anticorpi secundari la temperatura camerei timp de 2 ore. Apoi, membranele au fost spălate cu PBST încă de trei ori și vizualizate folosind un substrat chimioluminiscent îmbunătățit și scanate cu sistemul Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, SUA).

analize statistice

Toate valorile sunt exprimate ca medie ± abatere standard (SD). Semnificația diferențelor dintre valorile medii a fost determinată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) utilizând pachetul statistic pentru științe sociale (software SPSS 16.0). P < 0,05="" comparativ="" cu="" grupul="" de="" control="" a="" fost="" considerat="" semnificativ="">

Rezultate

Extractul BSHX protejează celulele PC12 împotriva leziunilor celulare induse de HG

Pentru a investiga dacă extractul BSHX ar putea proteja celulele PC12 de insulta HG, am tratat celulele PC12 cu o gamă de concentrații de extract BSHX (20, 50 și 100 mg/L) timp de 48 de ore în condiții HG (75 mM). Evaluarea viabilității celulare folosind testul MTT a arătat că insulta HG a provocat o scădere semnificativă a viabilității celulelor PC12 (viabilitatea celulelor a fost de aproximativ 56,9 ± 6,7 la sută) și că tratamentul cu extract BSHX a prevenit în mod semnificativ moartea celulelor într-o manieră dependentă de concentrație. Viabilitatea celulelor a crescut la 87,8 ± 9,2 procente atunci când celulele au fost co-tratate cu extract de BSHX (100 mg/L) (Figura 1A). Lactat dehidrogenaza (LDH) este eliberată din celulele deteriorate și, prin urmare, poate fi folosită și ca indicator al toxicității celulare. În concordanță cu rezultatele testului MTT, am constatat că HG insult a crescut semnificativ eliberarea de LDH din celulele PC12 și că tratamentul cu extract de BSHX a prevenit eliberarea de LDH într-o manieră dependentă de concentrație (Figura 1B). Aceste rezultate sugerează că extractul de BSHX crește viabilitatea celulelor. în celulele PC12 induse de HG.

Extractul BSHX inhibă apoptoza celulei PC12 prin calea dependentă de caspază-9/{3-

Pentru a determina efectul extractului BSHX asupra apoptozei celulare, am folosit colorantul ADN Hoechst 33258 ca test sensibil pentru apoptoză. Nucleii celulelor normale colorate cu Hoechst 33258 au prezentat fluorescență albastră uniformă, în timp ce celulele apoptotice care picnoza norului de cromatină nucleară au prezentat particule fluorescente hipercromatice și dense. Procentul de apoptoză a fost calculat în funcție de numărul de celule apoptotice față de numărul total de celule. Datele noastre au arătat că insulta HG (75 mM) a crescut dramatic proporția de celule apoptotice (51,7 ± 4,3 la sută) și tratamentul cu extract BSHX a fost protejat în mod semnificativ împotriva apoptozei induse de HG în celulele PC12 (Figura.2A). Aceste rezultate au fost susținute în continuare de analiza de colorare dublă AO/EB. AO intră atât în ​​celulele normale, cât și în cel apoptotic și emite fluorescență verde, în timp ce EB intră doar în celulele apoptotice și emite fluorescență roșie [13]. Testul AO/EB a arătat că procentul de celule apoptotice a crescut semnificativ după insulta HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 la sută) și a scăzut la tratamentul cu extract BSHX în celulele PC12 (Figura 2B), sugerând că extractul BSHX ar putea eficient. inhibă apoptoza celulelor PC12 indusă de HG.

Apoi, am investigat efectul extractului de BSHX asupra căii caspazei-3/PARP, o cale importantă pentru apoptoza legată de mitocondrii [14]. Western blot a dezvăluit că insulta HG (75 mM) a crescut semnificativ expresiile formelor active de caspază-3 și PARP și a scăzut expresiile caspazei totale-3 și PARP în celulele PC12, iar acest efect a fost inversat semnificativ. prin tratamentul cu extract BSHX (Figura.2C), sugerând că extractul BSHX a protejat eficient celulele PC12 împotriva apoptozei prin reglarea căii caspazei-3/PARP dependente de mitocondrii.

Extractul de BSHX inhibă producția intracelulară de ROS în celulele PC12 induse de HG

Deoarece HG ar putea îmbunătăți formarea de ROS intracelular [15], am testat nivelul de ROS intracelular pentru a determina dacă extractul de BSHX ar putea inhiba generarea de ROS. A existat o creștere de 3,23-ori a intensității medii a fluorescenței observată în celulele PC12 care au fost expuse la 75 mM HG timp de 48 de ore în comparație cu martor. În schimb, co-tratamentul cu extract de BSHX a scăzut semnificativ intensitatea medie a fluorescenței la aproximativ 0.76-, 0.{{10}} și 0.{ {12}} ori a grupului model, respectiv, indicând faptul că extractul de BSHX ar putea inhiba producția de ROS indusă de HG (Figurile 3A, B).

Extractul de BSHX menține homeostazia mitocondrială în celulele PC12 induse de HG prin reglarea expresiei Bax și Bcl-2

Potențialul membranei mitocondriale este un parametru important al funcției mitocondriale utilizat ca indicator al sănătății celulelor. JC-1 este un colorant lipofil, cationic, care poate intra selectiv în mitocondrii și poate schimba reversibil culoarea de la verde la roșu pe măsură ce potențialul membranei crește. În celulele sănătoase cu potențial mare de membrană mitocondrială, JC-1 formează spontan complexe cunoscute sub numele de agregate J cu fluorescență roșie intensă. Pe de altă parte, în celulele apoptotice cu potențial scăzut al membranei mitocondriale, JC-1 rămâne în formă monomerică, care prezintă doar fluorescență verde [16, 17]. Raportul dintre fluorescența verde și fluorescența roșie poate reflecta, prin urmare, depolarizarea mitocondrială. În studiul nostru, numărul de celule cu mitocondrii depolarizate (fluorescență verde) a crescut semnificativ după HG (75 mM) timp de 48 de ore, iar această creștere a fost inversată prin tratamentul cu extract BSHX într-o manieră dependentă de concentrație (Figura.4A).

Apoi am detectat distribuțiile mitocondriale și citoplasmatice ale citocromului c, un jucător cheie în calea de activare a apoptozei dependente de caspază. Am descoperit că insulta HG (75 mM) timp de 48 de ore a indus o translocare dramatică a citocromului c din mitocondrie în citoplasmă, iar această relocare a fost prevenită semnificativ prin tratamentul cu extract BSHX (Figura 4B), indicând că extractul BSHX ar putea inhiba eliberarea de citocromul c din mitocondrii.

În plus, proteinele familiei Bcl-2 sunt regulatori importanți ai diferitelor căi apoptotice. Bcl-2 poate inhiba apoptoza celulară cauzată de o varietate de factori citotoxici și este inhibitorul eliberării citocromului c din mitocondrii în citoplasmă. Cu toate acestea, Bax, ca membru al familiei Bcl-2, este un factor pro-apoptoză. Când este indusă apoptoza, Bax migrează din citoplasmă în mitocondrii și distruge integritatea mitocondrială [5, 18]. În studiul nostru, nivelul proteic al Bcl-2 a fost reglat în jos și Bax a fost reglat în sus de HG (75 mM) insultă timp de 48 de ore, acest efect a fost inversat în funcție de concentrație de extractul BSHX (Figura 4C). Toate aceste rezultate de mai sus au sugerat că extractul de BSHX a protejat celulele PC12 împotriva depolarizării mitocondriale induse de HG prin reglarea expresiei Bax și Bcl-2.

Efectul extractului BSHX asupra apoptozei celulare prin căile de semnalizare MAPK JNK/p38

Unele studii au arătat că producția crescută de ROS a fost asociată cu activarea căilor MAPK, pentru a declanșa apoptoza celulară9 [19, 20]. Așa că am investigat efectul extractului de BSHX asupra căii de semnalizare a proteinei kinazei activate de mitogen (MAPK) pentru a determina dacă extractul de BSHX ar putea atenua apoptoza indusă de HG. După cum se arată în Figura 5, insulta HG (75 mM) timp de 48 de ore a crescut fosforilările c-Jun NH2-kinazei terminale (JNK) și p38 în celulele PC12, care au fost inhibate semnificativ de extractul BSHX într-o concentrație - mod dependent. Cu toate acestea, un rezultat similar nu a fost observat cu proteina kinază reglată extracelulară (ERK) MAPK. Rezultatele sugerează că extractul de BSHX ar putea inhiba apoptoza celulară indusă de HG prin căile de semnalizare MAPK JNK/p38.

Discuţie

Encefalopatia diabetică (DE) este o complicație frecventă a diabetului zaharat de tip 2 (T2DM). Poate provoca afectarea cognitivă a creierului și este un important factor de risc de mortalitate și dizabilitate la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 din întreaga lume [3]. Astfel, este esențial să se studieze mecanismul DE, precum și strategiile sale de prevenire și tratament.

În China, medicamentele tradiționale chinezești (MTC) au fost folosite pentru tratamentul DZ de mulți ani și au demonstrat un efect curativ. Unele studii clinice sugerează că MTC-urile bazate pe hrănirea rinichilor și strategiile de activare a sângelui pot regla în jos glicemia, promova circulația și îmbunătățește disfuncția cognitivă a creierului. Rețeta BSHX este un reprezentant al acestor TCM. Studiul nostru clinic preliminar a arătat că prescripția BSHX ar putea ameliora eficient glicemia, homocisteina (HCY) și proteina C-reactivă de înaltă sensibilitate (hs-CPR) în ser și poate îmbunătăți funcția cognitivă a pacienților diabetici cu deficiență cognitivă ușoară (MCI) [12]. Cu toate acestea, există o lipsă de dovezi care să demonstreze eficiența și mecanismul farmacologic de până acum.

În acest studiu, am descoperit că extractul de BSHX ar putea atenua reducerea viabilității celulare indusă de HG, măsurată prin testul MTT, LDH. Pentru a explora în continuare efectul protector al extractului de BSHX asupra viabilității celulare, am studiat apoptoza prin Hoechst 33258 și analiza colorării AO/EB. Rezultatele au arătat că extractul de BSHX ar putea reduce semnificativ apoptoza indusă de HG. Ca marker al apoptozei, caspaza-3 și PARP au fost semnificativ crescute după tratamentul cu HG, dar activarea acestor factori pro-apoptotici a fost inhibată de extractul BSHX într-o manieră dependentă de concentrație. Rezultatele de mai sus au indicat că extractul de BSHX a avut un efect protector asupra deteriorării celulelor PC12 induse de HG.

ROS se formează în timpul procesului de fosforilare oxidativă a celulelor, iar creșterea sa în producție sau deteriorarea sistemelor antioxidante poate duce la stres oxidativ în celule [21]. Studiile au arătat că glucoza ridicată ar putea da naștere la acumularea de ROS intracelular și în cele din urmă la o cale activă de semnalizare apoptotică. Iar mecanismul comun al complicațiilor diabetului este stresul oxidativ [22, 23]. Rezultatele noastre au arătat că glucoza ridicată ar putea duce la creșterea ROS în celulele PC12, ceea ce a fost în concordanță cu studiile anterioare [24]. Se speculează că toxicitatea glucozei ridicate pentru celule poate fi obținută prin apoptoza indusă de ROS. Mitocondriile sunt locurile majore ale producției intracelulare de ROS și, de asemenea, organul țintă major pentru atacul ROS [25]. În condiții patologice, creșterea rapidă a ROS poate duce la disfuncția mitocondrială, colapsul potențialului membranei mitocondriale și în cele din urmă duce la apoptoza celulară [26]. Așa că am detectat integritatea mitocondriilor. Rezultatele noastre au arătat că glucoza ridicată a scăzut semnificativ potențialul membranei mitocondriale, a crescut raportul Bax/Bcl-2 care a controlat comutarea porului de tranziție a permeabilității mitocondriale (MPTP) și a promovat scurgerea citocromului c, în timp ce extractul de BSHX ar putea inversează aceste modificări. Acestea sugerează că neuroprotectorul extractului de BSHX împotriva celulelor PC12 induse de HG poate rezulta din menținerea integrității mitocondriilor.

Calea de semnalizare MAPK joacă, de asemenea, un rol important în apoptoza celulară. JNK, ERK și p38 MAPK sunt cei mai studiati membri ai familiei MAPK. Principala lor modalitate de acțiune este fosforilarea situsurilor lor specifice, reglând astfel apoptoza celulară [8, 27, 28]. Mai mult, studiile au demonstrat că producția excesivă de ROS poate declanșa fosforilarea p38MAPK [29-31], iar ROS poate induce sau media activarea căilor MAPK [32]. Mai mulți stimuli celulari care induc producția de ROS și în paralel pot activa căile MAPK în mai multe tipuri de celule [32, 33]. Mecanismele potențiale pentru activarea MAPK de către ROS pot include inactivarea și degradarea fosfatazelor MAPK care mențin calea într-o stare inactivă [19]. Pe de altă parte, pentru a confirma în continuare dacă căile MAPK au fost activate de generarea ROS, celulele au fost pretratate cu antioxidanți (de exemplu, NAC, un captator de ROS) pentru a preveni acumularea ROS. Și rezultatele au arătat că activarea MAPK a fost aproape inhibată după stimularea celulară cu stimuli celulari [32, 33], indicând implicarea inactivării ROS a căilor MAPK. În plus, studiile au arătat că atunci când celulele au fost tratate cu inhibitorul specific JNK SP600125, apoptoza indusă de Cardiotoxina III ar putea fi blocată [34]. Studiul nostru anterior a constatat că prescripția modificată de Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) ar putea inhiba activarea ERK/p38 MAPK în microglia BV2 activată A [10]. Cu toate acestea, în acest studiu, am descoperit că extractul de BSHX ar putea inhiba fosforilarea JNK și p38 MAPK și nu am obținut același rezultat cu p-ERK. Speculăm că lipitorile joacă un rol diferit în extractul BSHX. Rezultatele sugerează că un alt mecanism de protecție al extractului de BSHX împotriva apoptozei în celulele PC12 induse de HG poate fi prin reglarea căilor de semnalizare MAPK JNK/p38.

Concluzie

Extractul de BSHX, o formulă polierbală, prezintă efecte neuroprotectoare asupra celulelor PC12 împotriva insultei HG. Extractul BSHX a inhibat eficient apoptoza celulelor PC12 indusă de HG prin scăderea generării intracelulare de ROS, menținerea integrității membranei mitocondriale și blocarea căilor de semnalizare a caspazei -3 și JNK/p38 MAPK (Figura.6). În mod colectiv, descoperirile noastre sugerează că extractul de BSHX este un agent promițător pentru tratamentul DE în aplicații clinice.

Contribuții ale autorului

Au conceput și proiectat experimentele: Zeng KW, Wang XM. A realizat experimentul: Zhao SY. S-au analizat datele: Zhao SY, Zeng KW și Wang XM. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW și Wang XM. A scris tatăl: Zhao SY.

Referințe

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Creierul diabetic și cogniția. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Leziuni cerebrale cu diabet zaharat: dovezi, mecanisme și implicații ale tratamentului. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Teoria „memoriei metabolice” și tratamentul precoce al hiperglicemiei în prevenirea complicațiilor diabetului. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Potențialul membranei mitocondriale (Δψm) în apoptoză; o actualizare. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Conectarea dinamicii mitocondriale și a evenimentelor de viață sau de moarte prin proteinele familiei Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitocondriile și moartea celulară. Aspecte mecaniciste și probleme metodologice. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S și colab. 1,25-(OH)2D3 inhibă apoptoza ridicată indusă de glucoză și producția de ROS în celulele mezoteliale peritoneale umane prin calea MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Pretratamentul factorului de creștere nervoasă atenuează activarea kinazei 1 amino-terminale c-Jun indusă de privarea de oxigen și glucoză și activarea kinazelor p38 și p38 activate de stres și conferă neuroprotecție în modelul feocromocitom PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J și colab. Implicarea caspazei-3 și a proteinei kinazei activate de mitogen p38 în apoptoza indusă de clorură de cobalt în celulele PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Efectele antineuroinflamatorii ale prescripției Wu-Zi-Yan-Zong modificate în microglia BV2 stimulată cu amiloid prin căile de semnalizare NF-κB și ERK/p38 MAPK. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, și colab. Prescripția modificată Wu-Zi-Yan-Zong, o formulă tradițională chineză pe bază de plante, suprimă procesele neuroinflamatorii induse de lipopolizaharide în astrocitele de șobolan prin căile de semnalizare MAPK NF-κB și JNK/p38. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, și colab. Efectul prescripției Bushen Huoxue asupra tratamentului tulburărilor cognitive ușoare ale diabetului de tip 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Analiza apoptozei induse de cicloheximidă în leucocite umane: microscopie cu fluorescență utilizând anexină V/iodură de propidiu versus portocaliu de acridină/bromură de etidio. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Caspazele conectează semnalul de moarte celulară cu homeostazia organismului. Imunitatea 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Oxidul nitric: un factor cheie din spatele disfuncționalității celulelor progenitoare endoteliale în diabetul zaharat de tip-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: lungimile de undă alternative de excitare facilitează citometria potențialului membranei mitocondriale. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Sondele de potențial al membranei mitocondriale și gradientul de protoni: un ghid practic de utilizare. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green DR. Cum induc proteinele BCL-2 permeabilizarea membranei exterioare mitocondriale? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH și colab. Protein kinazele activate de mitogen și speciile reactive de oxigen: cum poate ROS să activeze căile MAPK? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F și colab. Esterii heterociclici aromatici ai podofilotoxinei exercită activitate anti-MDR în celulele leucemiei umane K562/ADR prin calea de semnalizare ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Direcționarea glicogen sintaz kinazei-3 pentru beneficii terapeutice împotriva stresului oxidativ în boala Alzheimer: implicarea căii Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Rolul stresului oxidativ în neuropatia diabetică: generarea de specii de radicali liberi în reacția de glicație și polimorfismele genelor care codifică enzimele antioxidante la sensibilitatea genetică la neuropatia diabetică în populația pacienților cu diabet de tip I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Moartea celulară, specii reactive de oxigen (ROS) și complicații diabetice. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD și colab. Ginkgolida B inhibă apoptoza în celulele endoteliale ale venei ombilicale umane stimulate cu glucoză ridicată. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Rolul dăunător al superoxid dismutazei în spațiul intermembranar mitocondrial. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, etaj KB. Protein kinaze activate de mitogeni: noi căi de semnalizare care funcționează în răspunsurile celulare la stresul mediului. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X și colab. MiR-125b acționează ca o oncogenă în celulele de glioblastom și inhibă apoptoza celulară prin căi independente de p53 și p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H și colab. Produsele finale de glicație avansată induc apoptoza celulelor epiteliale corneene umane prin generarea de specii reactive de oxigen și activarea căilor JNK și p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH și colab. Grelina inhibă apoptoza în celulele neuronale hipotalamice în timpul privării de oxigen-glucoză. Endocrinologie 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A modifică proteinele de reglare a ciclului celular și induce apoptoza prin activarea p38MAPK dependentă de speciile de oxigen reactiv în linia celulară de cancer de sân uman MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L și colab. Leziunea oxidativă indusă de ROS implicată în patogenia cheratitei fungice prin activarea p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Activarea indusă de specii reactive de oxigen a căilor de semnalizare a kinazei MAP. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Semnalizarea redox și căile MAP kinazei. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxina III induce apoptoza dependentă de kinaza N-terminală c-jun în celulele leucemice umane HL-60. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.