Potențialul neuroprotector al izotiocianaților într-un model in vitro de neuroinfamation
Mar 27, 2022
A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1
Primit: 10 iulie 2020 / Acceptat: 25 octombrie 2020 / Publicat online: 16 noiembrie 2020
© Autor(i) 2020
Funcția de pulbere din plante Cistanche: are un foarte bunefect neuroprotector
Abstract
Izotiocianații (ITC), prezenți ca precursori de glucozinolat în legumele crucifere, au demonstratantiinflamator, activități antioxidante și anticancerigene. Aici, am comparat efectele a trei ITC-uri diferite asupra producției de ROS și asupra expresiei metaloproteinazei matriceale (MMP)-2 și -9, care reprezintă factori patogenetici importanți ai diferitelor boli neurologice. Culturile primare de astrocite de șobolan au fost activate de LPS și tratate simultan cu diferite doze de izotiocianat de alil (AITC), 2-izotiocianat de fenetil (PEITC) și 2-sulforafan (SFN). Rezultatele au arătat că SFN și PEITC au fost capabile să contracareze producția de ROS indusă de H2O2. Analiza zimografică a supernatantilor culturii celulare a evidențiat că PEITC și SFN au fost cei mai eficienți inhibitori ai MMP-9, în timp ce numai SFN a inhibat semnificativ activitatea MMP-2. Analiza PCR a arătat că toate ITC-urile utilizate au inhibat semnificativ atât expresia MMP-2, cât și MMP-9. Investigația asupra căii de semnalizare a proteinei kinazei activate de mitogen (MAPK) a demonstrat că ITC-urile modulează transcripția MMP prin inhibarea activității protein kinazei reglate extracelular (ERK). Rezultatele acestui studiu sugerează că ITC-urile ar putea fi agenți nutraceutici promițători pentru prevenirea și tratamentul complementar al bolilor neurologice asociate cu implicarea MMP.
Cuvinte cheieAntioxidant · Antiinflamator · Izotiocianat · Metaloproteinaze ale matricei · Boli neurodegenerative
Introducere
Neuroinflamația este un răspuns complex la leziuni cerebrale care implică o cascadă de evenimente biochimice care conduc la activarea celulelor rezidente ale sistemului nervos central (SNC). Activarea aberantă a astrocitelor compromite rolul lor neuroprotector, ducând la eliberarea de mediatori inflamatori, cum ar fi speciile reactive de oxigen (ROS), oxidul nitric (NO), citokinele, chemokinele și metaloproteinazele matriceale.
(MMP-uri).
MMP-urile sunt o familie mare de endopeptidaze neutre, dependente de Zn2 plus, care au ca ținte majore componentele matricei extracelulare (ECM), cum ar fi fibronectina, colagenul, elastina și laminina (Latronico și Liuzzi 2017).
Tiziana Latronico
tiziana.latronico@uniba.it
Departamentul de Bioștiințe, Biotehnologii și Biofarmaceutică, Universitatea din Bari „Aldo Moro”,
Bari, Italia
Departamentul de Științe, Universitatea din Basilicata, Potenza,
Italia
În SNC, MMP-urile sunt implicate în diferite răspunsuri fiziologice, cum ar fi morfogeneza, turnover-ul și remodelarea ECM, embriogeneza și repararea rănilor; cu toate acestea, atunci când MMP-urile scapă de mecanismele de reglementare, ele devin dăunătoare (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).
În acest sens, se știe că modificările în expresia și activitatea MMP sunt evenimente patogenetice cheie în mai multe tulburări neurologice (Latronico și Liuzzi 2017; Mastroianni și Liuzzi 2007; Brkic și colab. 2015). Dovezile experimentale au sugerat că printre MMP, gelatinazele A (MMP-2) și B (MMP{-9) sunt implicate în mod deosebit în neuroinflamație, deoarece reglarea lor ascendentă poate compromite integritatea barierei hemato-encefalice (BBB). Acest lucru duce la creșterea recrutării și infiltrarea celulelor imune din sângele periferic în parenchimul cerebral, perpetuând procesul inflamator care este cauza pierderii neuronale progresive și a funcției neuronale afectate (Rivest 2009). Mai multe studii in vitro și in vivo au arătat că producția de ROS este unul dintre factorii implicați în reglarea exprimării MMP-9 în celulele creierului prin mecanisme dependente de calea de semnalizare a proteinei activate de mitogen (MAPK) (Hsieh și Yang 2013).
Pe baza acestor dovezi, este clar că reglarea în jos a factorilor neurotoxici, care duce la răspunsuri neuroinflamatorii reduse, poate reprezenta o strategie terapeutică eficientă pentru a preveni apariția sau a atenua progresia bolilor cerebrale.
În ultimii ani, interesul biomedical în domeniul neurologic este din ce în ce mai concentrat pe cercetarea compușilor naturali capabili să moduleze procesele asociate cu răspunsurile neuroinflamatorii. În acest sens, mai multe studii au arătat că compușii fitochimici, cum ar fi polifenolii, izotiocianții (ITC) și alții, au potențial neuroprotector care derivă și din capacitatea lor de a inhiba expresia MMP-urilor și de a contracara producția de ROS (Dinkova-Kostova și Kostov). 2012; Liuzzi et al. 2007, 2011).
Izotiocianații sunt metaboliți produși de mai multe plante aparținând familiilor Brassicaceae ca sistem de apărare împotriva atacului patogenului (Bones și Rossiter 2006). Acestea provin din degradarea enzimatică a glucozinolaților (GSL) de către enzima mirozinaza. ITC-urile sunt prezente în legumele crucifere consumate în mod obișnuit, cum ar fi broccoli, varza de Bruxelles, varza, napul, hreanul, guli-rabe, muștarul, ridichile, cresonul și varza kale. Cantitățile lor în alimente sunt foarte variabile și depind de prelucrarea și prepararea alimentelor.
Recent, s-a demonstrat că ITC-urile posedă o varietate de efecte terapeutice, inclusiv acțiune antioxidantă, antibacteriană, antiinflamatoare și chimiopreventivă (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).
Activitatea protectoare a ITC este realizată prin modularea diferitelor căi de semnalizare implicate în detoxifiere, inflamație, apoptoză și reglarea ciclului celular. Mai multe dovezi indică faptul că proprietățile anticancerigene și antiinflamatorii ale ITC-urilor ar putea fi atribuite în principal capacității lor de a activa calea factorului 2 (Nrf2) asociat factorului nuclear eritroid 2-. Nrf2 este un factor transcripțional redox-sensibil care în prezența agenților electrofili și a condițiilor de stres oxidativ se translocă în nucleu unde leagă elementele de răspuns antioxidant (ARE), inducând expresia genelor citoprotectoare implicate în detoxifiere și în modularea condițiilor oxidative și procesele inflamatorii (Heiss et al 2001). În acest sens, s-a raportat că ITC-urile sunt capabile să crească capacitatea antioxidantă a celulelor umane prin inducerea expresiei enzimelor de detoxifiere de faza II și prin reglarea în sus a producției de GSH (Wagner et al 2010). Mai mult, s-a raportat existența unei discuții între Nrf2 și calea factorului nuclear (NF)-κB care are ca rezultat modularea inflamației (Sturm și Wagner 2017; Lee și Johnson 2004). În acest sens, diverse modele experimentale in vitro și in vivo de neuroinflamație au demonstrat că ITC-urile sunt capabile să scadă semnificativ translocarea NF-kB cu inhibarea consecventă a citokinelor proinflamatorii și a MMP-urilor (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).
În această lucrare, am investigat efectul a trei ITC, adică izotiocianatul de alil (AITC), 2-izotiocianatul de fenetil (PEITC) și 2-sulforafanul (SFN) asupra eliberării de MMP-2 și -9 precum și asupra producției de ROS de către astrocitele activate de LPS. Rezultatele noastre au demonstrat că PEITC, SFN și AITC sunt capabile să inhibe in vitro expresia MMP-9 și MMP{-2 în astrocitele activate de LPS și să contracareze producția de ROS indusă de H2O2. În plus, am demonstrat că ITC-urile modulează supraexprimarea MMP-urilor cu mecanisme legate de inhibarea activității protein kinazei reglate extracelular (ERK). Aceste rezultate sugerează că o dietă bogată în legume crucifere poate avea potențiale beneficii pentru prevenirea și tratamentul complementar al bolilor neurologice.
Materiale și metode
Produse chimice și reactivi
Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin (FBS), penicilina și streptomicina au fost furnizate de GIBCO (Paisley, Scoția). Gelatina, ADNază 1, poli-L-lizină
(PLL), tripsină, lipopolizaharidă (LPS), albastru tripan și 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2.5-bromură de difeniltetrazoliu (MTT) ), izotiocianat de alil (AITC) [cod. 377.430, puritate 95 procente (HPLC)], 2-Izotiocianat de fenetil (PEITC) [cod. 253.731, puritate 99 la sută )], 2-Sulforafan (SFN) [cod. S6317, puritate mai mare sau egală cu 95 la sută (HPLC)] au fost furnizate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). Diacetatul de 2′,7′-diclorofluoresceină (DCFH-DA) a fost achiziționat de la Calbiochem. Proteinele standard și R-250 Coomassie Brilliant Blue au fost de la Bio-Rad (Hercules, CA, SUA). Anticorpii anti-proteina acidă fibrilară glială (GFAP) (RRID: AB_2294571) au fost achiziționați de la Serotec (Oxford, Marea Britanie). Anticorpii împotriva protein kinazelor reglate extracelular (ERK) 1/2 și ERK 1/2 fosforilat (p-ERK 1/2) au fost de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membranele Hybond-P PVDF, sistemul de analiză Western Blotting cu chemiluminiscență îmbunătățită (ECL) și anticorpul secundar anti-șoarece-HRP au fost de la GE
Științe ale vieții din domeniul sănătății (Little Chalfont, Buckinghamshire,
Regatul Unit). Perechile de primeri specifice pentru MMP-2, MMP-9 și ARNr 18S au fost de la Sigma Genosys (Cambs, Marea Britanie). Kitul RNeasy mini și trusa de transcripție inversă QuantiTect au fost achiziționate de la Qiagen (Valencia, CA, SUA). Reactivii Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix pentru PCR au fost achiziționați de la Lucigen Corporation (Middleton, WI, SUA).
Declarație de etică
Experimentele care implică animale au fost efectuate conform recomandărilor din Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Bari, Italia (Numărul permisului: 23-98- A).
Prepararea culturilor de astrocite
Astrocitele au fost preparate din țesuturile neocorticale de {{0}}șobolani Wistar de o zi (RRID: RGD{_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Italia). Pentru prepararea astrocitelor s-au folosit 6 pui a cate 12 pui, fiecare de ambele sexe. Animalele au fost eutanasiate prin expunere la dioxid de carbon (CO2) și ucise prin decapitare rapidă. Țesuturile neocorticale au fost disecate și utilizate pentru purificarea culturilor de celule gliale primare urmând metoda raportată de Latronico și colab. (2018). Pe scurt, după disecție, creierele de șobolan au fost epuizate de meninge și vase de sânge, tocate mecanic și digerate cu 0,25% tripsină în prezența 0,01% DNază. După centrifugare și evaluarea viabilității celulelor, celulele au fost placate în baloane acoperite cu PLL (75 cm2) la o densitate de 1,5 × 107 celule/balon în DMEM, 10% FBS, 100 UI mL -1 penicilină, 100 µg mL -1 streptomicină , și menținut la 37 de grade într-un 5% CO2. După 7 zile, baloanele au fost agitate pentru a îndepărta oligodendrocitele și microglia. Puritatea astrocitelor, obținută prin tripsinizare (0,25% tripsină/0,02% EDTA), a fost evaluată prin imunocolorare pentru GFAP.
Tratamentul astrocitelor activate de LPS cu izotiocianat de alil, izotiocianat de fenetil sau 2-sulforafan
Astrocitele confluente, însămânțate în plăci cu 96 de godeuri, au fost stimulate cu 10 µg mL -1 de LPS și tratate simultan cu diferite concentrații de izotiocianat de alil (AITC), 2-izotiocianat de fenetil (PEITC) sau 2- sulforafan (SFN) în DMEM fără ser. Astrocitele din DMEM fără ser și astrocitele activate cu LPS au reprezentat martori negativi și, respectiv, pozitivi. În plus, deoarece soluțiile stoc de AITC (100 µM), PEITC (67 µM) și SFN (56,4 µM) au fost făcute în DMSO, o curbă doză-răspuns la DMSO, diluată în mediu de cultură la aceeași concentrație de solvent prezentă în probele analizate au fost efectuate pentru a estima toxicitatea compusului. După 20 de ore de incubare la 37 de grade, 5% CO2, supernatanții au fost colectați și stocați la -20 grade până la utilizare, în timp ce celulele au fost supuse testului MTT pentru a evalua viabilitatea celulelor.
Testul de viabilitate a celulelor MTT
Citotoxicitatea AITC, PEITC și SFN pe astrocite a fost detectată utilizând MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }} bromură de difenil tetrazoliu] test. Acest test se bazează pe reducerea MTT de către succinat dehidrogenază mitocondrială în celule viabile, la un produs albastru formazan insolubil care poate fi măsurat spectrofotometric. Pe scurt, după tratamentul timp de 20 de ore cu AITC, PEITC sau SFN, mediul de cultură a fost îndepărtat și celulele au fost încărcate cu 0,5 mg mL-1 de MTT. După incubare timp de 2 ore la 37 de grade, 5% mediu de CO2 a fost îndepărtat și cristalele de formazan din celule au fost solubilizate cu 90% etanol. După agitarea plăcilor timp de 15 min pentru a obține solubilizarea completă a cristalelor, cantitatea de produs formazan a fost determinată prin absorbanță optică la 560 nm cu o lungime de undă de referință de 690 nm. Viabilitatea celulară a fost exprimată ca procent de control (CTRL), reprezentat de celule netratate, care a fost stabilit la 100%. Pentru fiecare compus, a fost obținută o curbă doză-răspuns a viabilității celulare.
Detectarea speciilor reactive de oxigen
Detectarea speciilor reactive de oxigen (ROS) a fost efectuată prin încărcarea astrocitelor cu 10 μM de diacetat de 2′,7′-diclorofluoresceină (DCFH-DA) în DMEM fără roșu fenol la 37 de grade timp de 30 de minute. Apoi DCFH-DA a fost îndepărtat din godeuri și celulele au fost tratate timp de 1 oră cu AITC (400 μM), PEITC (10 μM) sau SFN (25 μM) în DMEM fără roșu de fenol în prezență de H2O2 la concentrația finală de 100 μM . Celulele tratate numai cu DCFH-DA sau cu H2O2 au reprezentat martorii negativi (CTRL) și respectiv pozitivi (H2O2). După incubare, celulele au fost clătite cu PBS și lizate cu
Tris–HCI 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 procente, pH 7,5,
apoi centrifugat la 10,000×g, 4 grade timp de 10 min. Supernatanții au fost colectați și analiza lor spectrofluorimetrică a fost efectuată la 525 nm sub excitare la 485 nm. Rezultatele au fost normalizate la conținutul total de proteine și producția de ROS a fost exprimată ca procent relativ al intensității fotoluminiscenței (PL) față de controlul pozitiv.
Detectarea gelatinazelor
Activitatea gelatinazei în supernatanții celulari (SN) a fost detectată prin analiză zimografică, așa cum este raportat de Latronico și colab. (2013). Pe scurt, o cantitate de SN, corespunzătoare la aproximativ 10 ug de proteine totale, a fost solubilizată cu 30 ui de tampon de probă Laemmli fără -mercaptoetanol. Probele au fost prelucrate într-un gel de poliacrilamidă 7,5% copolimerizat cu 0,1% (greutate/volum) gelatină. După rularea electroforetică, gelurile au fost clătite de două ori cu 2,5% Triton X-100/10 mM CaCl2 în 50 mM Tris–HCl, pH 7,4 și incubate timp de 24 de ore la 37 de grade în 1% Triton X-100 /50 mM Tris–HCI/10 mM CaCl2, pH 7,4. Gelurile au fost colorate cu albastru strălucitor Coomassie R-250 și colorate în metanol/acid acetic/H20 (4:1:5 v/v). Activitatea gelatinazei a fost vizualizată ca o bandă clară de digestie pe un fundal albastru al gelului și a fost cuantificată prin analiză computerizată a imaginii densitometrice folosind software-ul Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Gelatinaza
activitatea a fost exprimată ca densitate optică (OD) × mm2, reprezentând zona de scanare sub curbe care ia în considerare atât luminozitatea, cât și lățimea zonei de liză a substratului. Datele au fost exprimate folosind următoarea ecuație: procent de inhibiție=[100 − (probă OD/control pozitiv OD) × 100].
Reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR)
Astrocitele, însămânțate în plăci cu 6 godeuri, au fost activate cu LPS (10 ug mL-1) și tratate simultan cu ITC la concentrația maximă netoxică. După 20 de ore de incubare, ARN-ul total a fost extras din astrocite utilizând kitul Qiagen RNeasy mini conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul complementar (ADNc) a fost sintetizat din 500 ng de ARN utilizând trusa de transcripție inversă QuantiTect conform instrucțiunilor producătorului. Un total de 25 ng de produse de transcripție inversă au fost utilizate pentru a amplifica un fragment de 591 bp folosind primeri specifici (sens 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisens 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) pentru secvența MMP-2 de șobolan și un fragment de 541 bp folosind primeri specifici (sens 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; antisens 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) pentru secvența MMP-9 de șobolan. În paralel, a fost efectuată amplificarea unui fragment de 308 bp de ARNr 18S de șobolan (sens 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisens 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA{-3′), o genă de referință internă relativ invariantă. . Seturile de primeri, deja validate în alte studii (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) recunosc în mod specific doar genele de interes, așa cum este indicat prin amplificarea unei singure benzi de dimensiunea așteptată a PCR. produse. Amplificarea PCR a fost efectuată pentru 25 de cicluri fiecare constând din denaturare la 94 de grade, recoacere la 59 de grade și extensie la 72 de grade. După amplificare, produsele au fost analizate în geluri de agaroză 1,5%. După analiza densitometrică a gelurilor, amplificarea genelor țintă a fost normalizată la expresia ARNr 18S, iar rezultatele au fost exprimate ca procent de inhibare în comparație cu controlul pozitiv, așa cum este raportat pentru cuantificarea gelatinazei.
Detectarea fosforilării ERK 1/2 prin analiză Western blot
ERK 1/2 au fost detectate prin analiza imunoblot, așa cum este raportat în Latronico și colab. (2018). Pe scurt, primar confluent
astrocitele placate în plăci de {{{0}}godeuri, lăsate în stare de repaus în mediu fără ser timp de 24 de ore, au fost pretratate timp de 1 oră cu AITC (4{{00 μM), PEITC (10 μM), sau SFN (25 μM) în DMEM fără roșu de fenol. După stimulare timp de 2 ore cu 10 ug mL-1 de LPS, celulele au fost lizate cu 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 2,5 mM Na-pirofosfat, 1 mM -glicerofosfat 1% Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonil fuoride, 20 ug/mL aprotinină, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorură, 1 mM Na3VO4, pH 7,5. Șaizeci de ug din proteinele totale din fiecare probă au fost rezolvate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă SDS 10% și proteinele au fost apoi imunoblotate pe membrane de difluorură de poliviniliden. După blocarea peste noapte la 4 grade cu 0,05% Tween 20, 1% lapte, 1% albumină serică bovină în 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), membranele au fost sondate peste noapte la 4 grade cu un anti-p- monoclonal. Anticorp ERK 1/2 (1:500). Apoi membranele au fost spălate de trei ori cu 0,05% Tween 20 în soluție salină tamponată cu Tris, testate cu anticorp secundar anti-șoarece-peroxidază de hrean (1:20,000) timp de 2-h la 24 de grade și detectate cu chemiluminiscență sporită. Pentru a evalua cantitatea totală de ERK, membranele au fost stripate și incubate cu un anticorp specific pentru ERK 1/2 nefosforilat (1:500). Intensitățile benzilor au fost cuantificate prin scanarea densitometrică a petelor, iar nivelurile de fosforilare ale ERK 1/2 au fost normalizate la ERK 1/2 nefosforilat și exprimate ca procent în comparație cu controlul pozitiv (astrocite tratate cu LPS), conform următoarea ecuație:
procent perERK 1/2=(eșantion DO/control DOpozitiv) × 100.
analize statistice
Analiza datelor a fost efectuată utilizând GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Datele au fost exprimate ca valori medii ± SD. Analiza statistică a fost efectuată utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) urmată de testul post-hoc de comparație multiplă a lui Dunnett.
Rezultate
Efectul compușilor izotiocianați asupra viabilității astrocitelor
Au fost efectuate experimente preliminare pentru a evalua citotoxicitatea AITC, PEITC sau SFN. În acest scop, astrocitele purificate au fost tratate timp de 20 de ore cu compuși ITC la concentrații cuprinse între 5 și 400 pM sau cu DMSO diluat în mediu de cultură așa cum este descris în secțiunea Metodă. După cum se arată în Fig. 1, DMSO nu a fost toxic la toate concentrațiile utilizate care se potrivesc cu cele ale soluțiilor ITC testate. Printre ITC-urile investigate, AITC
Fig. 1 Viabilitatea celulară a astrocitelor tratate cu compuși izotiocianați. Astrocitele primare confluente au fost tratate timp de 20 de ore cu izotiocianat de alil (AITC), 2-izotiocianat de fenetil (PEITC) sau 2-sulforafan (SFN) la concentrațiile indicate, apoi au fost supuse testului MTT. În plus, deoarece se află în soluțiile stoc au fost dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO), o curbă doză-răspuns la DMSO, diluată în mediu de cultură la aceeași concentrație de solvent (procent) prezentă în probele ITC a fost rulată în fiecare experiment pentru a obține o estimare fiabilă a toxicității ITC. Controlul (CTRL) a fost reprezentat
parfumat din astrocite netratate în DMEM fără ser. Graficele reprezintă curbele doză-răspuns ale viabilității celulelor, exprimate ca procent de supraviețuire celulară în comparație cu martor. Dozele de compuși care au determinat viabilitatea celulară peste 60 la sută au fost alese drept concentrații maxime netoxice. Valorile sunt medii ± SD ale n=3 experimente efectuate pe diferite populații de celule. Micrografiile arată rezultate reprezentative ale morfologiei celulare observate la un microscop cu contrast de fază (mărire 50X) după tratamentul cu diferiți compuși
a fost mai puțin toxic pentru astrocite. În special, AITC nu a fost toxic pentru celule de până la 400 pM, în timp ce PEITC și SFN au fost toxice la concentrații de peste 10 și, respectiv, 25 pM. Observația microscopică a confirmat rezultatele testului MTT arătând că la concentrațiile toxice de PEITC și SFN, astrocitele au fost reduse ca număr, iar cele rămase au prezentat modificări citotoxice în citoplasma lor.
Efectul protector al compușilor ITC asupra producției de ROS în astrocitele tratate cu peroxid de hidrogen
Pentru a evalua efectul protector al ITC-urilor față de stresul oxidativ, astrocitele au fost pre-tratate cu PEITC, AITC și SFN la concentrația maximă netoxică, apoi stimulate cu H2O2. Producția intracelulară de ROS, indusă de H2O2, a fost testată de DCFH-DA. După cum se arată în Fig. 2, expunerea la H2O2 a sporit semnalul fluorescent în
Fig. 2 Producția de specii reactive de oxigen (ROS) în astrocite tratate cu ITC. Prezența ROS a fost testată prin măsurarea modificărilor semnalului fluorescent al 2′,7′-diclorofluoresceinei (DCFA) așa cum este raportat în secțiunea Materiale și Metode. Astrocitele, însămânțate în plăci cu 6 godeuri, au fost pre-tratate timp de 30 min cu DCFA, apoi au fost tratate timp de 1 oră cu 10 μM PEITC, 400 μM AITC sau 25 μM SFN în prezența H2O2 la concentrația finală de 100 μM . Astrocitele tratate cu DCFA singur (CTRL) sau cu 100 μM H2O2 au reprezentat control negativ și, respectiv, pozitiv. Semnalul fluorescent detectat în lizatele celulare a fost măsurat cu un fluorometru la 525 nm sub excitare la 485 nm. Producția de ROS a fost exprimată ca procent (procent) din intensitatea fotoluminiscenței (PL) în comparație cu controlul pozitiv. Valorile sunt medii ± SD ale n=3 experimente efectuate pe diferite populații de celule. Scăderea semnificativă statistic în comparație cu H2O2 este indicată de asteriscuri (ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Dunnet; *p <>
astrocite în comparație cu martor (CTRL). După cum este demonstrat de scăderea intensității fluorescenței DCF, pretratarea astrocitelor cu compuși ITC a contracarat generarea de ROS indusă de H2O2. Dintre ITC-urile testate, numai PEITC și SFN au reușit să reducă semnificativ producția de ROS cu aproximativ 20, respectiv 24%, în comparație cu un control pozitiv (H2O2).
Compușii izotiocianați inhibă nivelurile de MMP-2 și MMP-9 în astrocitele activate de LPS
Efectul compușilor ITC asupra nivelurilor de MMP-2 și MMP{-9 a fost evaluat asupra astrocitelor activate cu LPS, despre care se știe că induce expresia gelatinazelor (Gottschall și Deb 1996) și tratate simultan cu AITC, PEITC sau SFN în intervalul de concentrații care nu au fost toxice pentru celule. După cum se arată în Fig. 3a, două benzi clare de digestie de 72 și 92 kDa au fost prezente pe gel corespunzând, respectiv, MMP-2 și MMP-9. Activarea astrocitelor cu LPS a crescut nivelurile de MMP-2 și a indus sinteza MMP-9. Tratamentul cu AITC (Fig. 3b), PEITC (Fig. 3c) sau SFN (Fig. 3d) a determinat o doză dependentă
reducerea nivelurilor MMP-9, care variază în funcție de compusul utilizat. În special, dintre ITC utilizate, SFN a fost cel mai eficient în inhibarea MMP-9, deoarece a determinat o inhibare de 70 la sută la doza de 10 μM și o inhibare de 100 la sută la doza de 25 μM. În plus, numai SFN la concentrația maximă netoxică a fost capabil să inhibe semnificativ MMP -2 (Fig. 2d).
Compușii izotiocianați inhibă expresia genelor MMP-2 și MMP-9 în astrocitele activate de LPS
Pentru a determina dacă compușii ITC studiati au fost capabili să inhibe expresia MMP-2 și MMP{-9, RT-PCR a fost efectuată pe astrocite activate cu LPS tratate cu concentrația maximă netoxică de ITC. După cum se arată în gelurile reprezentative din Fig. 4a, tratamentul astrocitelor activate de LPS cu ITC-uri individuale a fost capabil să contracareze expresia crescută a ARNm MMP-2 și MMP{-9. După cum se arată în Fig. 4b, analiza cantitativă a rezultatelor a evidențiat că, la concentrația maximă netoxică, compușii ITC au determinat o inhibare semnificativă statistic a expresiei MMP-2 și MMP{-9 în comparație la un control pozitiv (LPS). În special, PEITC și SFN exercită același procent de inhibiție asupra MMP-2 (85 la sută ) și MMP-9 (100 la sută ), în timp ce AITC a fost mai puțin eficient decât PEITC și SFN în inhibarea MMP{{17} } (65 la sută ) și expresia MMP-9 (90 la sută ).
ERK 1/2 este implicat în inhibarea expresiei MMP de către ITC
Deoarece ERK 1/2 este principala cale de transducție a semnalizării implicată în reglarea expresiei MMP-2 și MMP{-9 în astrocitele activate de LPS (Lee et al. 2003), efectul compușilor ITC asupra a fost testată activarea protein kinazelor reglate extracelular (ERK) 1/2.
Așa cum se arată în Fig. 5, LPS a indus o creștere semnificativă statistic a nivelurilor de ERK 1/2 fosforilat (p-ERK) care a fost contracarată prin pre-tratare cu compuși ITC.
Discuţie
Se crede pe scară largă că principalele strategii de apărare împotriva multor boli constau în principal în evitarea factorilor de risc și adoptarea unui stil de viață corect. Există numeroase dovezi științifice care susțin ipoteza că unii metaboliți naturali, produși de obicei de diferite tipuri de fructe și legume, sunt capabili să moduleze fenomene patologice precum cancerul, bolile neurologice și alte boli multifactoriale. În acest scenariu, izotiocianații (ITC) au trezit un mare interes datorită lor antifungice, antibacteriene,
Fig. 3 Efectul compușilor izotiocianați asupra nivelurilor de MMP-2 și MMP{-9 în astrocitele activate cu LPS. Într-o a este raportat un gel zimografic reprezentativ al analizei supernatanților de cultură din astrocite activate cu LPS (10 ug mL-1) și tratate simultan timp de 20 de ore cu AITC, PEITC sau SFN la concentrațiile indicate (μM). S-au obținut controale negative și pozitive din astrocite nestimulate și netratate în mediu fără ser (CTRL) și LPS-
respectiv celulele activate (LPS). Histogramele b–d reprezintă rezultatele (media ± SD) ale n {{0}} experimente efectuate pe diferite populații de celule, exprimate ca procent de inhibare a MMP în comparație cu LPS, calculate după scanarea densitometriei și analiza computerizată a gelurilor . Scăderea semnificativă statistic în comparație cu LPS este indicată de asteriscuri (ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Dunnet; *p < 0.05,="" **p=""><>
proprietăți biologice anticancerigene, antimutagene, antioxidante și antiinflamatorii (Dufour și colab. 2015; Marzocco și colab. 2015; Vig și colab., 2009; Talalay și Fahey 2001). Izotiocianații provin din degradarea enzimatică a glucozinolaților (GSL), care sunt metaboliți secundari prezenți în 15 familii botanice din ordinul Capparales și sunt foarte abundenți în familia Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL sunt hidrolizate de mirozinază (-tioglucozidă glucohidrolază e; EC 3.2.3.147) într-o varietate de componente, cum ar fi ITC, nitriți, tiocianați, epitionitrili, SFGate, glucoză și oxazolidine (Li și Kushad 2005). Deși ITC-urile au fost studiate pe larg în domeniul chimioterapeutic (Grundemann și Huber 2018), au fost făcute puține investigații cu privire la potențialul lor terapeutic în bolile neurologice, în ciuda faptului că a fost demonstrată capacitatea SFN și AITC de a traversa BHE și de a se acumula în parenchimul cerebral. (Clarke și colab. 2011; Jazwa și colab. 2011; Zhang 2010). În această lucrare, am comparat efectele a trei ITC,
prezent în mai multe legume crucifere consumate în mod obișnuit, pe producția de specii reactive de oxigen (ROS) și expresia metaloproteinazei matricei (MMP) într-un model in vitro de neuroinflamație reprezentat de astrocite activate cu lipopolizaharidă (LPS) sau tratate cu H2O2. Astrocitele, cel mai abundent tip de celule gliale ale SNC, joacă un rol crucial în menținerea homeostaziei creierului și sunt semne distinctive ale diferitelor boli neurologice (Cekanaviciute și Buckwalter 2016; Colombo și Farina 2016). Sunt considerați regulatori cruciali ai răspunsului imun înnăscut, iar răspunsul lor la insulte dăunătoare, cum ar fi stresul oxidativ, poate exacerba reacțiile inflamatorii și deteriorarea țesuturilor sau poate promova repararea țesuturilor. Este bine cunoscut faptul că astrocitele activate produc factori neurotoxici, cum ar fi MMP, care au un rol cheie în promovarea neuroinflamației și a pierderii neuronale progresive în bolile neurologice (Hsieh și Yang 2013). Prin urmare, modularea lui
Fig. 4 Efectul compușilor ITC asupra expresiei MMP-2 și MMP-9 în astrocitele activate cu LPS. Astrocitele, însămânțate în plăci cu 6 godeuri, au fost activate cu LPS (10 μg mL-1) și tratate simultan timp de 20 de ore cu AITC (400 μM), PEITC (10 μM) sau SFN (25 μM), apoi supuse la RT-PCR. Gelurile de agaroză reprezentative ale expresiei MMP-2 și MMP{-9 sunt raportate în (a). Histogramele din (b) reprezintă rezultatele (media ± SD) ale n=3 experimente efectuate pe celule diferite
evenimentele care apar după activarea astrocitelor ar putea atenua răspunsul inflamator și deteriorarea neuronelor.
Rezultatele acestui studiu au indicat că printre ITC-urile studiate, AITC a fost mai puțin toxic, deoarece nu a dus la nicio reducere a viabilității celulare la toate concentrațiile utilizate. Prin contrast, similar cu ceea ce a fost observat de alți autori pe diferite linii celulare gliale, PEITC și SFN au prezentat toxicitate celulară la concentrații mai mari de 10, respectiv 25 µM (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. 2015).
În literatura științifică actuală, există multe date controversate cu privire la mecanismele moleculare care stau la baza efectelor ITC asupra viabilității celulare. În acest sens, majoritatea studiilor au sugerat că ITC-urile inhibă apoptoza care induce creșterea celulară, stoparea ciclului celular, generarea de ROS în celulele canceroase, dar nu și în celulele normale (Fofaria și colab. 2015; Qin și colab. al. 2018; Sestili și Fimognari 2015). Am descoperit că SFN și PEITC, dar nu și AITC, au un rol protector împotriva stresului oxidativ în astrocite, într-adevăr, la concentrațiile maxime netoxice, au fost capabili să contracareze producția de ROS indusă de expunerea la H2O2. SNC este deosebit de vulnerabil la stresul oxidativ datorită consumului ridicat de oxigen, sistemelor antioxidante slabe și conținutului ridicat de biomacromolecule susceptibile la oxidare. Se crede că generarea de ROS și daune oxidative sunt implicate în patogeneza tulburărilor neurologice, cum ar fi boala Alzheimer (AD), boala Parkinson (PD), scleroza laterală amiotrofică (ALS) și scleroza multiplă (SM) (Lee et al. 2015). Prin urmare, deși în experimentele noastre in vitro SFN și PEITC au contracarat producția de ROS într-o măsură moderată, am putea presupune că in vivo o administrare prelungită de ITC poate duce la o reducere mai semnificativă a ROS care, în timp, poate duce la semnificative. pentru populații exprimate ca procent de inhibare a MMP în comparație cu controlul pozitiv (LPS), calculat după scanarea densitometriei și analiza computerizată a gelurilor. Scăderea semnificativă statistic a expresiei MMP-2 și MMP{-9 în comparație cu LPS este indicată prin asteriscuri (ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Dunnet; *p <>
prevenirea și modularea bolilor creierului. ROS acționează ca o moleculă de semnalizare critică pentru a declanșa cascada de răspuns inflamator în SNC. În acest sens, este bine cunoscut faptul că ROS reglează expresia multor gene implicate în neuroinflamație prin activarea factorilor de transcripție proinflamatori, cum ar fi factorul nuclear-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù și colab. 2016; Martorana et al. 2019). În acest scenariu, un rol important îl joacă MMP-urile a căror expresie este reglată în sus de ROS prin activarea NF-kB (Yan și Boyd 2007).
Deoarece dereglarea MMP contribuie la patogeneza a numeroase boli neuroinflamatorii și neurodegenerative, inhibarea acestora reprezintă o strategie terapeutică importantă. Din acest motiv, interesul tot mai mare s-a concentrat în ultimul deceniu asupra potențialului medicamentelor și compușilor naturali de a inhiba MMP-urile. Numeroase studii in vitro au evidențiat că acțiunea antiinflamatoare și antioxidantă a mai multor medicamente și compuși bioactivi prezenți în legume și organismele marine sunt asociate cu abilitățile acestora de a inhiba expresia MMP-urilor (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. 2015). În acest studiu, am demonstrat că dintre ITC-urile testate, SFN și PEITC au fost cele mai eficiente în inhibarea nivelurilor de MMP-2 și MMP{-9 și a expresiei în astrocitele activate de LPS. Inhibarea MMP-urilor de către ITC a fost raportată în alte studii in vivo și in vitro. În special, Li și colab. (2013) au demonstrat că SFN este capabil să atenueze deteriorarea BBB prin inhibarea expresiei MMP-9 într-un model in vivo de encefalomielita autoimună experimentală. Alți autori au raportat că SFN a fost capabil să atenueze expresia MMP-9 în urma leziunii măduvei spinării la șoareci (Mao și colab. 2010a). În plus, studiile in vitro au demonstrat că suprimarea de către ITC a migrării celulare și
Fig. 5 Kinaza 1/2 reglată de semnal extracelular (ERK 1/2) este implicată în inhibarea expresiei MMP de către compușii ITC. Filme autoradiografice reprezentative ale analizei Western blotting a lizatelor din astrocite pre-tratate timp de 1 oră cu AITC (400 μM), PEITC (10 μM) sau SFN (25 μM) și apoi activate timp de 2 ore cu LPS (10 ug ml{{ 13}}). Celulele netratate și nestimulate reprezintă control negativ (CTRL). Histograma din (b) reprezintă invazia nivelurilor pERK1/2 în celulele gliomului C6 a fost asociată cu inhibarea expresiei MMP-9 mediată de NF-kB (Lee et al. 2015).
Mecanismele moleculare prin care ITC-urile inhibă MMP-urile sunt neclare și nu există studii care să investigheze proprietățile antioxidante și antiinflamatorii ale ITC-urilor pe culturile primare de astrocite. Mai multe studii susțin ipoteza că efectul inhibitor al ITC-urilor este o consecință a capacității lor de a bloca NF-kB prin calea de semnalizare Nrf2. În acest sens, un studiu in vivo dovedește că șoarecii knockout Nrf2 au fost mai sensibili la răspunsul inflamator mediat de NF-κB al măduvei spinării și la exprimarea crescută a genelor dependente de NFκB, inclusiv MMP-9 (Mao și colab. 2010b). ). Deși căile NF-kB și Nrf2 ar putea interacționa, am demonstrat că reglarea NF-kB are loc și prin modularea mecanismelor moleculare care sunt independente de Nrf2. Într-adevăr, am descoperit că AITC, PEITC și SFN au inhibat activarea ERK1/2, care joacă un rol esențial în cascada de evenimente de transducție a semnalului care reglează în cele din urmă transcripția genei MMP.
Cu toate acestea, dovezile experimentale că SFN la concentrația maximă netoxică a inhibat complet atât expresia MMP-9, cât și nivelurile, în timp ce AITC și PEITC au inhibat la o extindere maximă expresia MMP-9, dar au scăzut doar MMP{{3} } la aproximativ 50 la sută, ar putea sugera că acești compuși modulează transcripția MMP-9 cu diferite mecanisme de acțiune. În acest sens, s-a raportat că SFN, pe lângă inhibarea activării induse de LPS a NF-kB, interferează cu legarea LPS la receptorul TLR4 (Koo et al 2013). Efectul inhibitor al SFN asupra TLR4 ar putea preveni activarea astrocitelor de către LPS și acest lucru poate duce la inhibarea în amonte a exprimării MMP-9 cu o lipsă consecutivă a producției de MMP-9.
obtinut dupa scanarea densitometrica a filmelor autoradiografice si normalizarea la ERK 1/2 nefosforilat. Datele reprezintă medii ± SD pentru n=3 experimente efectuate pe diferite populații de celule. Asteriscurile reprezintă valori diferite din punct de vedere statistic de controlul pozitiv (astrocite activate de LPS), care a fost stabilit la 100 la sută (ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc de comparație multiplă a lui Dunnett; *p <>
Concluzii
În rezumat, datele noastre indică faptul că tratamentul astrocitelor cu ITC reduce formarea de ROS și inhibă eliberarea de MMP-2 și MMP{-9, oferind noi perspective asupra proprietăților antioxidante și antiinflamatorii ale ITC asupra gliale. celule. Aceste rezultate sugerează că ITC-urile ar putea fi agenți nutraceutici promițători pentru dezvoltarea intervențiilor de neuro-nutriție, bazate pe utilizarea alimentelor sănătoase, pentru prevenirea și tratamentul complementar al bolilor neurologice.
Finanțare Finanțare cu acces deschis oferite de Università Degli Studi di Bari Aldo Moro în cadrul Acordului CRUI-CARE.
Respectarea standardelor etice
Conflict de interese Autorii nu declară conflict de interese.
Acces deschis Acest articol este licențiat în baza unei licențe internaționale Creative Commons Attribution 4.0, care permite utilizarea, partajarea, adaptarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu sau format, atâta timp cât acordați credit corespunzător autorului original. (s) și sursa, furnizați un link către licența Creative Commons și indicați dacă s-au făcut modificări. Imaginile sau alte materiale de la terți din acest articol sunt incluse în licența Creative Commons a articolului, cu excepția cazului în care se indică altfel într-o linie de credit a materialului. Dacă materialul nu este inclus în licența Creative Commons a articolului și utilizarea dorită nu este permisă de reglementările legale sau depășește utilizarea permisă, va trebui să obțineți permisiunea direct de la deținătorul drepturilor de autor. Pentru a vedea o copie a acestei licențe, accesați http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
