Extractul de frunze de măslin (OLE) a afectat traficul de acvaporină-2 indus de vasopresină prin activarea receptorului de detectare a calciului

A lua legatura:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopresina (AVP) crește permeabilitatea apei înrenalconducta colectoare prin reglementarea traficului de acvaporin-2 (AQP2). Mai multe tulburări, inclusiv hipertensiunea arterială și secreția inadecvată a hormonului antidiuretic (SIADH), sunt asociate cu anomalii ale homeostaziei apei. S-a demonstrat că anumiți fitocompuși sunt benefice pentru sănătatea umană. Aici, efectele extractului de frunze de măslin (OLE) au fost evaluate folosind modele in vitro și in vivo. Studiile confocale au arătat că OLE previne translocarea AQP2 indusă de vasopresină în membrana plasmatică în celulele MCD4 și șobolan.rinichi. Incubarea cu OLE scade creșterea dependentă de AVP a coeficientului de permeabilitate a apei osmotice (Pf). Pentru a elucida posibilii efectori ai OLE, a fost evaluat calciul intracelular. OLE crește calciul intracelular prin activarea receptorului de detectare a calciului (CaSR).NPS2143 , un inhibitor selectiv al CaSR, a abolit efectul inhibitor al OLE asupra permeabilității apei dependente de AVP. Experimentele in vivo au arătat că tratamentul cu OLE crește expresia ARNm CaSR și scade ARNm AQP2, paralel cu o creștere a miARN-ului AQP2-țintit-137. Împreună, aceste descoperiri sugerează că OLE antagonizează acțiunea vasopresinei prin stimularea CaSR, ceea ce indică faptul că acest extract poate fi benefic pentru atenuarea tulburărilor caracterizate prin semnalizare anormală a CaSR și care afectează reabsorbția renală a apei.

Frunzele de măslin au fost folosite pe scară largă ca remedii tradiționale pentru a vindeca mai multe boli, în special în țările mediteraneene. Frunzele sunt consumate în mod obișnuit în dieta umană sub formă de extract sau pulbere pentru a prepara infuzii sau ceai de plante. Analiza de caracterizare chimică a arătat că frunzele de măslin conțin mai mulți compuși bioactivi care pot exercita efecte benefice în anumite morbidități, cum ar fi sindromul metabolic, dislipidemia și hipertensiunea arterială. Numeroși polifenoli precum oleuropeina, hidroxitirosolul și tirozolul au fost găsiți îmbogățiți într-un extract de frunze de măslin verde (OLE)5 și se știe că aceștia sunt implicați în prevenirea anumitor boli caracterizate de stresul oxidativ. Prin urmare, în ultimii câțiva ani, interesul pentru investigarea potențialelor efecte benefice ale extractului de frunze de măslin este în creștere în rândul oamenilor de știință din diferite domenii de cercetare. canale de tip Ca2 plus. Interesant, s-a descoperit că OLE exercită efecte antihipertensive asupra hipertensiunii genetice la șobolanii hipertensivi spontan (SHR), legate de îmbunătățirea funcției vasculare*. Reabsorbția excesivă a apei joacă un rol important în patogeneza creșterii tensiunii arteriale. La pacienții hipertensivi, tratați cu extract de frunze de măslin, s-a constatat o reducere semnificativă a mai multor factori inflamatori asociată cu scăderea tensiunii arteriale. În plus, retenția excesivă de apă caracterizează mai multe tulburări, cum ar fi ciroza hepatică, insuficiența cardiacă și secreția inadecvată a hormonului antidiuretic (SIADH). Homeostazia apei corporale este strâns controlată de hormonul antidiuretic vasopresină (AVP) care este eliberat în condiții de deshidratare. AVP își leagă receptorul V2R înrudit localizat la membrana bazolaterală arenalcelulele principale activând astfel calea semnalului cAMP care are ca rezultat translocarea veziculelor purtătoare de acvaporina-2(AQP2) dintr-un bazin intracelular în membrana plasmatică apicală unde are loc reabsorbția apei. La nivel molecular, mai mulți factori pot modula echilibrul hidric renal. Un nivel crescut de calciu luminal a redus traficul AOP2 pe termen scurt dependent de vasopresină prin activarea receptorului care detectează calciu (CaSR)1,12. Pe de altă parte, activarea CaSR în celulele epiteliale tubulare proximale renale imortalizate condiționat, izolate din urina umană, a indus o creștere semnificativă a calciului citosolic și a redus semnificativ creșterea AMPc determinată de forskolină (FK), un activator direct al adenilat cvclaze3. , în celulele MCD4 ale canalului colector renal, care exprimă stabil canalul de apă AOP2, stimularea CaSR a atenuat creșterea dependentă de cAMP a fosforilării AQP2 la serina 256, care este un eveniment pivot în cascada de transducție a semnalului activată de vasopresină și care în cele din urmă a crescut permeabilitatea apei4. ,15 În plus, înrinichifelii din rinichiul intern al șoarecelui medular, activarea CaSR cu calcimimeticul NPS-R568 a provocat o creștere semnificativă a AQP2-miARN-ul care vizează-137, confirmând o interacțiune strânsă între calea semnalului CaSR și AQP{ {4}}permeabilitatea dependentă de apă.17. În studiul de față, efectele extractului de frunze de măslin, obținut din soiul local Coratina, au fost evaluate asupra funcției AQP2 indusă de vasopresină în celulele MCD4 ale canalului colector renal care exprimă stabil AOP2 și în dDAVP. șobolani tratați injectați cu extract. Oferim dovezi că tratamentul cu OLE contracarează răspunsul vasopresinei în celulele renale, ceea ce ar putea explica în parte efectul său diuretic. În mod interesant, acest efect pare să fie legat de activarea CaSR indusă de OLE, un receptor cunoscut că are o interacțiune negativă cu receptorul vasopresină2.

Aflați mai multe efectele cistanche asupra rinichilor

Rezultate

Efectele OLE asupra funcției AQP2 induse de vasopresină în celulele MCD4. Pentru a investiga posibila implicare a OLE asupra funcției AQP2 dependentă de vasopresină,renalCelulele colectoare MCD4 ale conductei, care exprimă stabil receptorul de vasopresină 2(V2R) și AQP2 uman, au fost utilizate ca model experimental18. Studiile confocale (Fig. 1A) au dezvăluit că, în comparație cu celulele tratate cu dDAVP, în care colorarea AQP2 a fost localizată pe membrana plasmatică apicală, tratamentul cu OLE a prevenit localizarea membranară a AOP2 indusă de stimularea cu dDAVP. În conformitate cu aceste observații, tratamentul OLE a afectat creșterea indusă de dDAVP a răspunsului osmotic temporal (indicat ca 1/t în Fig.1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 procente, n=292 celule vs dDAVP=206,8±5,49 la sută, n=186 celule;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="">celule vs OLE/dDAVP=88.70±1.86 procente ,n=292 celule;p<0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Efectele OLE în rinichii șobolanilor injectați cu OLE.

Pentru a investiga în continuare acțiunile OLE, au fost efectuate studii in vivo. Mai exact, șobolanii au fost injectați cu OLE (250 mg/kg/zi) o dată pe zi timp de trei zile. Alternativ, șobolanii au fost tratați împreună cu OLE, timp de 3 zile, și dDAVP, timp de 30 min. Evaluarea ARNm CaSR care a fost izolat din canalul colector renal al șobolanilor și procesat pentru PCR în timp real (Fig.6) a evidențiat o creștere semnificativă a ARNm CaSR în OLE(OLE=1.87±0,29, n{{{ 10}} șobolani față de CTR=1,02±0,17, n=5 șobolani; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="" the="">rinichi, au fost efectuate analize western blotting și studii confocale (Fig. 9). La șobolanii injectați cu OLE/dDAVP, fosforilarea AQP2 la serină 256 a fost redusă semnificativ în comparație cu țesuturile renale ale animalelor tratate cu dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0,16, n=5 șobolani vs dDAVP{=2,16±0,25,n=5 șobolani; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Discuţie

Calciul este un mesager intracelular important care modulează o multitudine de funcții celulare2. Semnalizarea anormală a calciului poate duce la mai multe boli, inclusiv insuficiență cardiacă, cancer și hipertensiune arterială23. Controlul specific al expresiei și activității proteinelor care controlează multiple semnale intracelulare de calciu s-a dovedit cu succes că se confruntă cu numeroase tulburări și, prin urmare, este atractiv pentru dezvoltarea medicamentelor. Acest studiu oferă noi perspective asupra mecanismului de acțiune al OLE, arătând capacitatea sa de a modula semnalizarea calciului intracelular prin stimularea CaSR care este implicată în reglarea fină a traficului și expresiei AQP2 induse de vasopresină. În condiții fiziologice, AQP2 joacă un rol important în controlul homeostaziei apei corporale25. Stimularea mecanismului intracelular, care duce la localizarea AQP2 la nivelul membranei plasmatice apicale, are ca rezultat retenția anormală de apă și hiponatremie, ca și în sindromul secreției inadecvate de hormon antidiuretic (SIADH), ciroza hepatică și insuficiența cardiacă congestivă. model de SIADH, asociat cu boala polichistică renală 1 haploinsuficiență, nivelul bazal de calciu intracelular a fost semnificativ redus în comparație cu nivelul măsurat în canalele colectoare ale șoarecilor de tip sălbatic. Calciul intracelular scăzut a reglat în jos activitatea anumitor enzime, inclusiv proteina fosfataza PP2A, rezultând în reglarea în sus a fosforilării AOP2 la serina 2561. Prin contrast. activarea CaSR cu NPS-R568 calcimimetic a crescut concentrația de calciu intracelular și a redus nivelul cAMP în celulele cu deficit de PKD1. Foarte important, calciul citosolic poate regla ciclaza adenilată3 inhibibilă cu calciu, reglând astfel nivelul intracelular al AMPc. Într-adevăr, în celulele MCD4, stimularea CaSR cu NPS-R568 a scăzut AQP2-pS256 prin inhibarea adenilatului. cyclase4.În acest studiu, tratamentul cu OLE a prevenit creșterea dependentă de vasopresină a cAMP și AOP2-pS256, posibil secundar unei creșteri a concentrației intracelulare de calciu. De notat, expunerea la o sursă externă de cAMP folosind 8-Br-cAMP permeabil, a contracarat în mod semnificativ efectul inhibitor al OLE asupra căii V2R.

Un nivel crescut de calciu citosol poate duce la moartea celulelor și la apoptoză. Cu toate acestea, o creștere susținută a calciului intracelular de la 250 nM la mai mult de 60{0 nM a promovat supraviețuirea neuronală4. În celulele MCD4, tratamentul cu OLE la 0,1 mg/ml nu afișează un efect citotoxic. La această concentrație, OLE (0,1 mg/ml) a crescut ușor nivelul de calciu intracelular. Imagistica cu calciu a arătat că stimularea acută cu OLE a provocat o creștere tranzitorie a calciului intracelular prin activarea CaSR, care este abolită atunci când celulele au fost preincubate cu antagonistul selectiv al CaSR NPS2143. În celulele tubulare proximale renale, activarea alosterică a CaSR cu I-ornitină a redus producția de ROS, reducând astfel stresul oxidativ mitocondrial care a provocat apoptoza celulară356. Mai mult, studiul nostru anterior a arătat că expresia variantelor de câștig de funcție ale CaSR a redus eliberarea ROS și S-glutationilarea AQP237. Incubarea cu OLE a scăzut generarea de ROS în celulele MCD435, arătând capacitatea sa antioxidantă. Cu toate acestea, momentan nu este clar dacă OLE afectează AOP2-S-glutationilarea. Numeroase studii au arătat că OLE sau oleuropeina, care este principalul constituent al OLE, poate avea roluri protectoare prin inhibarea morții celulare,39 Cu toate acestea, efecte dependente de doză au fost descrise la șobolanii care primesc OLE. S-au obţinut răspunsuri benefice la doze de 250 şi 500 mg/kg. În schimb, la concentrații mai mari, tratamentul cu OLE poate avea efecte nocive, posibil datorită acțiunilor pro-oxidante ale mai multor fitocompuși. În acest studiu, șobolanii au fost injectați cu OLE la o doză de 250 mg/kg timp de trei zile, arătând o reglare în sus a CaSR. Nivelul de expresie al CaSR este crescut de anumiți compuși care acționează ca activatori alosterici ai receptorului. Calcimimeticele, într-adevăr, au scăzut calcificările vasculare prin creșterea biosintezei CaSR în celulele musculare netede vasculare umane0. În acest concurs, nu poate fi exclusă posibilitatea ca anumiți compuși din OLE să funcționeze ca modulatori alosterici ai CaSR. Pe de altă parte, stimularea cu vasopresină poate duce la eliberarea IL-6 care poate contribui la creșterea nivelului de expresie al CaSR42.

În rinichi, stimularea semnalizării CaSR este asociată cu o reglare în jos a expresiei AQP2, posibil prin generația miR-137. miARN-urile sunt modulatori posttranscripționali esențiali. Au fost de asemenea descrise mai multe miARN dependente de vasopresină care vizează expresia AQP243. Transfecția cu miR-32 și miR{-137 a redus semnificativ nivelul de expresie al AOP2 în celulele mpkCCDc14. Interesant, OLE poate atenua semnalele inflamatorii și poate exercita efecte protectoare prin modularea nivelului de expresie a mai multor miARN". În special, în celulele glioblastom multiforme, OLE a promovat expresia diferitelor miARN, inclusiv miR-13745 care este implicat în reglarea în jos a calea de semnalizare Akt/mTOR 46. De remarcat, tratamentul cu oleuropeină previne semnalizarea Akt/mTOR prin activarea CAMK și AMPK induse de calciu”.Activarea CaSR cu NPS-R568 activează AMPK și reduce activitatea mTOR în celulele tubulare proximale umane3. În concordanță cu aceste constatări, incubarea cu OLE crește calciul citosolic, reduce activitatea PKA și reduce dimensiunea chistului într-un model de cultură de celule 3D48. Împreună, aceste constatări sugerează că OLE poate fi utilă în tratarea tulburărilor caracterizate prin dereglarea dinamicii calciului intracelular legate de reglarea în jos a semnalizării CaSR.

Extractul din frunze de măslin constă din mai multe componente bioactive, inclusiv polifenoli, fibre și minerale49. În prezent, nu este clar dacă un compus sau o combinație sinergică de fitocompuși din OLE poate fi benefică în modularea răspunsurilor intracelulare. Extractul utilizat în acest studiu a fost aplicat ca posibil aditiv alimentar și, prin urmare, este important să se definească impactul fiziologic al extractului în sine, având în vedere că mai mulți fenoli, inclusiv hidroxitirosol, pot fi filtrați de rinichi și recuperați în urină50. Studii ulterioare vor oferi eficacitatea componentelor specifice care pot regla activ semnalizarea calciului intracelular prin CaSR. În concluzie, acest studiu oferă dovezi că OLE poate fi considerat un nou potențial adjuvant util pentru atenuarea tulburărilor caracterizate printr-o reducere a expresiei CaSR, precum și prin semnalarea și afectarea permeabilității apei renale.

Materiale și metode

Produse chimice și anticorpi.Toate substanțele chimice și antibioticele au fost achiziționate de la Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Calcein-AM, Fura-2-AM, medii de cultură celulară, ser fetal bovin (FBS) și substraturi chimioluminiscente Super Signal West Pico au fost cumpărate de la Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA).Aquaporin{ {2}}(AQP2) a fost detectat utilizând anticorpi specifici (C-tail Ab) produși împotriva unei peptide sintetice corespunzătoare ultimilor 15 aminoacizi C-terminali ai AQP2! uman. Anticorpii AQP2-pS256 au fost dăruiți cu amabilitate de profesorul Peter Deen. Anticorpii secundari de capră anti-iepure cuplati cu peroxidază de hrean au fost obținuți de la Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Un anticorp secundar capră-anti-iepure cuplat la Alexa-488 a fost achiziționat de la Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA).

Producția de extracte bogate în fenolici și caracterizarea chimică.Producerea unui extract bogat în fenolici din frunze de măslin a fost realizată așa cum este raportat în Ranieri et al.35. După măcinarea cu un blender (Waring-Commercial, Torrington, CT, SUA), s-a adăugat apă ddH2O (raport 1/20, w/y) și apoi a fost supusă ultrasunetelor (CEIA, Viciomaggio, Italia) de trei ori , timp de 30 min la 35±5 grade de fiecare dată. În cele din urmă, extractele au fost filtrate prin hârtie de filtru, liofilizate și depozitate la -20 grad C. Extractele obținute au fost filtrate cu filtre de nailon de 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) și utilizate pentru caracterizarea chimică. Conținutul total de fenol, activitatea antioxidantă și identificarea compușilor fenolici unici au fost efectuate conform Difonzo și colab.. OLE a prezentat un conținut de polifenoli, determinat de Folin-Ciocalteu, egal cu 195 mg. echivalenți de acid galic (GAE) și o activitate antioxidantă, determinată de ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolină-6-sare de diamoniu a acidului sulfonic), reprezentând 750 μmol TE (echivalenți Trolox) g!.

Cultură celulară și tratamente.Celulele MCD4 ale conductei corticale colectoare de șoarece, care exprimă stabil AQP2 uman și V2R-Rluc himeric au fost utilizate ca model experimental18. Celulele au fost crescute într-un amestec 1:1 de mediu Eagle modificat Dalbec-cos și F-12 suplimentat cu 5% (a/a) ser fetal bovin. 1% (a/a) L-glutamină și 1% penicilină/streptomicina, 5 μM dexametazonă, 400 ug/ml G418 (pentru rezistența la AQP2) și 1 ug/ml puromicină (pentru rezistența la V2R-Rluc) , într-o atmosferă umidificată de 5 la sută CO, la 37 de grade . Celulele MCD4 au fost lăsate în stare bazală (CTR) sau tratate pe termen lung cu OLE la 0,1 mg/ml O/N, dDAVP la 100 nM timp de 30 de minute sau co-tratate cu OLE și dDAVP sau NPS2143 la 1 μM O/N .În mod alternativ, celulele au fost expuse la 8-Br-cAMP la 500 μM timp de 45 de minute, au fost efectuate experimente pe termen scurt cu OLE la 1 mg/ml timp de 5 minute și NPS2143 la 10 μM timp de 15 minute. Experimentele au fost efectuate de 3-5 ori independent folosind celule din pasaje diferite.

Model animal și tratamente.Toate procedurile au fost realizate în acord cu Ghidurile naționale daneze pentru îngrijirea și manipularea animalelor de experiment și ghidurile publicate ale Institutului Național de Sănătate. Protocoalele au fost aprobate de Institutul de Medicină Clinică. Universitatea Aarhus, conform licențelor de utilizare a animalelor de experiment emise de Ministerul Danez al Justiției (Numărul de aprobare 2015-15-0201-00658). Studiile au fost efectuate pe șobolani Wistar masculi adulți cu o greutate inițială de 200-225 g. Animalele au fost menținute cu o dietă standard pentru rozătoare (Altromin, Lage, Germania) și au avut acces liber la apă de la robinet. În timpul experimentelor, șobolanii au fost găzduiți în grupuri de câte doi per cușcă, cu un ciclu lumină-întuneric de 12:12 ore, o temperatură de 21±2 grade C și umiditate de 55±2 la sută.

Cinci șobolani au fost tratați cu injecție subcutanată de 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danemarca) în 200 ul de soluție salină/animal și cinci șobolani tratați cu vehicul au servit drept martori. După 30 de minute, șobolanii au fost uciși, iar rinichii au fost procesați așa cum este descris mai jos.

Celule și lizate IMCD.Celulele au fost crescute pe vase de {{{0}}mm și resuspendate într-un tampon care conține manitol 220 mM, zaharoză 70 mM, EGTA 0,5 M pH 8,0 ,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCI pH 7,4 în

prezența inhibitorilor de proteaze (PMSF 1 mM, leupeptină 2 mg/ml și pepstatina A 2 mg/ml) și inhibitori ai fosfatazelor (NaF 10 mM și ortovanadat de sodiu 1 mM). Alternative, secțiuni de rinichi de aproximativ 0,5 mm au fost preparate și echilibrate timp de 10 minute într-un tampon care conține 1i8 mM NaCI, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucoză, 3,2 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM și Mg. 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). Papilele renale au fost tocate cu foarfece în același tampon în prezența proteazelor (PMSF 1 mM, 2 mg/mlleupeptin și 2 mg/mlpepstatină A) și fosfataze (NaF 10 mM și sodiu 1 mM). inhibitori de ortovanadat). După sonicare (60 kHz timp de 5 s), lizatele au fost centrifugate la 12,000xg timp de 10 min. Supernatanții au fost colectați și utilizați pentru studiile de imunoblotare'8.

Microscopie confocală.Studiile confocale au fost efectuate așa cum s-a descris anterior1. Pe scurt, celulele au fost crescute pe inserții PET de cultură celulară și tratate așa cum este descris mai sus. Alternativ, secțiunile de rinichi obținute de la control, OLE, dDAVP și OLE cu șobolani tratați cu dDAVP au fost supuse experimentelor de imunofluorescență așa cum s-a descris anterior. Imaginile au fost obținute cu un microscop cu fluorescență confocal cu scanare laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Elveția).

Electroforeza pe gel și imunoblot. Proteinele au fost separate pe geluri de poliacrilamidă fără pete 12% (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA) în condiții reducătoare așa cum s-a descris anterior=5,52. Pe scurt, benzile de proteine ​​au fost transferate pe membranele Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) și imunoblotate folosind anticorpi anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) și anti-AQP2-pS256. Semnalele imunoreactive au fost obținute utilizând substraturi chimioluminiscente Super Signal West Pico cu sistem Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA). Benzile au fost normalizate la proteinele totale folosind tehnologia fără pete (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA). Analiza densitometriei a fost efectuată utilizând ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA) și analizată folosind GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA).

Test de permeabilitate la apă.Permeabilitatea apei osmotice a fost măsurată așa cum a fost descris anterior43. Pe scurt, celulele MCD4 au fost crescute pe lamele de sticlă de 40-mm. După tratamente, celulele au fost încărcate cu 10 μM Calcein-AM permeabil la membrană timp de 45 de minute la 37 grade, 5% CO, în DMEM/F-12. Lamelele au fost montate într-o cameră de perfuzie (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, SUA). Măsurătorile au fost efectuate folosind un microscop TE2000-S inversat (microscop Nikon Eclipse, Tokyo, Japonia) echipat pentru măsurători de fluorescență cu o singură celulă și analiză imagistică. Probele încărcate cu Calcein-AM au fost excitate la 490 nm. Măsurători de fluorescență, după soluții izosmotice (140 mM NaCI. 5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl., 10 mM acid Hepes sulfonic, 5 mM glucoză, pH 7,4) sau hiperosmotice (soluție izosmotică adăugată cu manitol 135 mM) . au fost efectuate folosind software-ul Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada). Datele de fluorescență ale cursului de timp după perfuzarea celulelor cu soluții izo-și hiperosmotice au fost înregistrate. Cursul de timp al contracției celulei a fost măsurat ca constantă de timp (Ki, exprimată ca 1/r, sec), un parametru corelat cu permeabilitatea apei, obținut prin potrivirea datelor cu o funcție exponențială analizată folosind GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego). , CA, SUA).

Măsurători de transfer de energie prin rezonanță fluorescentă.Pentru a evalua modificările cAMP intracelular, a fost aplicată tehnologia de transfer de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET). Pentru experimentele FRET, celulele au fost transfectate cu o plasmidă care codifică senzorul H96 care conține motivul de consens de legare a cAMP al EPAC1 încorporat între proteina fluorescentă cyan (CFP) și cp173Venus-Venus, așa cum s-a arătat anterior 32.33.54. Plasmida care codifică sonda H96 a fost un cadou de la Dr.K. Jalink. Vizualizarea celulelor care exprimă ECFP și/sau EYFP și detectarea FRET au fost efectuate folosind un microscop TE2000-S inversat (microscop Nikon Eclipse, Tokyo, Japonia). Fiecare imagine a fost corectată și analizată așa cum s-a arătat anterior55.

Măsurători de calciu intracelular. Măsurătorile de calciu intracelular au fost efectuate așa cum s-a arătat anterior56. Pe scurt, celulele MCD4 au fost încărcate cu 4 μM Fura-2 AM timp de 15 minute la 37 de grade în DMEM/F-12. Soluția Ringer a fost folosită pentru a perfuza celulele în timpul experimentului, care conține 140 mM NaCI, 5 mM KCI 1 mM MgCI, 10 mM HEPES, 5 mM glucoză, 1,8 mM CaCI, pH 7,4. În măsurătorile fluorescenței, lamelele cu celule supraîncărcate au fost montate într-o cameră de perfuzie (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, SUA). Măsurătorile au fost efectuate utilizând un microscop TE2000-S inversat (microscop Nikon Eclipse, Tokyo. Japonia). Raportul intensităților de fluorescență la 340 și 380 nm a fost reprezentat grafic și calculat ca modificare a fluorescenței. În special, stimularea cu OLE (1 mg/ml) sau NPS2143 (10 μM) a fost comparată în același tip de celulă cu cele obținute după stimularea cu o doză maximă de agonist mediat de calciu ATP (100 μM), care a fost utilizat ca un control intern (100 la sută).

Nivelul de calciu intracelular a fost măsurat la starea de echilibru și calibrat așa cum este descris de Grynkiewicz57. OLE și NPS2143 au fost utilizate pe termen lung la 0,1 mg/ml și, respectiv, l uM și fiecare probă a fost calibrată prin adăugarea a 5 μM de ionomicină în prezența a 1 mM EGTA (Rm.), urmată de 5 μM ionomicină în 5 mM CaCl, (RMA).

Analiza PCR în timp real a ARNm AQP2 și CaSR la șobolanii de control și tratați.Experimentele PCR în timp real au fost efectuate pentru a măsura expresia relativă a ARNm în canalul colector medular intern (IMCD) izolat din papilele de rinichi de șobolan de control și tratate. S-au făcut felii de rinichi de aproximativ 0,5 mm și s-au echilibrat timp de 10 min într-un tampon care conține 118 mM NaCI, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucoză, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8 mM MgS04 şi 1,8 mM KH2P04 (pH 7,4). Papila renală a fost izolată sub un stereomicroscop. Specimenele de la șobolani martor și tratați au fost apoi tocate cu o foarfecă direct în Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Transcripția inversă a fost efectuată pe 2,5 ug de ARN total folosind SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), în conformitate cu sugestiile producătorului (25C timp de 10 min;42C timp de 60 min;85C timp de 5 min). Amplificarea PCR în timp real a fost efectuată prin utilizarea TagMan Fast Advanced Master Mix cu teste CaSR, AOP2 și GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) în sistemul StepOne Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) ), stabilind condițiile de ciclu termic specificate de producător (95 grade C timp de 20 s; 40 de cicluri alternativ la 95 °C timp de 1 s și 60 grade C timp de 20 s). Rezultatele au fost exprimate ca 2- valori (cuantificare relativă) cu △ACt=(Ct țintă-Ct GAPDH) tratată-(Ct țintă-Ct GAPDH)Sham1.

Evaluarea miARN-137 la șobolanii de control și tratați.Conținutul de miARN{{{0}} din canalul de colectare medular intern de șobolan de control și tratat a fost evaluat utilizând testele TagMan Advanced miRNA (has-miR-137; ID test; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), care a permis notificarea foarte sensibilă și specifică a miARN-ului matur folosind PCR cantitativ. S-au făcut felii de rinichi de aproximativ 0,5 mm și s-au echilibrat timp de 10 minute într-un tampon care conține 118 mM NaCI, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucoză, 3,2 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4m și 1,8 mM KH2PO4(pH7,4). Papila renală a fost izolată sub un stereomicroscop. Specimenele de la șobolani martor și tratați au fost apoi tocate cu o foarfecă direct în Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) pentru a extrage ARN total. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Catalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) a fost utilizat pentru a obține sinteza cADN, conform protocolului furnizat de producător (reacție de coadă Poly(A); reacție de ligatură; reacție de transcripție inversă; reacție miR-Amp). ARN-ul sintetic (UUAUUGCUUAGAAUACGCGUAG) cu 59-fosfor a fost sintetizat de Thermo Fisher Scientific și utilizat pentru a efectua o curbă de calibrare pentru a interpola valorile probei de miARN și pentru a obține o evaluare precisă (în nanograme) a conținutului de miR-137 în mostre16, prin utilizarea GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA).

Analize statistice.Toate valorile sunt raportate ca medie ± SEM Analiza statistică a fost efectuată prin ANOVA unidirecțional urmată de testul Newman-Keuls de comparații multiple cu *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Declarații, aprobare etică și consimțământ pentru participare.Studiile pe animale au fost efectuate în acord cu Ghidurile naționale daneze pentru îngrijirea și manipularea animalelor de experiment și cu ghidurile publicate ale Institutului Național de Sănătate. Comitetul de etică pentru îngrijirea animalelor din cadrul Institutului de Medicină Clinică, Universitatea Aarhus a aprobat protocoalele de studiu, conform licențelor de utilizare a animalelor de experiment emise de Ministerul Danez al Justiției (Numărul de aprobare 2015-15-0201-00658). Autorii confirmă că toate metodele au fost efectuate în conformitate cu ghidurile și reglementările relevante. Mai mult, autorii confirmă că studiul a fost realizat în conformitate cu ghidurile ARRIVE.

Referințe

1. El, SN & Karakaya, S. Măslinul (Olea europaea) lasă potențiale efecte benefice asupra sănătății umane. Nutr. Apoc. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Efectele extractului de frunze de măslin asupra răspunsului metabolic, funcțiilor hepatice și renale și biomarkerilor inflamatori la pacienții hipertensivi. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, polifenoli DM Olive și sindromul metabolic. Molecule

4. Cherif, S. et al. Un studiu clinic al unui extract de Olea titrat în tratamentul hipertensiunii arteriale esențiale. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA şi colab. Extractele verzi din soiul de măsline cortina lasă caracter antioxidant și activitate biologică. J. Funct. Alimente 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Noi posibilități de valorificare a subproduselor uleiului de măsline. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Extractul de frunze de măslin îmbogățit cu oleuropeină afectează dinamica calciului și afectează viabilitatea celulelor mezoteliom maligne. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Efectele antihipertensive ale extractului de frunze de măslin îmbogățit cu oleuropeină la șobolanii hipertensivi spontan. Funcția alimentară 7, 584–593.

9. Hall, JE Disfuncție renală, mai degrabă decât disfuncție vasculară nonrenală. Mediază hipertensiunea indusă de sare. Tirajul 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA și Knepper, MA Vasopresina și reglarea acvaporinei-2. Clin. Exp. Nefrol. 17, 751–764.

11. Procino, G. et al. Calciul extracelular antagonizează traficul de acvaporină 2 indusă de forskolină în celulele ductului colector. Rinichi Int. 66, 2245–2255.

12. Riccardi, D. & Valenti, G. Localizarea și funcția receptorului renal de detectare a calciului. Recenzii despre natură. Nefrologie 12, 414–425.

13. Di Mise, A. et al. Celulele epiteliale tubulare proximale umane imortalizate în mod condiționat, izolate din urina unui subiect sănătos, exprimă receptor funcțional de detectare a calciului. A.m. J. Physiol. Fiziol renal. 308, F1200-1206.