Partea 1: Acteozidul contracarează procesele catabolice induse de interleukine-1 -prin modularea proteinelor kinazelor activate de mitogen și a căii de semnalizare celulară NFκB

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang

Osteoartrita (OA) este cea mai frecventă boală degenerativă articulară cu dureri articulare cronice cauzate de degenerarea progresivă a cartilajului articular la nivelul articulațiilor sinoviale.Acteozid, un glicozid cafeoilfeniletanoid, are diverse activități biologice, cum ar fi efect antimicrobian, antiinflamator, anticancer, antioxidant, citoprotector și neuroprotector. În plus, administrarea orală aacteozidla doze mari nu provoacă genotoxicitate. Prin urmare, scopul prezentului studiu este de a verifica efectele anticatabolice aleacteozidîmpotriva osteoartritei și a căii sale de semnalizare anticatabolică.Acteozidnu a scăzut viabilitatea celulelor L929 de fibroblast de șoarece utilizate ca celule normale și condrocite primare de șobolan.Acteozida contracarat pierderea de proteoglican indusă de IL-1 -în condrocite și cartilaj articular prin suprimarea expresiei și activării unei enzime de degradare a cartilajului, cum ar fi metaloproteinaza matriceală (MMP-) 13, MMP-1 și MMP{ {6}}. Mai mult, actozidul a suprimat expresia mediatorilor inflamatori, cum ar fi sintaza oxid nitric inductibil, ciclooxigenaza-2, oxidul nitric și prostaglandina E2 în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1. Ulterior, expresia citokinelor proinflamatorii a fost scăzută de actozidă în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL{10}}. Mai mult, acteozidul a suprimat nu numai fosforilarea protein kinazelor activate de mitogen în condrocite primare de șobolan tratate cu IL-1, ci și translocarea NFκB din citosol în nucleu prin suprimarea fosforilării acestuia. Administrarea orală a 5 și 10 mg/kg actozid a atenuat degenerarea progresivă a cartilajului articular la modelul de șoarece osteoartritic generată de destabilizarea meniscului medial. Descoperirile noastre indică acest lucruacteozideste un potențial agent anticatabolic promițător sau supliment pentru atenuarea sau prevenirea degenerarii progresive a cartilajului articular.

cistanche-acteozid

1. Introducere

Osteoartrita (OA) este cea mai frecventă boală degenerativă articulară cu dureri articulare cronice cauzate de degenerarea progresivă a cartilajului articular la nivelul articulațiilor sinoviale [1]. Datorită creșterii speranței de viață, prevalența OA cu pierderea mobilității și a durerilor articulare cronice cauzate de degenerarea progresivă a cartilajului articular la nivelul articulațiilor sinoviale este estimată la 18%, respectiv 9,6% la femei după menopauză și, respectiv, la bărbați [2] ]. Deși prevalența OA la nivel mondial 2 Medicina oxidativă și longevitate celulară crește anual, etiologia fiziopatologică a OA este încă necunoscută. Poate fi cauzată de factori de risc foarte complexi și multifactoriali, cum ar fi îmbătrânirea, sexul, moștenirea genetică, leziunile articulare traumatice și sarcina articulară mecanică severă. În plus, relațiile neuropatologice dintre degenerarea progresivă a cartilajului articular și dezvoltarea durerii articulare cronice sunt necunoscute [3]. Prin urmare, scopul managementului clinic pentru pacienții cu OA este menținerea mobilității corpului și a funcției mecanice a articulațiilor prin ameliorarea durerilor articulare cronice, folosind abordări farmacologice și nonfarmacologice și intervenții chirurgicale de înlocuire a articulațiilor. Cererea pentru dezvoltarea unei intervenții sau suplimente eficiente, cu siguranță biologică pe termen lung, pentru a preveni sau a atenua OA pentru a menține calitatea vieții prin menținerea funcției articulare mecanice la populația în vârstă este în creștere.

Așa cum se arată în Figura 1, actozida (Nr. CAS 61276-17-3; C29H36O15) este o glicozidă cafeoilfeniletanoidă izolată din mai multe plante medicinale, cum ar fi clorurile de Verbascum [4], Buddleja globosa [5] și Plantago australis [6]. Acteozidul are diverse activități biologice, cum ar fi efect antimicrobian [5], antiinflamator [7], anticancer [8], antioxidant [9], citoprotector [9] și efect neuroprotector [10]. În plus, administrarea orală a actozidei în doze mari nu provoacă genotoxicitate [11].

Prin urmare, am emis ipoteza că actozidul cu siguranță biologică antiinflamatoare are efecte anticatabolice asociate cu protecția cartilajului articular împotriva degenerării progresive a cartilajului articular prin suprimarea factorilor catabolici, cum ar fi citokinele proinflamatorii, mediatorii inflamatorii și enzimele articulare singradante. . Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a investiga efectele anticatabolice induse de actozide și calea sa de semnalizare celulară atât in vitro, folosind condrocite primare izolate din cartilajul articular al articulației genunchiului de șobolan, cât și in vivo, folosind un model animal OA generat prin intervenție chirurgicală. destabilizarea meniscului medial în articulația genunchiului la șoareci.

acteozid dincistanche

2. Metode

2.1. Cultură de celule. Condrocitele primare de șobolan au fost izolate din cartilajul articular al articulațiilor genunchiului de șobolan (5-vechi de o zi; Sprague–Dawley), în conformitate cu protocolul (CIA-CUC2019-A0027) aprobat de Instituțional Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Chosun, Gwangju, Republica Coreea. Condrocitele primare izolate de șobolan au fost menținute în amestecul de mediu/nutrient al lui Dulbecco Modificat Eagle F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Life Technologies). , Grand Island, NY, SUA), antibiotice (50U/mL penicilină și 50ug/mL streptomicina) și 50ug/mL acid ascorbic. Linia celulară normală de fibroblast L-929 de șoarece a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC). Conform instrucțiunilor furnizate de ATCC, celulele L-929 au fost cultivate în mediul minim esențial al Eagle, care conține 10% FBS și au fost crescute într-un incubator umidificat la 37 de grade cu 5% CO2.

2.2. Test de viabilitate celulară. Testul sării de dimetil tiazolil difeniltetrazoliu (MTT) a fost efectuat pentru a evalua viabilitatea celulelor liniei celulare de fibroblast de șoarece L929 utilizate ca celulă normală și condrocite primare de șobolan tratate cu actozidă. Pe scurt, celulele L929 și condrocitele primare de șobolan au fost cultivate la o densitate celulară de 8 x 105 celule/ml în plăci de cultură timp de 24 de ore și apoi tratate cu 2,5, 5, 10, 25, 50 și 100 μM actozid timp de 24 de ore. După tratamentul cu soluție MTT, atât celulele L929, cât și condrocitele au fost cultivate în continuare timp de 4 ore. După incubare, cristalele MTT formate au fost suspendate complet în dimetil sulfoxid și măsurate pentru absorbanța la 570 nm folosind un spectrometru (spectrofotometru cu microplăci Epoch, BioTek®, Winooski, VT, SUA) pentru a evalua viabilitatea celulei.

2.3. Testul celulelor vii/moarte. Supraviețuirea celulelor a fost realizată folosind kitul de testare Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, SUA), care este compus din calceină verde-AM pentru marcarea celulelor vii (cu fluorescență verde) și homodimer de etidio-1 pentru etichetarea morților. celule (cu fluorescență roșie). Pe scurt, atât celulele L929, cât și condrocitele primare de șobolan au fost cultivate la o densitate celulară de 8 x 105 celule/ml pe lame de cameră (sistem Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) timp de 24 de ore și apoi tratate cu 50 și 100μM actozidă timp de 24 de ore. După cultivare, a fost efectuat un test de supraviețuire celulară conform instrucțiunilor producătorului. Ulterior, celulele colorate au fost fotografiate folosind un microscop cu fluorescență (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Analiza albastru de dimetilmetilen (DMMB). Testul DMMB a fost efectuat pentru a evalua modificarea conținutului de proteoglican în condrocitele primare de șobolan tratate cu acteozidă timp de 21 de zile în prezența sau absența IL-1. Pentru a menține caracteristicile condrocitelor primare de șobolan timp de 21 de zile, condrocitele primare de șobolan (2 x 106 celule) au fost suspendate în 1 ml de alginat 1,2 procente și apoi încapsulate prin picurarea suspensiei de celule/alginat într-o soluție de 105 mM CaCl2. Condrocitele primare de șobolan încapsulate în alginat au fost cultivate timp de 24 de ore în DMEM/F12 (conținând 10% FBS, 50U/mL penicilină, 50ug/mL streptomicina și 50ug/mL acid ascorbic) și apoi adaptate timp de 24h în DMEM/F12% mini-insulină-transferină-seleniu (mini-ITS) și 50ug/mL acid ascorbic. Ulterior, condrocitele au fost tratate cu acteozidă 50 sau 100 μM în prezența sau absența a 1 ng/mL IL-1 timp de 21 de zile. În ziua 21, condrocitele primare de șobolan au fost colectate pentru evaluarea conținutului de proteoglican folosind testul DMMB, așa cum s-a descris anterior [12]. În plus, pentru a cuantifica conținutul de proteoglican pe celulă și pentru a evalua proliferarea condrocitelor primare de șobolan, numărul de celule a fost măsurat prin test ADN folosind PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), conform instrucțiunilor producătorului.

2.5. Cultura de organe ex vivo a țesuturilor cartilajului articular de șobolan. Țesuturile cartilajului articular au fost izolate din articulațiile genunchiului la 5-șobolani Sprague-Dawley de o zi și apoi au fost cultivate în DMEM/F12 suplimentat cu 10% FBS. Apoi, cartilajul articular

probele au fost tratate cu 100 μM actozidă înprezența sau absența a 10ng/mL IL-1 timp de 7 zile. La sfârșitul perioadei de cultură, probele au fost colectate și fixate în paraformaldehidă 4% timp de 72 de ore pentru analiza histologică.

2.6. Analiza histologică. Analiza histologică folosind safranină-O și colorarea rapidă cu verde a fost efectuată pentru a verifica pierderea de proteoglican în cartilajul articular tratat cu 100 μM actozidă în prezența sau absența a 10ng/mL IL-1 timp de 7 zile. Pe scurt, probele de cartilaj articular fix au fost decalcificate în acid etilendiaminotetraacetic și apoi încorporate în parafină. După aceea, blocurile de parafină pregătite care conțin cartilajul articular au fost tăiate în serie la o grosime de 5 μm și plasate pe lame. Safranin-O și colorarea rapidă cu verde au fost efectuate ulterior pentru a evalua pierderea de proteoglican în substanța de bază a cartilajului articular. În plus, a fost efectuată colorarea cu hematoxilină și eozină pentru a observa morfologia generală a cartilajului articular.

2.7. Western Blotting. Western blotting a fost efectuat pentru a investiga expresia factorilor catabolici, inclusiv MMP-13, MMP-1, MMP{-3, oxid nitric sintaza inductibilă (iNOS) și ciclooxigenază-2 (COX) -2) și alterarea moleculelor de semnalizare celulară, cum ar fi protein kinazele activate de mitogen și factorul nuclear-kappa B (NFκB). Pe scurt, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu acteozidă 50 sau 100 μM în prezența sau absența a 10 ng/mL IL-1 timp de 24 de ore. După aceea, condrocitele primare de șobolan au fost recoltate prin centrifugare și au fost lizate utilizând tampon de liză (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. În plus, pentru a verifica translocarea nucleară a NFκB, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 sau 100 μM actozid în prezența sau absența a 10ng/mL IL-1 timp de 24 de ore. După aceea, fracțiile citosolice și nucleare au fost extrase utilizând reactivi de extracție nucleară și citoplasmatică NE-PER™ (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația proteinei totale extrase din condrocite primare de șobolan a fost determinată folosind un kit de analiză a proteinei acidului bicinconinic (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. În plus, mediul condiționat a fost colectat pentru a detecta nivelurile de enzime de degradare a cartilajului secretate de condrocite. Cantități egale de proteină și mediu condiționat au fost supuse electroforezei pe electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și apoi transferate pe membrane de nitroceluloză. Ulterior, Western blotting a fost efectuată folosind anticorpi primari țintiți împotriva MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX{-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 /2, phosphop38, total-p38, phosphor JNK, total JNK, phosphoNFkB, total NFkB, -actina și lamina B. Benzile imunoreactive au fost vizualizate folosind un sistem de chemiluminiscență îmbunătățit (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) conform instrucțiunile producătorului și apoi imaginea cu un dispozitiv Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Ierusalim, Israel).

2.8. Reacția cantitativă a polimerazei în lanț (qPCR) și PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR). Condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 sau 100 μM actozid în prezența sau absența a 10 ng/mL IL-1 timp de 24 de ore. După aceea, ARN-ul total a fost izolat din condrocitele primare de șobolan folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația totală de ARN a fost măsurată folosind un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA). Pentru a sintetiza ADNc, 1 ug de ARN a fost transcris invers folosind un sistem PCR de transcripție inversă ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. qPCR a ADNc a fost efectuată utilizând 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Republica Coreea) și primeri specifici pe un dispozitiv TaKaRa PCR Thermal Cycler (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japonia). După aceea, produsele PCR au fost supuse electroforezei pe un gel de agaroză pentru a determina nivelurile de expresie ale genelor țintă. Ca control endogen a fost utilizată gliceraldehida 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH). În plus, pentru qRT-PCR, cADN-ul a fost amplificat utilizând un sistem Eco™ Real-Time PCR (illumine Inc., San Diego, CA, SUA). -Actina a fost folosită ca control endogen. Secvențele primerilor utilizați în qPCR și qRT-PCR sunt rezumate în Tabelele 1 și, respectiv, 2.

beneficiu cistanche (acteozid): îmbunătățește imunitatea

3. Rezultate

3.1. Acteozidul nu afectează viabilitatea celulelor L929 și a condrocitelor primare de șobolan. Linia celulară de fibroblast de șoarece L929 utilizată ca celule normale a fost tratată cu 2,5, 5, 10, 25, 50 și 100 μM actozid timp de 24 de ore. După aceea, testul MTT a fost efectuat pentru a evalua citotoxicitatea actozidei pe celulele L929. După cum se arată în Figura 2(a), viabilitățile relative ale celulelor L929 au fost determinate a fi 94:8±8 la sută, 93:6±7 la sută, 100 ± 5 la sută, 103:9± 5 la sută, 126:1±8 la sută și 122:7±4 procente la 2,5, 5, 10, 25, 50 și, respectiv, 100 μM actozidă, comparativ cu martor (100:02 ± 3 procente). Mai mult, pentru a verifica citotoxicitatea actozidei pe condrocite primare de șobolan, testul MTT a fost efectuat așa cum se arată în Figura 2 (b). Viabilitățile condrocitelor primare de șobolan tratate cu 2,5, 5, 10, 25, 50 și 100 μM actozid au fost determinate ca 114 ± 4 la sută, 117: 8 ± 6 la sută, 123: 9 ± 5 la sută, 132: 6 ± 4 la sută, 153:1± 7 la sută, respectiv 142:1±6 la sută, comparativ cu martor (100:4±5 la sută). Mai mult, pentru a confirma efectul actozidei asupra viabilității atât a celulelor L929, cât și a condrocitelor primare de șobolan, a fost efectuat un test Cell Live/Dead, așa cum se arată în Figura 2(c). Numărul de celule moarte colorate ca fluorescență roșie nu a crescut atât pentru celulele L929, cât și pentru condrocitele primare de șobolan tratate cu 50 și 100 μM actozid timp de 24 de ore. Aceste date au demonstrat în mod constant că doza definită de acteozidă nu a afectat viabilitatea celulelor L929 și a condrocitelor primare de șobolan. Astfel, acteozide de 50 μM și acteozide de 100 μM, care sunt doze netoxice atât în ​​celulele L929, cât și în condrocite primare de șobolan, au fost utilizate pentru a verifica efectele sale anticatabolice în studii in vitro folosind condrocite primare de șobolan.

3.2. Acteozidul contracarează pierderea de proteoglican indusă de IL-1 - în condrocitele primare de șobolan. Condrocitele primare de șobolan încorporate în margele de alginat au fost tratate cu 50 și 100 μM actozid în prezența sau absența a 1 ng/mL IL- 1 timp de 21 de zile. După aceea, a fost efectuat un test DMMB pentru a evalua modificarea conținutului de proteoglican așa cum se arată în Figura 3 (a). Conținutul relativ de proteoglican a fost determinat ca 88:3±18:1% și 86:8±16:3% în condrocitele primare de șobolan tratate cu 50, respectiv 100μM actozidă, în comparație cu martor (103:8±). 32:3 la sută). Deși conținutul relativ de proteoglican a fost scăzut de actozidă, aceste rezultate nu au fost semnificative. Cu toate acestea, conținutul relativ de proteoglican a scăzut semnificativ cu 37:1± 14:7% în condrocitele primare de șobolan tratate cu 1ng/mL IL-1, dar 50 și 100μM actozidă au redus semnificativ conținutul de proteoglican cu 57 ± 12:4 procente și, respectiv, 64 ± 14:5 la sută, în prezența a 1 ng/mL IL-1. Ulterior, pentru a verifica dacă actozidul suprimă pierderea de proteoglican indusă de IL{39}}, cartilajul articular disecat din articulațiile genunchiului de șobolan a fost tratat cu 100 μM actozidă în prezența sau absența a 10 ng/mL IL-1 timp de 7 zile. Ulterior, au fost efectuate evaluări histologice folosind colorarea H&E și safranin-O și colorarea verde rapidă, așa cum se arată în Figura 3 (b). Alterarea morfologică nu a fost observată folosind colorarea H&E; cu toate acestea, safranina-O și colorarea rapidă cu verde au dezvăluit că proteoglicanul colorat ca culoare roșie nu s-a modificat în cartilajele articulare tratate cu 100 μM actozid în comparație cu cel din control. Cu toate acestea, pierderea severă de proteoglican a fost indusă de 10ng/mLIL-1 în cartilajul articular și 100μM actozidă a suprimat în mod semnificativ pierderea de proteoglican în cartilajul articular tratat cu 10ng/mL IL{- 1. Colectiv, aceste date arată în mod constant că actozidul are un efect anticatabolic care întârzie degenerarea cartilajului articular prin contracararea pierderii de proteoglican indusă de IL{53}.

3.3. Acteozidul are un efect anticatabolic care suprimă expresia și activarea MMP în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1. Pentru a investiga dacă efectul anticatabolic indus de acteozide este asociat cu suprimarea expresiei și activării MMP, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 și 100 μM de acteozide în prezența sau absența a 10ng/mL IL-1 timp de 24 de ore. Ulterior, modificările MMP-urilor au fost investigate. După cum se arată în Figura 4(a), deși expresia enzimelor care degradează cartilajul, cum ar fi MMP-13, MMP{-1 și MMP{-3 a fost semnificativ crescută în mediile condiționate ale șobolanului primar condrocite tratate cu 10ng/mL IL-1, aceasta a fost redusă de actozidă într-o manieră dependentă de doză. În plus, rezultatele ambelor qPCR (Figura 4(b)) și qRT-PCR (Figura 4(c)) au arătat că IL-1 a crescut semnificativ nivelurile de ARNm ale MMP-urilor cum ar fi MMP-13, MMP{ {22}} și MMP-3 în condrocitele primare de șobolan. Cu toate acestea, au scăzut în funcție de doză în condrocitele primare de șobolantratat cu 50 și 100μM actozid. Mai mult, 50 și 100 μM actozide au suprimat în mod eficient activarea MMP-urilor în condrocitele primare de șobolan tratate cu 10ng/mL IL-1 (Figura 4 (d)). Luate împreună, aceste date indică în mod consecvent faptul că actozidul are un efect anticatabolic care suprimă expresia și activarea enzimelor de degradare a cartilajului.

3.4. Acteozidul suprimă expresia și producția de mediatori inflamatori catabolici induși de IL1 - și citokine proinflamatorii în condrocitele primare de șobolan. Pentru a determina dacă actozidul are un efect preventiv împotriva OA, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 și 100 μM de acteozid în prezența sau absența a 10 ng/mL IL-1 timp de 24 de ore. Ulterior, au fost investigate modificările mediatorilor inflamatori, factori catabolici reprezentativi precum iNOS, COX-2 și PGE2. Nivelurile de ARNm de iNOS, COX-2 și PTGS-2 au fost crescute semnificativ de IL-1 în condrocitele primare de șobolan.

Cu toate acestea, au scăzut în funcție de doză în condrocitele primare de șobolan tratate cu acteozidă (Figura 5 (a)). Mai mult, actozidul nu numai că a suprimat expresia iNOS și COX-2 în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1 (Figura 5(b)), dar și a scăzut semnificativ producția relativă de NO și PGE2, așa cum se arată. în figurile 5(c) și, respectiv, 5(d). Aceste date sugerează că actozidul suprimă expresia citokinelor proinflamatorii induse de mediatorul inflamator care acționează ca factori catabolici pentru a induce degenerarea progresivă a cartilajului articular. Prin urmare, pentru a investiga alterarea expresiei citokinelor proinflamatorii de către acteozide 50 μM în condrocitele primare de șobolan tratate cu 10 ng/mL IL- 1, a fost efectuată o matrice de citokine așa cum se arată în Figura 6. Acteozidul a suprimat expresia neutrokinelor induse de citokine. chimioatractant- (CINC-) 2, CINC-3, factor neurotrofic ciliar (CNTF), fractalkină (CX3CL1), IL-1, IL{- 1, leptina, proteină chimioatractantă a monocitelor{{22} } (MCP-1), proteina inflamatorie a macrofagelor (MIP-) 3 și -nervfactor de creștere (NGF) în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1 în comparație cu IL-1 singur. Luate împreună, aceste date sugerează în mod constant că acteozidul previne degenerarea progresivă a cartilajului articular prin suprimarea mediatorilor inflamatori și a citokinelor proinflamatorii împotriva efectelor catabolice induse de IL-1 - în condrocitele primare de șobolan.

3.5. Acteozidul suprimă fosforilarea MAPK și NFkB în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1. Pentru a investiga căile de semnalizare celulară asociate cu efecte anticatabolice induse de acteozide împotriva alterării citokinei proinflamatorii IL-1 a MAPK și NFκB, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 și 100 μM actozid în prezența sau absența IL{8. }} timp de 24 de ore. După aceea, proteina totală a fost extrasă și electroforezată pe gelul SDS-PAGE pentru a efectua Western blot. După cum se arată în Figura 7, MAPK, cum ar fi ERK1/2, p38 și JNK, au fost fosforilate semnificativ în condrocitele primare de șobolan tratate cu IL-1, în timp ce 50 și 100 μM actozide nu au indus în mod semnificativ fosforilarea MAPK în comparație cu control în condrocitul primar de șobolan. Cu toate acestea, 50 și 100 μM de actozidă au suprimat în funcție de doză fosforilarea MAPK indusă de IL-1 -în condrocitele primare de șobolan. În plus, fosforilarea NFkB în condrocitele primare de șobolan tratate cu 10ng/mL IL-1 a fost redusă treptat de către actozidă într-o manieră dependentă de doză. Aceste date indică faptul că căile de semnalizare celulară MAPK și NFκB sunt strâns implicate cu efectele anticatabolice induse de actozide împotriva IL{26}} în condrocitele primare de șobolan.

3.6. Acteozidul suprimă translocarea NFκB de la citosol la nucleu prin suprimarea fosforilării NFκB induse de IL-1 -în condrocitele primare de șobolan. Pentru a investiga dacă actozidul suprimă translocarea NFkB din citosol în nucleu, condrocitele primare de șobolan au fost tratate cu 50 și 100 ug/mL actozidă în prezența sau absența a 10ng/mL IL-1. După cum se arată în Figura 8(a), NFkB a fost translocat în mod semnificativ în nucleul din citosolul condrocitelor primare de șobolan tratate cu 10ng/mL IL-1. Cu toate acestea, a fost inhibată semnificativ de actozidă într-o manieră dependentă de doză. În plus, deși nivelul NFkB a fost crescut în fracția nucleară extrasă din condrocitele primare de șobolan tratate cu 10ng/mL IL-1, acesta a fost scăzut în funcție de doză de actozidă, așa cum se arată în Figura 8(b). Nivelul NFkB a fost scăzut în fracția citosolică extrasă din condrocitele primare de șobolan tratate cu 10ng/mL IL-1, dar a fost crescut în funcție de doză de actozidă. Luate împreună, aceste date indică în mod constant că efectele anticatabolice induse de actozide împotriva IL-1 sunt implicate în suprimarea translocării de la citosol la nucleu în modularea căii de semnalizare NFκB în condrocitele primare de șobolan.

3.7. Acteozidul atenuează degenerarea progresivă a cartilajului articular la animalele OA ale articulației genunchiului induse de DMM chirurgical. Pentru a elucida efectele anticatabolice induse de acteozide in vivo, animalelor induse de OA generate de DMM chirurgical efectuat pe articulația genunchiului la șoareci BALB/c li s-au administrat oral 5 și 10mg/kg de acteozid soluționat în etanol 5%. la două zile timp de 8 săptămâni. Ulterior, articulațiile genunchiului au fost evaluate histologic folosind safranină-O și colorare verde rapidă, așa cum se arată în Figura 9. Pierderea de proteoglican și lezarea suprafeței cartilajului articular au fost semnificativ crescute în articulația genunchiului disecată de la animalele OA induse de DMM. Cu toate acestea, administrarea orală de actozidă a suprimat pierderea de proteoglican și o leziune mai mică a cartilajului articular în comparație cu vehiculul numai. În plus, scorul de calificare al lui Mankin a crescut semnificativ în grupul de animale OA (n =5, 3± 0:7) doar vehiculul furnizat în comparație cu Naïve (n =5, 0 :67 ± 0:5). Cu toate acestea, administrarea orală a 5 și 10mg/kg actozidă în grupul de animale OA (n =5) a scăzut scorul de evaluare Mankin cu 2±0:7 și 1:67 ± 0:5 , respectiv, în comparație numai cu vehiculul. Luate împreună, aceste date indică faptul că administrarea orală de acteozid atenuează degenerarea progresivă a cartilajului articular în articulațiile sinoviale cu stări catabolice.

cistanche (Acteozid)supliment: anti-oboseala

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2